Abstract
Vi presenterar ett förfarande för att mäta med hög precision zinkisotopkvoter i musorgan. Zink består av fem stabila isotoper (64 Zn, 66 Zn, 67 Zn, 68 Zn och 70 Zn) som är naturligt fraktione mellan musorgan. Vi visar först hur att lösa de olika organen i syfte att befria Zn-atomer; detta steg åstadkommes genom en blandning av HNO3 och H2O 2. Vi renar sedan zinkatomer från alla andra element, framför allt från isobariska störningar (t.ex. Ni), genom anjonbyteskromatografi i en utspädd HBr / HNO3 medium. Dessa två första steg utförs i en ren laboratorium med hög renhet kemikalier. Slutligen är de isotopkvoter mättes genom användning av en fler kollektor induktivt kopplad-plasma mass-spektrometer, i låg upplösning. Proverna injiceras med en spraykammare och isotopfraktionering induceras av mass spektrometer är korrektionted genom att jämföra förhållandet av proverna till förhållandet av en standard (standardgaff teknik). Denna fullständiga typisk procedur ger en isotopförhållande med en 50 ppm (2 sd) reproducerbarhet.
Introduction
Mätningen av hög precision (bättre än 100 ppm / atommassenhet) zink stabil isotopsammansättning har bara varit möjligt för cirka 15 år tack vare utvecklingen av multi-samlare plasma-source mass spektrometrar och har sedan dess mestadels tillämpats i jorden och planet vetenskaper. Ansökningarna till det medicinska området är nya och har en stor potential som biomarkörer för sjukdomar som modifierar metabolismen av zink (t ex Alzheimers sjukdom). Denna uppsats rapporterar ett förfarande för att mäta de naturliga stabila isotopförhållanden av zink i olika musorgan med hög precision. Detsamma skulle gälla för prover från människa. Förfarandet består av upplösning av de organ, den kemiska reningen av zink från resten av atomerna, och därefter analys av den isotopförhållande på en massspektrometer.
Kvaliteten på Zn isotopmätningar är beroende av kvaliteten hos den kemiska rening (renhet av Zn, låg tomma kompared till mängden av Zn är närvarande i provet, hög kemiskt utbyte av förfarandet) och om kontroll av den instrument partiskhet. Behövs Den höga renheten hos den slutliga Zn-fraktion för att avlägsna både isobariska interferenser och icke-isobar interferens som skapar en matriseffekt. Isobariska nuklider skapar direkta störningar (t.ex. 64 Ni). Icke-isobariska störningar generera så kallade "matris" effekt och ändra den analytiska precisionen i mätningarna genom att ändra tillståndet hos jonisering jämfört med ren zink standard som proven jämfört med 1. Ett lågt ämnet (<10 ng) indikerar att det inte finns någon kontaminering av proverna med hjälp av yttre Zn som skulle förspänna den uppmätta isotopsammansättningen. Som Zn isotoper kan fraktioneras under jonbyteskromatografi 2, insamling av alla Zn atomer garanterar att ingen isotopfraktionering uppstår, vilket innebär att den kemiska förfarandet bör ha en full avkastning. Slutligen är korrigeringen av den instrumentisotopfraktionering under masspektrometri mätning görs via "standardgaff" -metoden.
Därför att de största svårigheterna få exakta mätningar styr den externa kontaminering (dvs låg blank), vilket ger en full avkastning kemisk rening som är ren från andra atomer eller molekyler, och korrigera instrumentisotopfraktionering på mass spektrometer. I denna uppsats kommer vi att beskriva vår analytiska protokoll för att separera Zn från musorgan samt mätningarna masspektrometri.
Extraktionen utförs med användning av en låg mängd av utspädda syror (HBr / HNO3 medium) på mikro-kolonner (0,5 | il och 0,1 | il) av anjonbytarharts. Den har en full avkastning och mätningarna har en extern reproducerbarhet bättre än 50 ppm på 66 Zn / 64 Zn-förhållande. En annan fördel med method är att det är mycket snabbt. Förfarandet är därför mycket väl anpassad till medicinsk vetenskap, i vilken man måste analysera ett stort antal prov jämfört med geovetenskap, där dessa analytiska metoder utvecklades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: som deltar i djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Université Paris Diderot.
1. Beredning av material
- Under koka destillera 1 L av syrorna (HNO3, HBr), i syfte att rena dem från förorening.
- Rengör bägare och spetsadapter i en varm (~ 100 ° C) koncentrerad HNO3 syrabad under minst två dagar.
- Tvätta pipettspetsarna i en kall 3 N HNO3 bad i flera dagar och skölj individuellt tre gånger med avjoniserat vatten.
2. Provberedning
- Söva möss genom intraperitoneal injektion av ketamin och xylazin. Bedöm anestesi genom tån nypa metoden.
- Samla upp blod från en hjärtpunktion i närvaro av heparin i 1,5 ml rör.
- Separera plasma från blodceller genom centrifugering (10 min, 1500 xg) och överföra plasma polypropen cryogenic flaskor med hjälp av polypropylen tips.
- Ta bort den kvarvarande blod från organ genom att skära lever venen och injicera DPBS genom hjärtat. Utvärdera död musen genom halsdislokation.
- Skörda organ med sterila instrument av rostfritt stål, befria dem från omgivande fett förekommande fall, och snap-frysa dem i polypropylen kryogeniska flaskor.
3. Kemisk Rening
- Först upplösa proverna i en blandning av ~ 1 ml koncentrerad (30%) H 2 O 2 och ~ 1 ml koncentrerad (~ 15 M) HNO3. Har alla dessa steg inuti ett dragskåp.
- Placera hela organ av intresse in i en 15 ml teflonbägare. Lägg sedan till H2O 2 / HNO3 till bägare 5. Håll bägaren öppen för ett par minuter för att undvika stänk på grund av reaktionen av oxidation av det organiska materialet och frisläppandet av CO2.
- Slutligen satte bägaren på en värmeplatta vid aboUT 100 ° C under ett par timmar eller tills lösningen är helt klart.
- Öppna bägaren och torka lösningen på en varm platta vid cirka 100 ° C.
- När provet är torr, tillsätt 1 ml 1,5 N HBr till proven; stänga bägare och låt det lösas upp på en värmeplatta vid 100 ° C under ett par timmar.
- Samtidigt förbereda 500 il kolumner.
- Tillsätt 500 l av AG1X8 200-400 mesh harts i kolonnen och placera den på kolonnen rack med en papperskorg bägare under den. Tvätta hartset genom alternerande: 5 ml 18,2 Mohm ⋅ cm vatten, 5 ml 0,5 N HNO3, 5 ml vatten, 5 ml 0,5 N HNO3, och därefter 5 ml vatten. Konditionera hartset med 5 ml av 1,5 N HBr.
- Ta bägarna från den varma plattan och lägg dem i ett ultraljudsbad under ca 30 minuter, och sedan låta bägarna svalna till RT.
- När bägaren kyles och hartset tvättas, öppna bägaren. Sätt spetsadapter till tHan spruta, lägga till en pipett spets; pipettera de 1 ml prov och ladda den på hartset (mycket långsamt för att inte agitera hartset).
- När all vätska passerar genom kolonnen, tillsätt 5 ml 1,5 N HBr.
- När 5 ml 1,5 N HBr passera genom kolonnen, ersätta papperskorgen bägaren med en ren 15 ml bägare.
- Tillsätt 5 ml 0,5 N HNO3 2,5 ml i taget. I detta skede Zn elueras från hartset.
- När 5 ml HNO3 passerar genom kolonnen, avlägsna bägaren och placera den på en varm platta vid 100 ° C tills torkat.
- Ta bort kolumnen från kolonnen hållaren; trash hartset (använda en ny harts för varje prov).
- När provet är torrt, upprepa protokollet med samma volym av syror på en mindre kolonn (100 | il) och placera det på en värmeplatta tills torkades. Provet är nu färdigt för masspektrometri.
4. Mass-spektrometri Mätning
- Analysera Zn isotop composättning på en multi kollektor-induktivt kopplad plasma-masspektrometer (MC-ICP-MS).
- Använd maskinparametrar som sammanfattas i tabell 1.
- Positionera Faraday kopparna att samla på massan (m / z) av 62 Ni, 63 Cu, 64 Zn, 65 Cu, 66 Zn, 67 Zn och 68 Zn.
- Bered en lösning innehållande 500 ppb Zn i 0,1 M HNO3 för isotopanalys.
- Analysera 500 ppb lösning av Zn med hjälp av en spraykammare kombinerat med en 100 ul / min teflon nebulisator. För varje prov, mäta 30 skanningar (1 block av 30 cykler) där integrationstiden för varje skanning är 8,389 sek.
- Rätta bakgrunden genom att subtrahera på topp noll intensiteter från en blindlösning (0,1 M HNO3 lösning som används för att åter upplösa proven).
- Kontroll och korrekt möjliga 64 Ni isobarisk störningar genom att mäta intensiteten hos 62 Ni topp.Antag att 64 Ni / 62 Ni förhållandet är naturligt (0,2548), korrekt detta värde från instrumentella mass bias, och sedan ta bort 64 Ni på massan 64 som:
64 Zn verklig = 64 Zn mätt - 64 Ni = 64 Zn mätt - (64 Ni / 62 Ni) naturliga x 62 Ni mäts. - Korrigera instrumentella mass partiskhet genom gaff varje prov med en 500 ppb standardlösning av JMC Lyon Zn standard (eller annan tillgänglig standard som IRMM-3702). Utför standardgaff genom att dividera 66 Zn / 64 Zn-förhållande av provet genom genomsnittet av 66 Zn / 64 Zn-förhållandet mellan de två standarderna uppmätt före och efter det att provet minus ett, och multipliceras med 1000 (se ekvation 1). Typisk extern precision på JMC Lyon Zn standard är 0,05 permil / amu (2 standardavvikelse, 2 sd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 1,5 N HBr, de viktigaste zink arter (ZnBr3-) bildar mycket starka komplex med anjonbytarhartset, medan de flesta andra delar inte interagera med harts. Zink återvinns sedan genom att ändra mediet till utspädd HNO3, ändra specieringen Zn att Zn2 + som frigöres från hartset 6,7.
Isotopkvoter är typiskt uttryckt som delar per 1.000 avvikelser i förhållande till en standard:
med x = 66 eller 68. Referensmaterialet som används är Zn "Lyon" standard JMC 3-0749 L 1. Den "Lyon" standard är det mest allmänt används referensmaterial för att normalisera Zn isotopdata. Samtliga isotop resultat som rapporteras är därför relativ. Genom att använda denna referens isotopsammansättningen av jorden feller δ 66 Zn är 0,28 ± 0,05 8. Eftersom JMC-Lyon-standarden är inte lätt tillgängliga, i avsaknad av denna standard alternativ är att använda standard IRMM-3702 som en referens under mätningarna och omvandla resultaten med hänvisning 9 som: 66 Zn JMC-Lyon = 66 Zn IRMM-3702 0,29. Den typiska ämnet är <10 ng.
Typiska resultat erhållna med denna metod är representerade i Figur 1, som en tre-isotop plot (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) för olika musorgan. Tabell 2 och 3 rapportera resultat av replikerade experiment i ett typiskt markbundet vagga (en Hawaiian basalt) och från mus röda blodkroppar.
Figur 1. δ 68 Zn vs δ 66 Znför olika musorgan. Den typiska felstapel är 0,07 permil för δ 66 Zn och 0,15 för δ 68 Zn visas på figuren. Data från referens 15.
| MC-ICP-MS inställningar | Neptune |
| RF-effekt (W) | 1300 |
| Accelerationspotential (V) | 10.000 |
| Gasflödeshastigheter | |
| Ar kylvätska (l / min) | 18 |
| Ar extra (l / min) | 1 |
| Ar prov (l / min) | 1-1,2 |
| Lösning upptagningshastigheten (molution | 100 |
| Analysparametrar | |
| Antal block | 1 |
| Antal mätningar per block | 30 |
| Integration (s) | 8,389 |
| Typiska Zn koncentrationen i prover och standard (ppb) | 500 |
| Typisk överföringseffektiviteten V / ppm | 25 |
Tabell 1: MC-ICP-MS inställningar för Zn isotopmätningar vid Institut de Physique du Globe de Paris.
| Prover | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n en |
| replikera en | 0,34 | 0,01 | 0,68 | 0,04 | 4 |
| replikera 2 | 0,34 | 0,01 | 0.68 | 0,01 | 3 |
| replikera 3 | 0,34 | 0,02 | 0,67 | 0,02 | 4 |
| replikera 4 | 0,36 | 0,06 | 0,7 | 0,09 | 4 |
| replikera 5 | 0,31 | 0,02 | 0,65 | 0,06 | 4 |
| replikera 6 | 0,33 | 0,01 | 0,68 | 0,02 | 3 |
| replikera 7 | 0,32 | 0,06 | 0,63 | 0,1 | 6 |
| Genomsnitt | 0,33 | 0,03 | 0,67 | 0,05 | 7 |
| 2SD | 0,04 | 0,05 | |||
| n = antal upprepade mätningar av MC-ICP-MS |
Tabell 2: Zn isotopsammansättning av Hawaii basalt K179-1R1-170.9 Varje replikat representerar en fullständig kemisk rening och medelvärdet av flera oberoende mätningar massspektrometer.. Data från referens 8.
| Mus Nummer | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0,82 | 1,6 |
| 12 | 0,79 | 1,55 |
| 13 | 0,84 | 1,65 |
| 14 | 0,87 | 1,72 |
| Genomsnitt | 0,83 | 1,63 |
| 2SD | 0,07 | 0,15 |
Tabell 3: Zn isotopsammansättning av ben hos möss Varje kopia representerar en fullständig kemisk rening.. Data från referens 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reproducerbarhet mätningarna utvärderas genom replikerade analyser av samma prov som utförts under olika analystillfällen. Till exempel 6, har vi replik samma mark vagga 7 gånger och vi erhölls de resultat som rapporteras i tabell 2.
Som väntat från teorin om isotopfraktionering 10 och mätt i något solsystem material hittills (t.ex. meteorit 11-13, växter 3-5, djuphavssediment 14, djur 15-17), resultaten följer en mass beroende lag (se figur 1). δ 68 Zn är ungefär dubbelt δ 66 Zn (Figur 1), eftersom mass skillnaden mellan 68 Zn och 64 Zn är dubbelt skillnaden mellan 66 Zn och 64 Zn. Detta visar att våra mätningar är fria från isobariska störningar (som skulle köra ut dataav linjärt) och att zink isotoper fraktioneras ur samma isotop poolen.
För musen organ, har den begränsade mängden Zn i varje organ hindrat oss från att utföra många upprepningar av ett enda organ 15. Men kan vi uppskatta en högre gräns för reproducerbarhet genom att jämföra uppgifter för samma vävnad för olika möss i samma ålder och samma stam (t.ex. för ben 16 veckor gamla möss, tabell 3). Denna reproducerbarhet är större (0,04 vs 0,07 för δ 66 Zn) än vad som uppskattades från basaltklippor, vilket inte är förvånande eftersom det innehåller heterogenitet proverna samt isotop variationen mellan de olika möss. Det är därför en överskattning av reproducerbarhet, och vi tror att precisionen på varje enskilt organ skulle likna vad vi hade bestämts på basaltklippor. Vi kan säkert ta reproducerbarhet bättre än 0,10 för ^8, 66 Zn (2 sd) som representerar en precision 10 gånger större än variationen rapporterade mellan vissa organ (se figur 1 och referens 15).
Mätning av stabila isotopsammansättning av Zn kommer att användas i framtiden som ett diagnostiskt verktyg för sjukdomar som modifierar Zn balansen i kroppen. Exempelvis kan de zinkrika plack i samband med Alzheimers sjukdom ändra koncentrationen av zink i serum och eftersom hjärnan och serumet har olika isotopsammansättning 15 Zn isotoper kan användas för att detektera tidigt stadium av sjukdomen.
De flesta alternativa metoder för att mäta Zn isotopsammansättningen av MC-ICP-MS innebär kemisk rening i koncentrerad HCI media på större kolumner än den som används här 1-4. Vår metod bygger på mikro kolumner och utspädda syror har låga ämnen och producerar uppgifter som är två gånger mer exakt (50 ppm vs 100 ppm 2 sd). I additjon, är vår metod mycket snabbt (på grund av den begränsade storleken på kolumnerna och den lilla mängden syra som används) och är mycket väl lämpad för att analysera stora mängder av prover (som vanligtvis behövs i kliniska studier). Enkelheten i förfarandet skulle vara väl lämpad för att användas i ett automatiskt kemiskt reningssystem som skulle tillåta mätningarna av ett stort antal prover.
En begränsning med denna metod är att endast stora bulkprover kan analyseras (den procedur använder ~ 1 | j, g av Zn). Genom att minska storleken av proverna är avgörande när man hanterar dyrbara kliniska prover. Denna metod är också begränsad till bulk mätningar, medan det för vissa tillämpningar inom situ analyser kan behövas. Framtida förbättringar på tekniken ska vara i relation till att förbättra in situ isotopmätningar genom att kombinera en laser ablation systemet med plasmamassspektrometer (LA-MC-ICP-MS). Detta skulle göra det möjligt för mätningar av rums små prover utan plägsen kemisk rening (som tenderar att förorena proven). Dessutom, in situ mätningar kommer att möjliggöra mätning av Zn-isotopsammansättningen på levande vävnader. Såvitt vi vet finns det bara har varit ett försök att mäta zink isotopkvoter med hjälp av en sådan teknik 18 och metoden är fortfarande inte tillräckligt exakt har dock mätningar av hög precision isotopförhållandet av LA-MC-ICP-MS gjorts för Fe 19 och B 20 och raffinering av tekniken med hjälp av moderna lasrar kan leda till ett stort genombrott.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
FM erkänner finansiering från ANR genom en chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, den INSU genom en PNP bidrag, Institut Universitaire de France samt Labex UniverEarth programmet vid Sorbonne i Paris Cité (ANR-10-LABX-0023 och ANR -11-IDEX-0005-02). Vi tackar också finansiering från Europeiska forskningsrådet inom ramen för Europeiska gemenskapens H2020 ramprogram / ERC bidragsavtal # 637.503 (Pristine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
- Marechal, C. N., Telouk, P., Albarede, F. Precise analysis of copper and zinc isotopic compositions by plasma-source mass spectrometry. Chemical Geology. 156 (1), 251-273 (1999).
- Marechal, C. N., Albarede, F. Ion-exchange fractionation of copper and zinc isotopes. Geochim. Cosmochim. Acta. 66 (9), 1499-1509 (2001).
- Weiss, D. J., Mason, T. F. D., Zhao, F. J., Kirk, G. J. D., Coles, B. J. Isotopic discrimination of zinc in higher plants. New Phytologist. 165 (3), 703-710 (2005).
- Jouvin, D., Louvat, P., N, M. F. C. Zinc isotopic fractionation: why organic matters. Environ Sci Technol. 43 (15), 5747-5754 (2009).
- Moynier, F., et al. Isotopic fractionation and transport mechanisms of Zn in plants. Chemical Geology. 267 (3-4), 125-130 (2009).
- Moynier, F., Herzog, G., Albarede, F. Isotopic composition of zinc, copper, and iron in lunar samples. Geochim. Cosmochim. Acta. 70 (24), 6103-6117 (2006).
- Moynier, F., et al.
- Chen, H., Savage, P., Teng, F. Z., Helz, R., Moynier, F. Zinc isotope fractionation during magmatic differentiation and the isotopic composition of the bulk Earth. Earth Planet. Sci. Lett. 369-370, 34-42 (2013).
- Moeller, K., et al. Calibration of the new certified materials ERM-AE633 and ERM-AE6447 for copper and IRMM 3702 for zinc isotope amount ratio determination. Geostd. Geoan. Res. 36 (2), 177-199 (2012).
- Bigeleisen, J., Mayer, M. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J. Chem. Phys. 15, 261-267 (1947).
- Luck, J. M., Ben Othman, D., Albarede, F. Zn and Cu isotopic variations in chondrites and iron meteorites: Early solar nebula reservoirs and parent-body processes. Geochim. Cosmochim. Acta. 69 (22), 5351-5363 (2005).
- Moynier, F., Dauphas, N., Podosek, F. A Search for 70Zn Anomalies in Meteorites. Astrophys. J. 700 (2), L92-L95 (2009).
- Paniello, R., Day, J., Moynier, F. Zn isotope evidence for the origin of the Moon. Nature. 490 (7420), 376-380 (2012).
- Pichat, S., Douchet, C., Albarede, F. Zinc isotope variations in deep-sea carbonates from the eastern equatorial Pacific over the last 175 ka. Earth and Planetary Science Letters. 210 (1-2), 167-178 (2003).
- Moynier, F., Fujii, T., Shaw, A., Le Borgne, M. Heterogeneous of natural Zn isotopes in mice. Metallomics. 5 (6), 693-699 (2013).
- Balter, V., et al. Bodily variability of zinc natural isotope abundance in sheep. Rapid Com. Mass. Spec. 24, 605-612 (2010).
- Balter, V., et al. Contrasting Cu, Fe, and Zn isotopic patterns in organs and body fluids of mice and sheep, with emphasis on cellular fractionation. Metallomics. 5 (11), 1470-1482 (2010).
- Urgast, D. S., et al. Zinc isotope ratio imaging of rat brain thin sections from stable isotope tracer by LA-MC-ICP-MS. Metallomics. 4, 1057-1063 (2012).
- Marin-Carbonne, J., Rollion-Bard, C., Luais, B. In-situ measurements of iron isotopes by SIMS: MC-ICP-MS intercalibration and application to a magnetite crystal from the Gunflint chert. Chem. Geol. 285 (1-4), 50-61 (2011).
- Fietzke, J., et al. Boron isotope ratio determination in carbonates via LA-MC-ICP-MS using soda-lime glass standards as reference material. J. Anal. Atom. Spec. 25, 1953-1957 (2010).
