Abstract
Vi presentiamo una procedura per misurare con elevata precisione i rapporti isotopici di zinco negli organi di topo. Lo zinco è composto da 5 isotopi stabili (64 Zn, Zn 66, 67, 68 Zn Zn e 70 Zn) che sono naturalmente frazionati tra gli organi del mouse. Per prima cosa mostriamo come sciogliere i diversi organi, al fine di liberare gli atomi Zn; questo passaggio è realizzato da una miscela di HNO 3 e H 2 O 2. Abbiamo poi purificare gli atomi di zinco da tutti gli altri elementi, in particolare da interferenze isobariche (ad esempio, Ni), mediante cromatografia a scambio anionico in un diluita HBr / HNO 3 medio. Questi primi due passaggi vengono eseguiti in un laboratorio pulito utilizzo di prodotti chimici di elevata purezza. Infine, i rapporti isotopici sono misurati utilizzando un multi-collettore accoppiato induttivamente-plasma spettrometro di massa, in bassa risoluzione. I campioni sono iniettati usando una camera di nebulizzazione e frazionamento isotopico indotto dalla spettrometro di massa è correcta confrontando il rapporto dei campioni al rapporto di uno standard (tecnica bracketing standard). Questo procedimento tipico completo produce un rapporto isotopico con un 50 ppm (2 sd) riproducibilità.
Introduction
La misura di alta precisione (migliore di 100 ppm / unità di massa atomica) zinco composizione isotopica stabile è stato possibile solo per circa 15 anni grazie allo sviluppo di multi-collettore plasma-source spettrometri di massa e da allora è stato in gran parte applicata in Terra e delle scienze planetarie. Le applicazioni al campo medico sono nuovi e hanno un forte potenziale come biomarcatori per le malattie che modificano il metabolismo di zinco (ad esempio, il morbo di Alzheimer). Questo lavoro riporta un metodo per misurare con elevata precisione i naturali rapporti dell'isotopo stabili di zinco in vari organi di topo. Lo stesso sarebbe applicabile a campioni umani. Il metodo consiste nella dissoluzione degli organi, la depurazione chimica dello zinco dal resto degli atomi, e quindi l'analisi del rapporto isotopico su un spettrometro di massa.
La qualità delle misure isotopiche Zn dipende dalla qualità della depurazione chimica (purezza di Zn, bassa comp vuotoared alla quantità di Zn presente nel campione, alta resa chimica della procedura) e sul controllo della polarizzazione strumentale. È necessaria la elevata purezza della frazione Zn finale per rimuovere sia le interferenze isobariche e le interferenze non isobarico che creano un effetto matrice. Nuclidi isobariche creano interferenze dirette (ad esempio, 64 Ni). Interferenze non isobariche generare il cosiddetto effetto "matrice" alterano la precisione analitica delle misurazioni cambiando la condizione di ionizzazione rispetto allo standard di zinco puro a cui sono confrontate a 1. Un basso vuoto (<10 ng) indica che non vi è alcuna contaminazione dei campioni da Zn esterno che sarebbe influenzare la composizione isotopica misurata. Come isotopi Zn possono essere frazionati durante cromatografia a scambio ionico 2, l'insieme di tutti gli atomi di Zn assicura che non si verifica alcun frazionamento isotopico, che implica che il procedimento chimico dovrebbe avere un rendimento completo. Infine, la correzione del frazionamento isotopico strumentale durante la misurazione spettrometria di massa è fatto tramite il metodo "staffaggio standard".
Pertanto, le principali difficoltà per ottenere misure precise controllano la contaminazione esterna (cioè basso vuoto), producendo una piena resa depurazione chimica che è pulito di altri atomi o molecole, e correggendo il frazionamento isotopico strumentale sul spettrometro di massa. In questo articolo descriveremo il nostro protocollo analitico per separare Zn dagli organi di topo e le misure di spettrometria di massa.
L'estrazione viene fatto utilizzando una bassa quantità di acidi diluiti (HBr / HNO 3 media) su micro-colonne (0,5 microlitri e 0,1 microlitri) di resina a scambio anionico. Ha una resa completa e le misurazioni hanno una riproducibilità esterna superiore a 50 ppm dal rapporto 66 Zn / Zn 64. Un altro vantaggio del method è che è molto veloce. Il metodo è quindi molto ben adattato alle scienze mediche, in cui si ha la necessità di analizzare un gran numero di campioni rispetto al geosciences, dove sono stati sviluppati questi metodi analitici.
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Protocol
NOTA: Le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso l'Université Paris Diderot.
1. Preparazione dei materiali
- Sub-ebollizione distillare 1 L degli acidi (HNO 3, HBr) per purificarli da impurità.
- Pulire i bicchieri e l'adattatore punta in un caldo (~ 100 ° C) concentrati HNO 3 bagno di acido per almeno due giorni.
- Lavare i puntali delle pipette in una fredda 3 N HNO 3 bagno per diversi giorni e risciacquare singolarmente per tre volte con acqua deionizzata.
Preparazione 2. campione
- Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Valutare l'anestesia con il metodo pizzico piedi.
- Raccogliere il sangue da una puntura cardiaca in presenza di eparina in provette da 1,5 ml.
- Separare il plasma dalle cellule ematiche mediante centrifugazione (10 min, 1.500 xg) e trasferire il plasma al polipropilene cfiale ryogenic con punte di polipropilene.
- Rimuovere il sangue rimanente dagli organi tagliando la vena epatica e l'iniezione DPBS attraverso il cuore. Valutare la morte del mouse per dislocazione cervicale.
- Raccogliere le organi con strumenti sterili in acciaio inox, liberarli di circondare grasso, se del caso, e scatto-congelare in polipropilene fiale criogeniche.
3. Chemical Purificazione
- Innanzitutto, sciogliere i campioni in un mix di ~ 1 ml di concentrato (30%) H 2 O 2 e ~ 1 ml di concentrato (~ 15 M) HNO 3. Fare tutti questi passaggi all'interno di una cappa aspirante.
- Inserire l'intero organo di interesse in un becher da 15 ml Teflon. Quindi, aggiungere l'H 2 O 2 / HNO 3 nel becher 5. Mantenere la coppa aperta per pochi minuti per evitare spruzzi dovuti alla reazione di ossidazione della sostanza organica e il rilascio di CO 2.
- Infine, mettere il bicchiere su un piatto caldo a about 100 ° C per un paio d'ore o fino a quando la soluzione è perfettamente chiaro.
- Aprire il becher e asciugare la soluzione su una piastra calda a circa 100 ° C.
- Una volta che il campione è asciutto, aggiungere 1 ml di 1,5 N HBr ai campioni; chiudere il bicchiere e farlo sciogliere su una piastra calda a 100 ° C per due ore.
- Nel frattempo preparare le 500 colonne microlitri.
- Aggiungere 500 ml di resina maglia AG1X8 200-400 alla colonna e metterlo sulla cremagliera colonna con un bicchiere rifiuti sotto. Lavare la resina alternando: 5 ml di 18,2 MW ⋅ cm di acqua, 5 ml di 0,5 N HNO 3, 5 ml di acqua, 5 ml di 0,5 N HNO 3, e poi 5 ml di acqua. Condizionare la resina con 5 ml di 1,5 N HBr.
- Togliere i bicchieri dal piatto caldo e metterli in un bagno ad ultrasuoni per circa 30 minuti, e poi lasciare che i bicchieri raffreddare a temperatura ambiente.
- Una volta che il bicchiere viene raffreddata e si lava la resina, aprire il becher. Mettere l'adattatore punta a tegli siringa, aggiungere una punta della pipetta; pipettare i 1 ml di campione e caricarlo sulla resina (molto lentamente per non agitare la resina).
- Una volta che tutto il liquido passa attraverso la colonna, aggiungere 5 ml di 1,5 N HBr.
- Una volta che i 5 ml di 1,5 N HBr passano attraverso la colonna, sostituire il becher cestino con un bicchiere pulito 15 ml.
- Aggiungere 5 ml di 0,5 N HNO 3 2,5 ml per volta. In questa fase l'Zn viene eluito dalla resina.
- Una volta 5 ml di HNO 3 passa attraverso la colonna, togliere il beaker e posizionarlo su una piastra calda a 100 ° C fino essiccato.
- Rimuovere la colonna dal supporto della colonna; cestinare la resina (utilizzare una nuova resina per ogni campione).
- Una volta che il campione è asciutto, ripetere il protocollo con lo stesso volume di acidi su una colonna più piccola (100 microlitri) e poi posto su una piastra calda fino essiccato. Il campione è ora pronto per spettrometria di massa.
4. spettrometria di massa di misura
- Analizzare il compo isotopica Znsizione su un plasma-spettrometro di massa a più collettore ad accoppiamento induttivo (MC-ICP-MS).
- Utilizzare i parametri macchina riassunti nella tabella 1.
- Posizionare le tazze di Faraday per raccogliere in massa (m / z) di 62 Ni, 63 Cu, Zn 64, 65 Cu, Zn 66, 67 e 68 Zn Zn.
- Preparare una soluzione contenente 500 ppb Zn in 0.1 M HNO 3 per l'analisi isotopica.
- Analizzare la soluzione 500 ppb di Zn utilizzando una camera di nebulizzazione combinato con 100 microlitri / min nebulizzatore teflon. Per ogni campione, misura 30 scansioni (1 blocco di 30 cicli) in cui il tempo di integrazione di ogni scansione è 8,389 sec.
- Correggere il fondo sottraendo i on-picco a zero intensità da una soluzione in bianco (la M HNO soluzione 0,1 3 utilizzati per ri-sciogliere i campioni).
- Controllo e corretta possibile 64 Ni interferenze isobarica misurando l'intensità del picco 62 Ni.Si supponga che il / 62 rapporto Ni 64 Ni è naturale (0,2548), correggere questo valore dal pregiudizio di massa strumentale, e quindi rimuovere il 64 Ni sulla massa 64 come:
64 Zn reale = 64 Zn misurato - 64 Ni = 64 Zn misurato - (64 Ni / 62 Ni) naturale x 62 Ni misurato. - Correggere la distorsione di massa strumentale di bracketing ciascuno dei campioni con una soluzione 500 ppb standard della norma JMC Lione Zn (o un altro standard disponibile come IRMM-3702). Eseguire il bracketing serie dividendo il rapporto 66 Zn / Zn 64 del campione per la media del rapporto 66 Zn / Zn 64 delle due norme misurati prima e dopo il campione meno 1 e moltiplicato per 1.000 (vedere equazione 1). Tipico precisione esterno sullo standard JMC Lione Zn è di 0,05 per mille / amu (2 deviazioni standard, 2 sd).
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Representative Results
In 1.5 N HBr, le principali specie di zinco (ZnBr3-) forma complessi molto forti con la resina scambiatrice di anioni, mentre la maggior parte degli altri elementi non interagiscono con la resina. Lo zinco viene quindi recuperato cambiando medio HNO 3 diluito, cambiando la speciazione di Zn di Zn 2+ che si libera dal 6,7 resina.
Rapporti isotopici sono tipicamente espressi come parti per 1.000 deviazioni relative a uno standard:
con x = 66 o 68. Il materiale di riferimento utilizzato è il Zn "Lione" standard JMC 3-0749 L 1. Lo standard "Lyon" è il materiale più ampiamente usato riferimento per normalizzare i dati isotopici Zn. Tutti i risultati isotopici riportati sono quindi relativo. Usando questo riferimento la composizione isotopica della Terra fo δ 66 Zn è 0.28 ± 0.05 8. Dal momento che lo standard JMC-Lione non è facilmente disponibile, in assenza di questa norma l'alternativa è quella di utilizzare l'IRMM-3702 standard come riferimento durante le misurazioni e convertire i risultati usando riferimento 9 come: 66 Zn JMC-Lione = 66 Zn IRMM-3702 0,29. Il vuoto tipico è <10 ng.
I risultati tipici ottenuti con questo metodo sono rappresentati nella figura 1, come un complotto di tre isotopi (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) per diversi organi del mouse. Tabella 2 e 3 del report dei risultati di esperimenti replicati di una tipica roccia terrestre (un hawaiano basalto) e di topo globuli rossi.
Figura 1. δ 68 Zn vs δ 66 Znper diversi organi del mouse. La barra di errore tipico è 0,07 per mille per δ 66 Zn e 0,15 per δ 68 Zn è mostrato nella figura. I dati di riferimento 15.
| Impostazioni MC-ICP-MS | Nettuno |
| Potenza RF (W) | 1.300 |
| Potenziale di accelerazione (V) | 10.000 |
| Le portate di gas | |
| Ar refrigerante (l / min) | 18 |
| Ar ausiliario (l / min) | 1 |
| Campione Ar (l / min) | 1-1,2 |
| Soluzione velocità di assorbimento (molution | 100 |
| Parametri di analisi | |
| Numero di blocchi | 1 |
| Numero di misurazioni per blocco | 30 |
| Tempo d'integrazione (s) | 8,389 |
| Concentrazione Zn Tipico di campioni e standard (ppb) | 500 |
| Efficienza di trasmissione tipica V / ppm | 25 |
Tabella 1: impostazioni MC-ICP-MS per le misurazioni degli isotopi Zn presso l'Institut de Physique du Globe di Parigi.
| Campioni | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n / a |
| replicare 1 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.04 | 4 |
| replicare 2 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.01 | 3 |
| replicare 3 | 0.34 | 0.02 | 0.67 | 0.02 | 4 |
| replicare 4 | 0.36 | 0.06 | 0.7 | 0.09 | 4 |
| replicare 5 | 0.31 | 0.02 | 0.65 | 0.06 | 4 |
| replicare 6 | 0.33 | 0.01 | 0.68 | 0.02 | 3 |
| replicare 7 | 0.32 | 0.06 | 0.63 | 0.1 | 6 |
| Media | 0.33 | 0.03 | 0.67 | 0.05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0.05 | |||
| a n = numero di misure di ripetizione di MC-ICP-MS |
Tabella 2: Zn composizione isotopica del Hawaii basalto K179-1R1-170.9 ciascun replicato rappresenta una purificazione chimica completa e la media di più misurazioni massa spettrometro indipendenti.. I dati di riferimento 8.
| Numero di Topo | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0.82 | 1.6 |
| 12 | 0.79 | 1.55 |
| 13 | 0.84 | 1.65 |
| 14 | 0.87 | 1.72 |
| Media | 0.83 | 1.63 |
| 2SD | 0.07 | 0.15 |
Tabella 3: Zn composizione isotopica di ossa di topi Ogni replica rappresenta una purificazione chimica completa.. I dati di riferimento 15.
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Discussion
La riproducibilità delle misure viene valutata mediante analisi replicate degli stessi campioni sono effettuati durante diverse sessioni analitiche. Ad esempio 6, abbiamo replicato stessa roccia terrestre 7 volte e abbiamo ottenuto i risultati riportati nella Tabella 2.
Come previsto dalla teoria di frazionamento isotopico 10 e misurata in qualsiasi materiale sistema solare finora (ad esempio, 11-13 meteoriti, piante 3-5, sedimenti di acque profonde 14, animali 15-17), i risultati seguono una di massa legge dipendente (vedere Figura 1). δ 68 Zn è circa due volte δ 66 Zn (figura 1), in quanto la differenza di massa tra 68 e 64 Zn Zn è doppio della differenza tra 66 e 64 Zn Zn. Questo dimostra che le nostre misure siano esenti da interferenze isobariche (che sarebbe guidare i dati fuoridella linea retta), e che gli isotopi di zinco sono frazionata dalla stessa piscina isotopica.
Per organi di topo, la quantità limitata di Zn in ogni organo ci ha impedito di eseguire molte replicati di un singolo organo 15. Tuttavia, si può stimare un limite superiore per la riproducibilità, confrontando i dati per uno stesso tessuto per diversi topi della stessa età e lo stesso ceppo (ad esempio per le ossa del 16 settimane di età topi, Tabella 3). Questo riproducibilità è più grande (0,04 vs 0,07 per il δ 66 Zn) di quello che è stato stimato da rocce basaltiche, che non è sorprendente, perché include l'eterogeneità dei campioni, nonché la variabilità isotopica tra i diversi topi. E 'quindi una sovrastima della riproducibilità, e crediamo che la precisione su ogni singolo organo sarebbe simile a quello che avevamo stabilito sulle rocce basaltiche. Possiamo tranquillamente assumere riproducibilità migliore di 0,10 per il ^8; 66 Zn (2 sd) che rappresenta una precisione 10 volte più grande della variabilità riportata tra alcuni organi (vedi figura 1 e riferimento 15).
Misurare la composizione isotopo stabile di Zn verrà utilizzato in futuro come strumento diagnostico per le malattie che modificano l'equilibrio Zn del corpo. Ad esempio, le placche ricchi di zinco associati con la malattia di Alzheimer modificare la concentrazione di zinco nel siero e dal cervello e il siero hanno differenti composizioni isotopiche 15 isotopi Zn potrebbe essere utilizzato per rilevare fase precoce della malattia.
La maggior parte dei metodi alternativi per misurare la composizione isotopica Zn da MC-ICP-MS coinvolgere depurazione chimica nei media HCl concentrato su colonne più grandi di quello usato qui 1-4. Il nostro metodo basato sulla micro-colonne e acidi diluiti ha spazi bassi e produce dati che sono due volte più preciso (50 ppm vs 100 ppm 2 sd). In additione, il nostro metodo è molto veloce (a causa delle piccole dimensioni delle colonne e la piccola quantità di acido utilizzato) ed è molto adatto per analizzare grandi quantità di campioni (come di solito necessario in studi clinici). La semplicità del metodo sarebbe adatto ad essere utilizzato in un sistema automatico di depurazione chimica che consentirebbe le misure di un gran numero di campioni.
Un limite di questo approccio è che solo i grandi campioni globali possono essere analizzati (la procedura utilizza ~ 1 mg di Zn). La riduzione delle dimensioni dei campioni è fondamentale quando si tratta di campioni clinici preziosi. Questo metodo è anche limitato a misurazioni di massa, mentre per alcune applicazioni nelle analisi situ può essere necessaria. Miglioramento futuro sulla tecnica dovrebbe essere in relazione con il miglioramento in situ misure isotopiche combinando un sistema laser-ablazione con la massa spettrometro plasma (LA-MC-ICP-MS). Ciò consentirebbe misurazioni dei spazialmente piccoli campioni senza ppurificazione rior chimica (che tende a contaminare i campioni). Inoltre, in situ misurazioni consentiranno la misurazione della composizione isotopica Zn sui tessuti viventi. A nostra conoscenza non vi è stato solo un tentativo di misurare i rapporti isotopici di zinco che utilizzano tale tecnica 18 e il metodo non è ancora abbastanza preciso, tuttavia, le misurazioni di alta precisione rapporto isotopico di LA-MC-ICP-MS è stato fatto per Fe 19 e B 20 e raffinazione della tecnica che utilizza il laser moderni può portare ad un importante passo avanti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
FM riconosce finanziamenti dal ANR attraverso una poltrona d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, il INSU attraverso una sovvenzione PNP, l'Institut Universitaire de France, così come il programma LABEX UniverEarth alla Sorbona di Parigi Cité (ANR-10-LabX-0023 e ANR -11-IDEX-0005-02). Ringraziamo anche il finanziamento da parte del Consiglio europeo della ricerca nell'ambito della Comunità europea H2020 programma quadro / ERC convenzione di sovvenzione # 637503 (Pristine).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
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