Abstract
Se presenta un procedimiento para medir con alta precisión las proporciones de isótopos de zinc en órganos de ratón. Zinc se compone de 5 isótopos estables (64 Zn, Zn 66, 67, 68 Zn Zn y Zn) 70 que se fraccionan naturalmente entre los órganos de ratón. En primer lugar, mostramos cómo disolver los diferentes órganos con el fin de liberar a los átomos de Zn; este paso se realiza por una mezcla de HNO 3 y H 2 O 2. A continuación, purificamos los átomos de zinc de todos los otros elementos, en particular de interferencias isobáricas (por ejemplo, Ni), por cromatografía de intercambio aniónico en un / HNO 3 HBr medio diluido. Estos dos primeros pasos se realizan en un laboratorio limpio utilizando productos químicos de alta pureza. Por último, las proporciones de isótopos se miden usando un multi-colector-plasma de acoplamiento inductivo-espectrómetro de masas, en baja resolución. Las muestras se inyectaron usando una cámara de pulverización y el fraccionamiento isotópico inducido por el espectrómetro de masas es corrected mediante la comparación de la relación de las muestras a la relación de un estándar (técnica de horquillado estándar). Este procedimiento típico completo produce una relación isotópica con un 50 ppm (2 sd) reproducibilidad.
Introduction
La medición de alta precisión (mejor que 100 ppm / unidad de masa atómica) de zinc composición de isótopos estables sólo ha sido posible por cerca de 15 años gracias al desarrollo de varios colectores de plasma de código espectrómetros de masa y desde entonces ha sido aplicado en su mayoría en la Tierra y las ciencias planetarias. Las aplicaciones en el campo médico son nuevos y tienen un fuerte potencial como biomarcadores para enfermedades que modifican el metabolismo del zinc (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer). Este trabajo presenta un método para medir con alta precisión las proporciones de isótopos estables naturales de zinc en diversos órganos de ratón. Lo mismo sería aplicable a muestras humanas. El método consiste en la disolución de los órganos, la purificación química de zinc del resto de los átomos, y luego el análisis de la relación isotópica en un espectrómetro de masas.
La calidad de Zn mediciones isotópicas depende de la calidad de la purificación química (pureza de Zn, bajo un borrador en blancoared a la cantidad de Zn presente en la muestra, rendimiento alto química del procedimiento) y en el control del sesgo instrumental. Se necesita la alta pureza de la fracción de Zn final para eliminar ambos interferencias isobáricas e interferencias no isobárica que crean un efecto de la matriz. Nucleidos isobáricas crean interferencias directas (por ejemplo, 64 Ni). Interferencias no isobáricas generan el llamado efecto de "matriz" y alteran la precisión analítica de las mediciones por el cambio de la condición de la ionización en comparación con el estándar de zinc puro a la que las muestras se comparan con 1. Un bajo blanco (<10 ng) indica que no hay contaminación de las muestras por Zn externa que sesgo la composición isotópica medido. Como isótopos de Zn pueden fraccionarse durante la cromatografía de intercambio iónico 2, la colección de todos los átomos de Zn asegura que ningún fraccionamiento isotópico se produce, lo que implica que el procedimiento químico debe tener un rendimiento completo. Por último, la corrección del fraccionamiento isotópico decisivo durante la medición espectrometría de masas se realiza mediante el método de "horquillado estándar".
Por lo tanto, las principales dificultades para obtener mediciones precisas son el control de la contaminación externa (es decir, baja en blanco), la producción de una purificación química pleno rendimiento que está limpio de cualquier otros átomos o moléculas, y corregir el fraccionamiento isotópico instrumental en el espectrómetro de masas. En este artículo vamos a describir nuestro protocolo de análisis para separar Zn de los órganos de ratón, así como las mediciones de espectrometría de masas.
La extracción se realiza usando una baja cantidad de ácidos diluidos (HBr / HNO 3 medios de comunicación) en micro-columnas (0.5 mu l y 0,1 mu l) de resina de intercambio aniónico. Tiene un rendimiento total y las mediciones tienen una reproducibilidad externa mejor que 50 ppm en la relación de 66 Zn / Zn 64. Otra ventaja de la metod es que es muy rápido. El método está por lo tanto muy bien adaptada a las ciencias médicas, en el que uno tiene que analizar un gran número de muestras en comparación con ciencias de la tierra, donde se desarrollaron estos métodos analíticos.
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Protocol
NOTA: Los procedimientos con animales han sido aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) en la Université Paris Diderot.
1. Preparación de los materiales
- Sub-ebullición destilar 1 L de los ácidos (HNO 3, HBr) con el fin de purificarlos de la impureza.
- Limpie los vasos y adaptador de punta en un caliente (~ 100 ° C) concentra HNO 3 baño ácido durante al menos dos días.
- Lavar las puntas de pipeta en un resfriado 3 N HNO 3 baño durante varios días y enjuagar individualmente tres veces con agua desionizada.
Preparación 2. Muestra
- Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina. Evaluar la anestesia por el método pizca dedo del pie.
- Recoger la sangre por una punción cardiaca en presencia de heparina en tubos de 1,5 ml.
- Separar el plasma de los glóbulos por centrifugación (10 min, 1500 xg) y transferir el plasma a polipropileno cviales ryogenic utilizando puntas de polipropileno.
- Retire la sangre restante a partir de órganos por el corte de la vena hepática y la inyección de DPBS a través del corazón. Evaluar la muerte del ratón por dislocación cervical.
- Cosecha de los órganos con instrumentos de acero inoxidable estériles, liberarlos de la grasa que rodea su caso, y SNAP-congelarlos en polipropileno viales criogénicos.
3. Química Purificación
- En primer lugar, disolver las muestras en una mezcla de ~ 1 ml de concentrado (30%) H 2 O 2 y ~ 1 ml de concentrado (~ 15 M) HNO 3. ¿Todos estos pasos dentro de una campana de humos.
- Colocar todo el órgano de interés en un vaso de precipitados de teflón 15 ml. A continuación, añadir el H 2 O 2 / HNO 3 al vaso 5. Mantenga el vaso de precipitados abierto durante unos minutos con el fin de evitar salpicaduras debido a la reacción de oxidación de la materia orgánica y la liberación de CO 2.
- Por último, poner el vaso de precipitados sobre una placa caliente a about 100 ° C durante un par de horas o hasta que la solución es perfectamente claro.
- Abrir el vaso de precipitados y secar la solución sobre una placa caliente a aproximadamente 100 ° C.
- Una vez que la muestra está seca, añadir 1 ml de 1,5 N HBr a las muestras; cerrar el vaso y deje que se disuelva en una placa caliente a 100 ° C durante un par de horas.
- Mientras tanto preparar las 500 columnas mu l.
- Añadir 500 l de la resina de malla AG1X8 200-400 a la columna y lo puso en el estante de la columna con un vaso de la basura debajo de ella. Lavar la resina alternando: 5 ml de 18,2 mO ⋅ cm de agua, 5 ml de 0,5 N HNO 3, 5 ml de agua, 5 ml de 0,5 N HNO 3, y luego 5 ml de agua. Acondicionar la resina con 5 ml de 1,5 N HBr.
- Retire los vasos de la placa caliente y los puso en un baño de ultrasonidos durante aproximadamente 30 minutos, y luego dejar que los vasos se enfríen a temperatura ambiente.
- Una vez que el vaso de precipitados se enfrió y la resina se lava, abra el vaso de precipitados. Ponga el adaptador de punta a tél jeringa, añadir una punta de pipeta; pipetear los 1 ml de muestra y cargarlo en la resina (muy lentamente a fin de no agitar la resina).
- Una vez que todo el líquido pasa a través de la columna, añadir 5 ml de 1,5 N HBr.
- Una vez que los 5 ml de 1,5 N HBr pasan a través de la columna, reemplazar el vaso de precipitados de basura con un limpio vaso de precipitados de 15 ml.
- Añadir 5 ml de 0,5 N HNO 3 2,5 ml a la vez. En esta etapa el Zn se eluye de la resina.
- Una vez 5 ml de HNO 3 pasa a través de la columna, retire el vaso de precipitados y colocarlo en una placa caliente a 100 ° C hasta que se seca.
- Retire la columna del soporte columna; trash la resina (usar una nueva resina para cada muestra).
- Una vez que la muestra está seca, repetir el protocolo con el mismo volumen de ácidos sobre una columna más pequeña (100 l) y luego se coloca en un plato caliente hasta que se seca. La muestra está ahora listo para espectrometría de masas.
4. Masa-espectrometría de Medición
- Analizar el compo isotópica Znsición en un colector acoplado inductivamente espectrómetro de masas con plasma multi (MC-ICP-MS).
- Utilice los parámetros de la máquina que se resumen en la Tabla 1.
- Coloque las tazas de Faraday para recoger en masa (m / z) de 62 Ni, 63 Cu, Zn 64, 65 Cu, Zn 66, 67 y 68 de Zn Zn.
- Preparar una solución que contiene Zn 500 ppb en 0,1 M HNO 3 para el análisis isotópico.
- Analizar la solución 500 ppb de Zn mediante el uso de una cámara de pulverización combinada con un / nebulizador teflón min 100 l. Para cada muestra, mida 30 exploraciones (1 bloque de 30 ciclos) en la que el tiempo de integración de cada exploración es 8,389 seg.
- Corrija el fondo restando las intensidades de cero en pico de una solución en blanco (la M HNO 3 0,1 solución utilizada para volver a disolver las muestras).
- Control y corregir posibles 64 Ni interferencia isobárica mediante la medición de la intensidad del pico 62 Ni.Suponga que la relación 62 64 Ni / Ni es algo natural (0.2548), corregir el valor del sesgo masa instrumental, y luego retire el 64 Ni en la masa 64 como:
64 Zn reales = 64 Zn medido - 64 Ni = 64 Zn medido - (64 Ni / 62 Ni) naturales x 62 mide Ni. - Corregir el sesgo masa instrumental de horquillado cada una de las muestras con una solución de 500 ppb de la norma JMC Lyon Zn (u otro estándar disponibles, tales como IRMM-3702). Realizar el horquillado estándar dividiendo la relación Zn Zn 66/64 de la muestra por el promedio de la relación Zn Zn 66/64 de los dos estándares medidos antes y después de la muestra menos 1 y multiplicada por 1000 (véase la ecuación 1). Precisión externa típica en el estándar JMC Lyon Zn es 0,05 permil / amu (2 desviación estándar, 2 sd).
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Representative Results
En 1,5 N HBr, las principales especies de zinc (ZnBr3-) forma complejos muy fuertes con la resina de intercambio de aniones, mientras que la mayoría de otros elementos no interactúan con la resina. El zinc se recupera a continuación cambiando el medio a HNO 3 diluido, el cambio de la especiación de Zn a Zn 2+ que se libera de la resina de 6,7.
Las relaciones de isótopos se expresan típicamente como partes por 1000 desviaciones relativas a un estándar:
con x = 66 o 68. El material de referencia utilizado es el Zn "Lyon" estándar JMC 3-0749 L 1. La norma "Lyon" es el material de referencia más ampliamente utilizado para normalizar los datos de isótopos de Zn. Por tanto, todos los resultados isotópicos reportados son relativos. Utilizando esta referencia la composición isotópica de la Tierra fo δ 66 Zn es 0,28 ± 0,05 8. Dado que la norma JMC-Lyon no está fácilmente disponible, en ausencia de esta norma la alternativa es utilizar el IMMR-3702 estándar como referencia durante las mediciones y convertir los resultados utilizando como referencia 9: 66 Zn JMC-Lyon = 66 Zn -IMMR 3702 0.29. El blanco típico es <10 ng.
Los resultados típicos obtenidos con este método se representan en la Figura 1, como una parcela de tres isótopos (δ 68 Zn vs δ 66 Zn) para los diferentes órganos de ratón. Tabla 2 y 3 del informe de resultados de experimentos replicados de una roca terrestre típica (una hawaiana basalto) y de ratón células rojas de la sangre.
Figura 1. δ 68 Zn vs δ 66 Znpara los diferentes órganos de ratón. La barra de error típico es 0,07 permil de δ 66 Zn y 0.15 para δ 68 Zn se muestra en la figura. Los datos de referencia 15.
| Ajustes MC-ICP-MS | Neptuno |
| Potencia de RF (W) | 1300 |
| Potencial de aceleración (V) | 10000 |
| Caudales de gas | |
| Refrigerante Ar (l / min) | 18 |
| Ar auxiliar (l / min) | 1 |
| Muestra Ar (l / min) | 1-1,2 |
| Tasa de absorción de la solución (molution | 100 |
| Parámetros de análisis | |
| Número de bloques | 1 |
| Número de mediciones por bloque | 30 |
| Tiempo (s) Integración | 8,389 |
| Concentración de Zn típica de muestras y estándar (ppb) | 500 |
| Eficiencia de transmisión típica V / ppm | 25 |
Tabla 1: configuración MC-ICP-MS para las mediciones de isótopos de Zn en el Instituto de Física del Globo de París.
| Muestras | δ 66 Zn | 2SE | δ 68 Zn | 2SE | n / A |
| replicar 1 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.04 | 4 |
| replicar 2 | 0.34 | 0.01 | 0.68 | 0.01 | 3 |
| replicar 3 | 0.34 | 0.02 | 0.67 | 0.02 | 4 |
| replicar 4 | 0.36 | 0.06 | 0.7 | 0.09 | 4 |
| replicar 5 | 0.31 | 0.02 | 0.65 | 0.06 | 4 |
| replicar 6 | 0.33 | 0.01 | 0.68 | 0.02 | 3 |
| replicar 7 | 0.32 | 0.06 | 0.63 | 0.1 | 6 |
| Promedio | 0.33 | 0.03 | 0.67 | 0.05 | 7 |
| 2SD | 0.04 | 0.05 | |||
| a n = número de medición repetida por MC-ICP-MS |
Tabla 2: Zn composición isotópica de la K179-1R1-170.9 Hawaii basalto Cada replica representa una purificación químico completo y el promedio de varias mediciones del espectrómetro de masas independientes.. Los datos de referencia 8.
| Número de Ratón | δ 66 Zn | δ 68 Zn |
| 11 | 0.82 | 16 |
| 12 | 0.79 | 1.55 |
| 13 | 0.84 | 1.65 |
| 14 | 0.87 | 1.72 |
| Promedio | 0.83 | 1.63 |
| 2SD | 0.07 | 0.15 |
Tabla 3: Zn composición isotópica de los huesos de ratones Cada replica representa una purificación química completa.. Los datos de referencia 15.
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Discussion
La reproducibilidad de las mediciones se evalúa a través de análisis replicados de las mismas muestras realizadas durante las diferentes sesiones de análisis. Por ejemplo 6, hemos reproducido la misma roca terrestre 7 veces y hemos obtenido los resultados presentados en la Tabla 2.
Como se esperaba de la teoría de fraccionamiento isotópico 10 y como se mide en cualquier material sistema solar hasta el momento (por ejemplo, meteorito 11-13, plantas 3-5, sedimentos de aguas profundas 14, los animales 15-17), los resultados siguen una masa ley dependiente (véase la Figura 1). δ 68 Zn es aproximadamente el doble δ 66 Zn (Figura 1), debido a la diferencia de masa entre 68 y 64 Zn Zn es el doble de la diferencia entre 66 y 64 Zn Zn. Esto demuestra que nuestras medidas están libres de interferencias isobáricas (que sería conducir los datos fuerade la línea recta) y que los isótopos de zinc son fraccionado de la misma agrupación isotópica.
Por órganos de ratón, la limitada cantidad de Zn en cada órgano nos ha impedido realizar muchas repeticiones de un solo órgano 15. Sin embargo, podemos estimar un límite superior para la reproducibilidad mediante la comparación de datos para el mismo tejido de diferentes ratones de la misma edad y la misma cepa (por ejemplo, para los huesos de los viejos ratones 16 semanas, Tabla 3). Esta reproducibilidad es más grande (0,04 vs 0,07 para el δ 66 Zn) de lo que se estimó a partir de rocas basálticas, que no es sorprendente, ya que incluye la heterogeneidad de las muestras, así como la variabilidad isotópica entre los diferentes ratones. Por tanto, es una sobreestimación de la reproducibilidad, y creemos que la precisión en cada órgano individual sería similar a lo que habíamos determinado sobre rocas basálticas. Podemos asumir con seguridad reproducibilidad mejor que 0,10 para el ^8; 66 Zn (2 sd), que representa una precisión 10 veces mayor que la variabilidad entre informado de ciertos órganos (véase la Figura 1 y la referencia 15).
La medición de la composición de isótopos estables de Zn se utilizará en el futuro como una herramienta de diagnóstico para las enfermedades que modifican el equilibrio Zn del cuerpo. Por ejemplo, las placas ricas en zinc asociados con la enfermedad de Alzheimer cambian la concentración de zinc en el suero y ya que el cerebro y el suero tienen diferentes composición isotópica 15 isótopos de Zn podrían ser utilizado para detectar etapa temprana de la enfermedad.
La mayoría de los métodos alternativos para medir la composición isotópica Zn por MC-ICP-MS implicar purificación química en los medios de HCl concentrado en las columnas más grandes que la que se usa aquí 1-4. Nuestro método basado en micro-columnas y ácidos diluidos tiene espacios en blanco de baja y produce datos que son dos veces más preciso (50 ppm vs 100 ppm 2 sd). En Addition, nuestro método es muy rápido (debido al pequeño tamaño de las columnas y la pequeña cantidad de ácido utilizado) y está muy bien adaptado para analizar gran cantidad de muestras (como por lo general es necesario en los estudios clínicos). La simplicidad del método sería muy adecuado para ser utilizado en un sistema de purificación químico automático que permita a las mediciones de un gran número de muestras.
Una limitación de este enfoque es que sólo las grandes muestras a granel pueden ser analizados (el procedimiento utiliza ~ 1 g de Zn). La reducción del tamaño de las muestras es crucial cuando se trata de preciosas muestras clínicas. Este método también se limita a las mediciones a granel, mientras que para algunas aplicaciones en análisis in situ puede ser necesaria. Mejoras futuras en la técnica debe estar en relación con el mejoramiento in situ mediciones isotópicas mediante la combinación de un sistema láser de ablación con el plasma espectrómetro de masas (LA-MC-ICP-MS). Esto permitiría que las mediciones de espacialmente pequeñas muestras sin ppurificación química rior (que tiende a contaminar las muestras). Además, in situ mediciones permitirán la medición de la composición isotópica Zn en los tejidos vivos. Para nuestro conocimiento no sólo ha sido un intento de medir las proporciones de isótopos de zinc utilizando dicha técnica 18 y el método todavía no es lo suficientemente precisa, sin embargo, las mediciones de alta precisión de relación isotópica por LA-MC-ICP-MS se ha hecho para la Fe 19 y B 20 y el refinado de la técnica que utiliza láseres modernos puede conducir a un gran avance.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
FM reconoce el financiamiento de la ANR a través de una chaire d'Excellence IDEX Sorbonne Paris Cité, el INSU través de una subvención PNP, el Instituto Universitario de Francia, así como el programa Labex UniverEarth en la Sorbona de París Cité (ANR-10-LabX-0023 y la ANR -11-IDEX-0005-02). También agradecemos a la financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud de la Comunidad Europea H2020 Programa Marco / ERC acuerdo de subvención # 637503 (prístina).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi-collection inductively-coupled-plasma mass-spectromter | Thermo-Fisher | ||
| Anion-exchange resin AG1 X8 200-400 | Bio-Rad | 140-1443-MSDS | |
| Teflon beakers | Savillex | 200-015-12 | |
| In-house-made teflon colunms made with shrinkable teflon |
References
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