Summary

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

Published: February 21, 2015
doi:

Summary

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Abstract

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Introduction

מחקרי ביטוי גנים של תאי עצב הבדיל במבחנה מתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) על ידינו 1 ואחרים מצביעים על כך שתאי עצב 2,3 hiPSC דומים רקמת מוח עוברית ולא למבוגרים. נכון לעכשיו, מודלים מבוססי hiPSC עשויים להיות מתאימים יותר ללימוד נטייה ל, ולא תכונות מאוחרות של, מחלה נוירולוגית. יש לנו דיווח בעבר כי חלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה נשמרת בתאי סכיזופרניה הנגזר hiPSC העצביים אב (NPCs), מצביע על כך שNPCs עשוי להיות סוג תא שימושי לחקר המסלולים המולקולריים תורם לסכיזופרניה 1 . אנחנו ואחרים דיווחנו הגירה חריגה, סטרס חמצונים מוגברים ומיני חמצן תגובתי, רגישות ללחצים סביבתיים תת-סף ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בסכיזופרניה hiPSC NPCs 1,4-6, כמו גם ירידת ג העצביonnectivity ותפקוד הסינפטי בנוירונים hiPSC סכיזופרניה 5,7-10. אם הגורמים המולקולריים תרמו להגירה חריגה ו / או סטרס חמצונים בסכיזופרניה hiPSC NPCs גם בבסיס הקישוריות העצבית המופחתת בתאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה, NPCs יכול להיות אוכלוסייה עצבית חזקה וreplicative מאוד שבה לחקור את המנגנונים אחראים למחלה. יתר על כן, כי אחד יכול במהירות לייצר מספר רב של תאים ולא צריך לחכות שבועות או חודשים להבשלה עצבית, מבחני מבוססי NPC מתאימים למחקר של קבוצות גדולות יותר של משתתפים והם נוחים יותר להקרנת תפוקה גבוהה. אנו מאמינים כי hiPSC NPCs יכול לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה, כפי שכבר הוכיח בהפרעות מגוונות כמו מחלת סכיזופרניה 1 והנטינגטון 11.

להבדיל מNPCs hiPSCs, עצבי ראשוני בduction מושגת על ידי עיכוב כפול הסמאד (0.1mm LDN193189 ו10mm SB431542) 12. על ידי להכעיס BMP וTGF איתות עם מולקולות קטנות אלה, האנדודרם ומפרט mesoderm חסום, האצת בידול עצבי ומובילים להיווצרות של שושנות עצביות גלויות בתוך השבוע של ציפוי אחד. דפוסים עצביים מתרחש בשלב מוקדם בתהליך הזה, ככל הנראה בתקופת היווצרות שושנה עצבית ומייד לאחר מכן. בהיעדר רמזים אחרים, התאים עצביים האלה פרימיטיביים להניח גורל כמו המוח הקדמי-קדמי 13. מייד לאחר היווצרות שושנה עצבית, ומתמשך לאורך הרחבת NPC, NPCs המוח הקדמי בתרבית עם FGF2 8,14. יש להם פוטנציאל שושלת כפול ויכול להיות מובחן לאוכלוסיות עצביות של 70-80% נוירונים III טובולין-חיוביים וחלבון חומצי (GFAP) האסטרוציטים 20-30% גליה fibrillary -positive (איור 1). רוב הנוירונים hiPSC המוח הקדמי הם VGLUT1 חיובי, ולכן הם ככל הנראה glutamatergic, למרות שכ -30% מתאי העצב הם GAD67-חיובי (GABAergic) 8.

NPCs הוא passaged באופן שיגרתי יותר מעשר פעמים במבחנה, תוך שמירה על פרופילי בידול עקביים, וללא צבירת חריגות קריוטיפ. קבוצות דיווחו NPCs passaging יותר מ -40 פעמים 15, לעומת זאת, אנו מוצאים כי מעבר לעשרה קטעים, NPCs להראות גדל נטייה לבידול astrocyte. NPCs גם לסבול הקפאה-מפשיר מרובה ויכול לעבור לגדול כneurospheres פשוט על ידי culturing בצלחות שאינן חסיד. NPCs הם transduced ביעילות על ידי וקטורים ויראליים, המאפשר הערכה מהירה של התוצאות מולקולריות ותאיות של ההפרעות גנטיות, ובקלות להרחבה להניב מספיק חומר למחקרים ביוכימיים. יתר על כן, מכיוון שוקטורים ויראליים להתיר חזק על ביטוי ו / או מציאה של גנים של מחלות-רלוונטיות, בכל שליטה או neur חולה נגזרתאי אל, אחד יכול להשתמש בפלטפורמה זו על מנת לבחון את ההשפעה של רקע גנטי על המניפולציות הללו. למרות שאינו מתאים להסינפטי או מבחני מבוססי פעילות הדורשים תאים בוגרים, NPCs עשוי להיות חלופה מעשית עבור רבים ניתוחים מולקולריים או ביוכימי פשוטים של תאים עצביים המופקת מחולה.

Protocol

1. hiPSC בידול לתאים עצבי אב לגדול ולהתרחב hiPSCs בתאי גזע עוברי אנושיים תקשורת (הס) (טבלת 1) שיתוף תרבותי על פיברובלסטים עכבר עובריים שכבת מזין עד מושבות גדולות (אבל subconfluent) מוכנות לבידול עצבי באמצעות גוף embryoid (EB) בינ…

Representative Results

ניתן לזהות רוזטות העצבית מורפולוגית, באמצעות מיקרוסקופ brightfield, לפי המראה האופייני שלהם כמקבצים עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס (איור 1). למרות NPCs הם בדרך כלל בתרבית בצפיפות תאים גבוהה מאוד, הבא passaging מייד, מעט סומה בצורת הפירמידה ומבנה neurite דו קוטבי ה?…

Discussion

יש לנו תארנו שיטות שבאמצעותו להבחין hiPSCs לNPCs, סוג תא עצבי שבחלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC נשמרת ושעשויה לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה 8, 11. בנוסף, כפי שפורטנו, NPCs הוא אוכלוסייה עצבית וחסונה replicative וtransduced בקלות, שא?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) Life Technologies  #21985-023
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington’s Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Play Video

Cite This Article
Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

View Video