This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
מחקרי ביטוי גנים של תאי עצב הבדיל במבחנה מתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) על ידינו 1 ואחרים מצביעים על כך שתאי עצב 2,3 hiPSC דומים רקמת מוח עוברית ולא למבוגרים. נכון לעכשיו, מודלים מבוססי hiPSC עשויים להיות מתאימים יותר ללימוד נטייה ל, ולא תכונות מאוחרות של, מחלה נוירולוגית. יש לנו דיווח בעבר כי חלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה נשמרת בתאי סכיזופרניה הנגזר hiPSC העצביים אב (NPCs), מצביע על כך שNPCs עשוי להיות סוג תא שימושי לחקר המסלולים המולקולריים תורם לסכיזופרניה 1 . אנחנו ואחרים דיווחנו הגירה חריגה, סטרס חמצונים מוגברים ומיני חמצן תגובתי, רגישות ללחצים סביבתיים תת-סף ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בסכיזופרניה hiPSC NPCs 1,4-6, כמו גם ירידת ג העצביonnectivity ותפקוד הסינפטי בנוירונים hiPSC סכיזופרניה 5,7-10. אם הגורמים המולקולריים תרמו להגירה חריגה ו / או סטרס חמצונים בסכיזופרניה hiPSC NPCs גם בבסיס הקישוריות העצבית המופחתת בתאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה, NPCs יכול להיות אוכלוסייה עצבית חזקה וreplicative מאוד שבה לחקור את המנגנונים אחראים למחלה. יתר על כן, כי אחד יכול במהירות לייצר מספר רב של תאים ולא צריך לחכות שבועות או חודשים להבשלה עצבית, מבחני מבוססי NPC מתאימים למחקר של קבוצות גדולות יותר של משתתפים והם נוחים יותר להקרנת תפוקה גבוהה. אנו מאמינים כי hiPSC NPCs יכול לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה, כפי שכבר הוכיח בהפרעות מגוונות כמו מחלת סכיזופרניה 1 והנטינגטון 11.
להבדיל מNPCs hiPSCs, עצבי ראשוני בduction מושגת על ידי עיכוב כפול הסמאד (0.1mm LDN193189 ו10mm SB431542) 12. על ידי להכעיס BMP וTGF איתות עם מולקולות קטנות אלה, האנדודרם ומפרט mesoderm חסום, האצת בידול עצבי ומובילים להיווצרות של שושנות עצביות גלויות בתוך השבוע של ציפוי אחד. דפוסים עצביים מתרחש בשלב מוקדם בתהליך הזה, ככל הנראה בתקופת היווצרות שושנה עצבית ומייד לאחר מכן. בהיעדר רמזים אחרים, התאים עצביים האלה פרימיטיביים להניח גורל כמו המוח הקדמי-קדמי 13. מייד לאחר היווצרות שושנה עצבית, ומתמשך לאורך הרחבת NPC, NPCs המוח הקדמי בתרבית עם FGF2 8,14. יש להם פוטנציאל שושלת כפול ויכול להיות מובחן לאוכלוסיות עצביות של 70-80% נוירונים III טובולין-חיוביים וחלבון חומצי (GFAP) האסטרוציטים 20-30% גליה fibrillary -positive (איור 1). רוב הנוירונים hiPSC המוח הקדמי הם VGLUT1 חיובי, ולכן הם ככל הנראה glutamatergic, למרות שכ -30% מתאי העצב הם GAD67-חיובי (GABAergic) 8.
NPCs הוא passaged באופן שיגרתי יותר מעשר פעמים במבחנה, תוך שמירה על פרופילי בידול עקביים, וללא צבירת חריגות קריוטיפ. קבוצות דיווחו NPCs passaging יותר מ -40 פעמים 15, לעומת זאת, אנו מוצאים כי מעבר לעשרה קטעים, NPCs להראות גדל נטייה לבידול astrocyte. NPCs גם לסבול הקפאה-מפשיר מרובה ויכול לעבור לגדול כneurospheres פשוט על ידי culturing בצלחות שאינן חסיד. NPCs הם transduced ביעילות על ידי וקטורים ויראליים, המאפשר הערכה מהירה של התוצאות מולקולריות ותאיות של ההפרעות גנטיות, ובקלות להרחבה להניב מספיק חומר למחקרים ביוכימיים. יתר על כן, מכיוון שוקטורים ויראליים להתיר חזק על ביטוי ו / או מציאה של גנים של מחלות-רלוונטיות, בכל שליטה או neur חולה נגזרתאי אל, אחד יכול להשתמש בפלטפורמה זו על מנת לבחון את ההשפעה של רקע גנטי על המניפולציות הללו. למרות שאינו מתאים להסינפטי או מבחני מבוססי פעילות הדורשים תאים בוגרים, NPCs עשוי להיות חלופה מעשית עבור רבים ניתוחים מולקולריים או ביוכימי פשוטים של תאים עצביים המופקת מחולה.
יש לנו תארנו שיטות שבאמצעותו להבחין hiPSCs לNPCs, סוג תא עצבי שבחלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC נשמרת ושעשויה לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה 8, 11. בנוסף, כפי שפורטנו, NPCs הוא אוכלוסייה עצבית וחסונה replicative וtransduced בקלות, שא?…
The authors have nothing to disclose.
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
NEAA | Life Technologies | #11140 | |
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |