This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
des études d'expression génique de neurones différenciés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes d'origine humaine (les) hiPSCs par nous et d'autres 1 2,3 indiquent que les neurones hiPSC ressemblent foetal plutôt que le tissu cérébral adulte. À l'heure actuelle, les modèles fondés sur hiPSC peuvent être plus appropriées pour l'étude de prédisposition à, plutôt que de caractéristiques tardive de la maladie neurologique. Nous avons précédemment rapporté que une fraction significative de la signature de gène de neurones hiPSC dérivé schizophrénie est conservée dans les cellules de la schizophrénie de hiPSC dérivé progénitrices neurales (CNP), indiquant que CPN peut être un type cellulaire utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui contribue à la schizophrénie 1 . Nous et d'autres avons signalé la migration aberrante, augmentation du stress oxydatif et les espèces réactives de l'oxygène, la sensibilité à la sous-seuil stress environnementaux et la fonction mitochondriale altérée dans la schizophrénie hiPSC PNJ 1,4-6, ainsi qu'une diminution de c neuronaleonnectivit é et la fonction synaptique dans les neurones de la schizophrénie hiPSC 5,7-10. Si les facteurs moléculaires contribuent à la migration aberrante et / ou le stress oxydatif dans la schizophrénie hiPSC PNJ sous-tendent également la connectivité neuronale réduite dans les neurones hiPSC dérivés schizophrénie, PNJ pourraient être une population de neurones robuste et très réplicative avec lequel pour étudier les mécanismes responsables de la maladie. En outre, parce que l'on peut générer rapidement un grand nombre de cellules et ne doivent pas attendre des semaines ou des mois pour la maturation neuronale, tests basés sur PNJ sont adaptés pour l'étude de cohortes de patients plus importants et sont plus disposés à criblage à haut débit. Nous croyons que hiPSC PNJ peut servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la pathogenèse de la maladie, comme cela a déjà été démontré dans de troubles aussi divers que la schizophrénie 1 et la maladie de Huntington 11.
Pour différencier les PNJ de se hiPSCs, neurale initialela production est réalisée par double inhibition SMAD (0,1 mM et 10 mM LDN193189 SB431542) 12. En se opposant BMP et TGF signalisation avec ces petites molécules, l'endoderme et du mésoderme spécification est bloquée, ce qui accélère la différenciation neuronale et conduisant à la formation de rosettes de neurones visibles dans la semaine de placage. Neural motif se produit au début de ce processus, probablement au cours de la période de la formation de rosettes de neurones et immédiatement après. En l'absence d'autres indices, ces cellules nerveuses primitives supposent un cerveau antérieur comme le destin antérieure-13. Immédiatement après la formation de rosettes de neurones, et continue tout au long de l'expansion de l'APN, PNJ cerveau antérieur sont cultivées avec FGF2 8,14. Ils ont le potentiel de la lignée double et peuvent être différenciés aux populations de neurones de 70-80% neurones III-tubuline-positifs et de 20 à 30% protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) astrocytes -positifs (Figure 1). La majorité des neurones du cerveau antérieur hiPSC sont VGLUT1 positif, Et sont donc vraisemblablement glutamatergique, même si environ 30% des neurones sont GAD67 positif (GABAergique) 8.
PNJ sont régulièrement soumises à des passages plus de dix fois in vitro, tout en maintenant des profils de différenciation cohérentes et sans accumuler des anomalies du caryotype. Groupes ont rapporté PNJ de passages plus de 40 fois 15, cependant, nous constatons que plus de dix passages, PNJ montrent propension accrue à la différenciation des astrocytes. PNJ bien tolérer plusieurs gel-dégel et peut être la transition de croître comme neurosphères simplement en culture dans des plaques non-adhérentes. PNJ sont efficacement transduites par des vecteurs viraux, permettant l'évaluation rapide des conséquences moléculaires et cellulaires de la perturbation génétique et facilement extensible pour obtenir suffisamment de matériel pour les études biochimiques. En outre, en raison des vecteurs viraux permettent robuste sur-expression et / ou inactivation de gènes responsables de maladies concerné, soit le contrôle ou le patient dérivée neural cellules, on peut utiliser cette plateforme pour tester l'effet de fond génétique sur ces manipulations. Bien que ne convient pas pour synaptique ou tests basés sur les activités nécessitant neurones matures, PNJ peut être une alternative pratique pour de nombreuses analyses moléculaires ou biochimiques simples de cellules neurales provenant de patients.
Nous avons décrit les méthodes permettant de différencier hiPSCs dans PNJ, un type de cellules neurales dans laquelle une fraction importante de la signature génétique des neurones hiPSC dérivés est conservée et que peuvent servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la maladie pathogenèse 8, 11. En outre, comme nous l'avons précisé, les PNJ sont une population de neurones robuste réplicative et facilement transduites, qui nous croyons peut être approp…
The authors have nothing to disclose.
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
NEAA | Life Technologies | #11140 | |
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |