This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.
Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.
Estudios de expresión génica de las neuronas diferenciadas in vitro a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) por nosotros 1 y otros 2,3 indican que las neuronas hiPSC asemejan fetal en lugar de adultos tejido cerebral. En la actualidad, los modelos basados en hiPSC pueden ser más apropiados para el estudio de la predisposición a, en lugar de características tardía de la enfermedad neurológica. Hemos informado anteriormente de que una fracción significativa de la firma genética de las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia se conserva en las células esquizofrenia hiPSC derivados neurales progenitoras (NPC), indicando que NPC puede ser un tipo de célula útil para estudiar las vías moleculares que contribuyen a la esquizofrenia 1 . Nosotros y otros han informado de la migración aberrante, aumento del estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno, la sensibilidad a las tensiones ambientales sub-umbral y la función mitocondrial alterada en la esquizofrenia hiPSC NPC 1,4-6, así como una disminución c neuronalonectividad y la función sináptica en las neuronas hiPSC esquizofrenia 5,7-10. Si los factores moleculares que contribuyen a la migración aberrante y / o el estrés oxidativo en la esquizofrenia hiPSC NPCs también subyacen a la conectividad neuronal reducida en las neuronas hiPSC derivado de la esquizofrenia, NPC podrían ser una población neuronal robusta y altamente replicativa con el que estudiar los mecanismos responsables de la enfermedad. Además, porque se puede generar rápidamente un gran número de células y no es necesario esperar semanas o meses para la maduración neuronal, ensayos basados en NPC son adecuados para el estudio de grandes cohortes de pacientes y son más susceptibles de cribado de alto rendimiento. Creemos que hiPSC NPCs puede servir como sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad, como ya se ha demostrado en los trastornos tan diversos como la esquizofrenia 1 y la enfermedad de Huntington 11.
Para diferenciar los NPCs de hiPSCs, neural inicial enla producción se lleva a cabo por doble SMAD inhibición (0,1 mM y 10 mM LDN193189 SB431542) 12. Por antagonizar BMP y TGF señalización con estas pequeñas moléculas, endodermo y mesodermo especificación está bloqueada, la aceleración de la diferenciación neuronal y que conduce a la formación de rosetas neuronales visibles dentro de una semana de la siembra. Patrón Neural se produce temprano en este proceso, presumiblemente durante el período de formación de rosetas neural e inmediatamente después. A falta de otros indicios, estas células nerviosas primitivas suponen un-cerebro anterior como el destino anterior 13. Inmediatamente después de la formación de rosetas neural, y continua a lo largo de la expansión de la APN, NPCs del cerebro anterior se cultivan con FGF2 8,14. Tienen potencial linaje dual y se pueden diferenciar de las poblaciones neuronales del 70-80% neuronas III-tubulina-positivas y 20-30% de proteína ácida glial fibrilar (GFAP) -positivos astrocitos (Figura 1). La mayoría de las neuronas del cerebro anterior hiPSC son VGLUT1-positivo, Y también lo son presumiblemente glutamatérgica, aunque aproximadamente el 30% de las neuronas son GAD67-positivo (GABAérgicas) 8.
NPC se pasan rutinariamente más de diez veces in vitro, mientras que el mantenimiento de los perfiles de diferenciación consistentes, y sin acumular anomalías del cariotipo. Los grupos han reportado NPCs pases más de 40 veces 15, sin embargo, nos encontramos con que más allá de diez pasajes, NPCs muestran una mayor propensión a la diferenciación de los astrocitos. NPCs bien tolera múltiples congelaciones deshielos y puede ser la transición a crecer como neuroesferas simplemente cultivando en placas no adherentes. NPCs son transducidas eficientemente por vectores virales, lo que permite una rápida evaluación de las consecuencias moleculares y celulares de la perturbación genética, y fácilmente ampliable para producir suficiente material para estudios bioquímicos. Además, porque los vectores virales permiten robusta sobre-expresión y / o desmontables de genes relevantes de la enfermedad, ya sea en el control o paciente derivada neurcélulas de Al, se puede utilizar esta plataforma para probar el efecto de los antecedentes genéticos de estas manipulaciones. Aunque no es adecuado para sináptica o ensayos basados en actividades que requieren las neuronas maduras, NPCs puede ser una alternativa práctica para muchos análisis moleculares o bioquímicos directas de las células neuronales derivadas del paciente.
Hemos descrito los métodos por los que pueda diferenciar hiPSCs en NPCs, un tipo de célula neuronal en la que se conserva una parte importante de la firma genética de neuronas derivadas de hiPSC y que pueden servir como un sustituto de las vías de desarrollo que posiblemente contribuyen a la patogénesis de la enfermedad 8, 11. Además, como hemos detallado, NPCs son una población neuronal robusta replicativa y fácilmente transducidas, que creemos que puede ser adecuado para los estudios moleculares y b…
The authors have nothing to disclose.
Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation – Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 | Life Technologies | #11330 | for HES media |
DMEM/F12 | Life Technologies | #10565 | for neural media |
KO-Serum Replacement | Life Technologies | #10828 | Needs to be lot tested |
Glutamax | Life Technologies | #35050 | |
NEAA | Life Technologies | #11140 | |
2‐mercaptoethanol (55mM 1000x) | Life Technologies | #21985-023 | |
N2 | Life Technologies | #17502-048 | Needs to be lot tested |
B27-RA | Life Technologies | #12587-010 | Needs to be lot tested |
FGF2 | Life Technologies | #13256-029 | Resuspend in PBS + 1% BSA |
LDN193189 | Stemgent | #04-0074 | |
SB431542 | Stemgent | #04-0010 | |
BDNF | Peprotech | #450-02 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
GDNF | Peprotech | #450-10 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
Dibutyryl cyclic-AMP | Sigma | #D0627 | Resuspend in PBS + 0.1% BSA |
L-ascorbic acid | Sigma | #A0278 | Resuspend in H20 |
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent | Stemcell Technologies | #05832 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | |
Collagenase IV | Life Technologies | #17104019 | |
CF1 mEFs | Millipore | #PMEF-CF | |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
Laminin, Natural Mouse 1mg | Life Technologies | #23017-015 | |
BD Matrigel | BD | #354230 | Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent |
Tissue culture treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
Ultra low attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
goat anti-Sox2 | Santa Cruz | sc17320 | use at 1:200 |
mouse anti-human Nestin | Millipore | MAB5326 | use at 1:200 |
rabbit anti-βIII-tubulin | Covance | PRB435P | use at 1:500 |
mouse anti-βIII-tubulin | Covance | MMS435P | use at 1:500 |
mouse anti-MAP2AB | Sigma | M1406 | use at 1:200 |
Plate centrifuge | Beckman Coulter | Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier) |