Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לכמת חברותיות עכבר. עכברים הם צילמו כאשר הם עוברים ולתקשר בכלוב מיוחד. עיבוד סרט מאפשר כימות האוטומטיות של חברותיות עם דיוק ואמינות מעולים.
Abstract
עכבר הוא אורגניזם המודל המועדף לבדיקת תרופות שנועדו להגדיל חברותיות. אנו מציגים שיטה לכמת עכבר החברותי שבו עכבר המבחן יוצב מנגנון סטנדרטי והתנהגויות רלוונטיות מוערכות בשלושה מפגשים שונים (אני מושב שנקרא, II ו- III).
המנגנון יש שלושה תאים (ראה איור 1), התאים על ימין ועל שמאל להכיל כוס הפוכה אשר יכול לאכלס עכבר (המכונה "עכבר גירוי").
ב אני בפגישה, עכבר המבחן מושם בכלוב והניידות שלה מאופיינת במספר המעברים בין תאים. בפגישה השנייה, עכבר גירוי מושם תחת אחד הכוסות ההפוכות ואת החברותיות של עכבר הבדיקה היא לכמת ידי סכומי הזמן מבלה ליד הכוס המכילה את עכבר הגירוי הסגור מול הכוס ההפוכה הריקה. במפגש שלישי, הכוסות ההפוכות הם הסירו ד בשני עכברי אינטראקציה בחופשיות. צורת ההתחברות של עכבר המבחן בפגישה III היא לכמת במספר הגישות חברתיות זה הופך לעבר עכבר גירוי על ידי מספר הפעמים שהוא ימנע גישה חברתית על ידי עכבר הגירוי.
ההערכה האוטומטית הסרט מזהה את האף של עכבר הבדיקה, המאפשר קביעה בכל האמצעים החברותיים המתוארים שאני פגישה השנייה (בפגישה III, גישות מזוהות באופן אוטומטי אבל מסווגים באופן ידני). כדי למצוא את האף, את התמונה של כלוב ריק מופחתת באופן דיגיטלי כל מסגרת של הסרט ואת התמונה המתקבלת היא binarized לזהות את הפיקסלים העכבר. זנב העכבר יוסר באופן אוטומטי ושני במעוזים המרוחקים ביותר של העכבר שנותר נקבעים; אלה קרובים האף ובסיס הזנב. על ידי ניתוח התנועה של העכבר באמצעות טיעוני המשכיות, האף מזוהה.
"איור 1" src = "/ files / ftp_upload / 52,508 / 52508fig1.jpg" />
הערכת איור 1. החברותיות במהלך 3 מפגשים מושב לי (למעלה):.. הסתגלות של עכבר מבחן לכלוב מושב השנייה (באמצע):. עכבר המבחן לנוע בחופשיות בכלוב בזמן שעכבר גירוי מוקף כוס הפוכה המושב III (למטה): שניהם עכבר מבחן ועכבר גירוי רשאי לנוע בחופשיות לתקשר אחד עם השני.
Introduction
חברותיות פגומים הוא אחד התחומים התסמין העיקרי במגוון של הפרעות התפתחותיות, כולל הפרעות ספקטרום האוטיזם (ASDs) 1,2. זה מגביל מאוד את היכולת של המטופלים לפתח יחסים מאוד משפיע חולים, משפחות ומטפל 2,3.
במאמץ להבין טוב יותר את המנגנון הבסיסי חברותי לקויים ולפתח טיפולים, מודלי עכבר כמה נחקרו 1,4-9. אחת זן כזה הוא עכבר BALB / ג, זן טהור שמספק חברותיות נמוכה להפליא, דומה תכונות אצל חולים עם ASD5 8-12. לדוגמא, עכבר BALB / ג מציג בתדירות נמוכה יותר של גישות חברתיות תשובה שלילית בדרך כלל לגישות חברתיות על ידי עכבר גירוי (למשל, הימנעות חברתית) מאשר זן קומפרטור השויצרי וובסטר 10.
כדי לבדוק אם הטיפול המוצע הוא אפקדואר בהגדלת חברותיות, מדדים אובייקטיביים נדרשים. מסגרת מקובלת היא לנתח את החברותיות במנגנון סטנדרטי כי יש שלושה תאים (ראה איור 1).
התאים על ימין ועל שמאל כל להכיל כוס חוט הפוכה שבו שוכנת עכבר גירוי בולט חברתי. עכבר המבחן משתחרר לתוך המנגנון במשך שלושה במרווחים של 10 דקות (מפגשי I-III); הפגישה הייתי מעריך את הפעילות של התנועה של עכבר הבדיקה, תוך מפגשי II ו- III להעריך אספקטים שונים של החברותיות של עכבר הבדיקה.
ב אני בפגישה, עכבר הבדיקה מותר להסתגל המנגנון. בפגישה זו, מספר מעברים כי עכבר הבדיקה עושה בין התאים השונים נמדד. חשוב לציין, אמצעי חברותיות שהושגו במנגנון שלושת התאים הסטנדרטיים תלויים פעילות של תנועה, ופעילות של תנועה מופחתת יכולה לבלבל פרשנות של Sociנתוני יכולת.
בפגישה השנייה, עכבר הבדיקה נע בחופשיות עכבר גירוי מושם תחת אחד הכוסות ההפוכות (מתאזן). עכברי הגירוי הם 4 שבועות זכר outbred ישנים עכברי ICR, לגיל ומין עכברי הבדיקה. עכבר גירוי מוקף כוס הפוכה בצד כאזור התא החברתי, ואת הכוס ריקה הפוכה מושמת בצד כאזור תא nonsocial. בפגישה השנייה, החברותיות של עכבר הבדיקה היא לכמת ידי השוואה בין הזמן שהוא מבלה ליד הכוס "החברתית" ההפוכה (פחות מ -2 סנטימטרים משם) לעומת הזמן שהוא מבלה ליד הכוס ההפוכה "nonsocial", ועד הוא מבלה בתא החברתי לעומת הזמן שהוא מבלה בתא nonsocial. עכברים קומפרטור שוויצרי וובסטר משקיעים הרבה יותר זמן בתא החברתי ליד הכוס החברתית ההפוכה בהשוואה לעכברי BALB / ג כי לא מראים העדפה משמעותית עבור חברתיכוס הפוכה או בתא החברתי 12.
במפגש שלישי, עכברי בדיקת גירוי מותרים לקיים יחסי גומלין חופשי (כוסות הפוכות יוסרו). מדדי חברותיות, התנהגויות סטריאוטיפיות ומעברים בין התאים מתקבלים באופן אמין פגישת 10 דקות השלישית של אינטראקציה חופשית בין בדיקה ועכברי גירוי ונותח. בדו"ח זה, החברותיות של עכבר הבדיקה היא לכמת באמצעות שני מדדים: 1) מספר גישות חברתיות זה הופך לעבר עכבר הגירוי, שבו גישה חברתית מוגדרת לנוע קדימה (אף ראשון) לכיוון עכבר הגירוי כך האף הוא פחות מ -2 ס"מ מן העכבר גירוי; 2) המספר והימנעויות של גישות חברתיות על ידי עכבר הגירוי. עכבר המבחן נחשב הימנעות הגישה אם יתברר או מתרחק מן עכבר הגירוי, או אם הוא מפסיק זמנית נעים ( "הקפאת התנהגות") לאחר עכבר הגירוי פנה עכבר הבדיקה. BALB /עכברי ג מצביעים על ירידה במספר הגישות חברתיות שנעשו כלפי עכבר הגירוי וגידול במספר התגובות שליליות לגישות חברתיות על ידי עכבר הגירוי, לעומת זן קומפרטור השויצרי וובסטר 10.
ההערכה של הסרטים התנהגותי מסורתית נעשתה באופן ידני, כלומר, על ידי צפייה בסרט בזהירות (ואולי במהירות מופחתת) והפעיל סטופרים בפעם העכבר מבלה בתא מסוים או בסמוך לאחד הכוסות ההפוכים 10. שיטה זו דורשת צופה הסרט שוב ושוב היא, אם כן, מאוד זמן רב. כמו כן, את הדיוק מוגבל על ידי זמן התגובה של המדרג למדידות סטופר היכולת לתפוש אם סמן העכבר נמצא בתוך 2 ס"מ של כוס הפוכה. בשנים האחרונות עבודה, שני מתחמים, (D-סרין ו- D-cycloserine) הוכיחו יעילות בהשבת חברותיות בעכברים BALB / ג 9,10,12. זה ידוע כי הן modu הרכיביםמאוחר הקולטן NMDA, אשר ידוע לשחק תפקיד מרכזי בהתנהגות חברתית 2,12. מערך גדול של תרכובות ידועים לווסת פעילות הקולטן NMDA במגוון דרכים מוגדרות היטב, ואת הפוטנציאל לפריצת דרך בטיפול ASD הופך את ההערכה המזורזת של תרכובות אלה בעדיפות שיטה אוטומטית מהירה להערכה רצויה מאוד.
מתואר להלן הוא הליך ניתוח אוטומטי שפותח עבור ההערכה של חברותיות עכבר. היא משתמשת בשיטות עיבוד תמונה על כל המסגרות של סרטים בעכבר כדי לזהות את המיקום של העכבר או עכברים. בפגישות I ו- II, זה עוד יותר מזהה מיקום אף ומשתמש בו כדי לחשב צעדים חברותיים. במפגש שלישי, זה מזהה אוטומטית את כל הגישות, אלא על סיווג ידני (גישה חברתית, הימנעות חברתית, או אחרת) נדרש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול עבור וקלות ההסבר כבר מחולק ל -2 חלקים: 1) הליך הניסיון ו -2) ניתוח אוטומטי. כל החיות טופלו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה 15, וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש.
1. נוהל ניסיוני
- הגדר את הכלוב, שהיא קופסה מלבנית פרספקס שחור שאינו רעיוני (52 x 25 x 23 ס"מ 3) מחולק לשלושה מדורים: חברתי, nonsocial, וכן תא באמצע נייטרלי (איור 1). מניח כוסות חוט הפוכות בכל אחד מתא הסוף במהלך פגישות I ו- II (ראה להלן) ולשכן עכבר הגירוי במהלך הפגישה השנייה.
- הגדר את המצלמה באופן שהכלוב ממלא את שדה הראייה. מאז תאורה יכול להפריע התנהגות העכבר, לשמור על בהיקות של לא יותר מ -3.5 לוקס בתוך הכלוב, מאגף אור עקיף מןנורת הליבון נמדד על רצפת הכלוב בכיוון מעלה. כמו כן להשתמש במקור אור אינפרא אדום, אשר עכברים לא יכול לחוש אבל המצלמה יכולה לזהות. להקליט את כל הסרטים ב 720 x 480 סטנדרטי.
- קלט מסגרת אחת של כלוב ריק לעיבוד תמונה מאוחר יותר (המכונה "מסגרת ההתייחסות") ולשמור כתמונה בגוונים אפורה.
- המושב ראשון: הצג עכבר בדיקה אל תוך הכלוב מנפנף עם יד על הכלוב, המציין את תחילת הפגישה (להשוות ניתוח אוטומטי). קלט סרט במשך 10 דקות. בסוף 10 דקות, לשים את העכבר חזרה לכלוב המקורי.
- מושב שני: שים את העכבר גירוי מתחת לאחד כוסות הפוכה (מתאזן).
- השתמש "חברתי שמאל" או "ימין חברתי" על מנת לבחור אם עכבר הגירוי הוא בגביע ההפוך בצד השמאל או בכוס ההפוכה מהימין.
הערה: הכוס ההפוכה עם עכבר הגירוי נקראת "הכוס החברתית", ואילו אחריםכוס "כוס nonsocial". התא שבו הכוס החברתית ממוקמת נקראת התא החברתי, התא עם כוס nonsocial הוא תא nonsocial, ואת התא באמצע הוא "התא הניטראלי". - הצג את עכבר הבדיקה לתוך הכלוב. יד גל מעל הכלוב כדי לציין את תחילת הפגישה. קלט סרט במשך 10 דקות. חשוב לציין, לשמור עכברים במנגנון החברותי לפני הסרת הכוסות ההפוכות להתחיל מושב III.
- מושב שלישי: הסר את הכוסות ההפוכות, שחרר את שני העכברים ולאפשר עכברי הבדיקה ומניעים אינטראקציה בחופשיות אחד עם השני. יד גל מעל הכלוב כדי לציין את תחילת הפגישה. קלט סרט במשך 10 דקות. בסוף 10 דקות, הניח את שני העכברים בחזרה לתוך הכלובים שלהם.
2. ניתוח אוטומטי
הערה: הפקודות בפרק 2 מונפק באמצעות ממשק משתמש גרפי (ראה איור 2) con כיקבוצת ביקורת של התוכנה שלנו. כאן נסביר את שלב-אחר-שלב עיבוד כי התוכנה שלנו מאפשרת; גם התוכנה היא מסוגלת לבצע את הניתוח במצב יצווה ללא קלט משתמש.
- עבור כל סרט, לבצע את פעולות העיבוד הבאות:
- הסרט טען (לחץ על הכפתור Load).
- בחר תצורת כלוב, אשר אומרת לתכנית ניתוח המיקום של גבולות כלוב, גבולות תא, ובמקומות כוס. בחר אחת מארבע תצורות הצילו או להתאים את כל הקואורדינטות באופן ידני.
הערה: התצורה בדרך כלל אינו משנה מניסוי אחד למשנהו, ועל כן ניתן לעשות בה שימוש חוזר. - עבור כל מסגרת של הסרט, בצע את השלבים הבאים עיבוד (2.1.3.1-2.1.3.6).
- להמיר את המסגרת לגווני אפור על ידי לחיצה על כפתור "גווני אפור".
- דיגיטלי להפחית את המסגרת בגווני אפור הפניה (ראה שלב 1.3) על ידי לחיצה על כפתור "פחת". הערה: המטרה של שלב זה היא להפוך את va פיקסללוקים של המסגרת קרובה מאוד לאפס בכל מקום זול תפקיד העכבר.
- Binarize המסגרת על ידי הגדרת כל הפיקסלים מתחת לרמה לסף מסוים לשחור, כל הפיקסלים מעל לרמה ללבן (לחץ על כפתור "Binarize").
הערה: הרעיון הוא שמכיוון פיקסלים העכבר יש ערכים גבוהים יותר בדרך כלל מאשר שאר הפיקסלים, הפיקסלים העכבר יהפכו לבן וכל פיקסלים האחרים שחורים. רמת הסף האופטימלית תלוי במצבו התאורה יכולה להיקבע על ידי בחינה של צורת העכבר לאורך סרט. אם הסף נבחר נמוך מדי, העכבר נראה גדול מדי, ופיקסלים שאינם שייך העכבר יכולים להיות בצבע לבן. אם הסף הוא גבוה מדי, העכבר הופך קטן יכול לפורר לחתיכות מנותקות. בסרטים רשמו, הסף האופטימלי היה תמיד בין 20 ו -35 (בסולם בין 0 ל -255). - לשחוק 13 פעמים דואר התמונה binarized, ואז מתרחבים 13 2e פעמים, אז eroדה שוב פעמי דואר, על ידי לחיצה על הכפתור "Erod / דיל".
הערה: מטרת נוהל זה היא להסיר את הזנב. לקבלת ההחלטה (720 x 480) ששימש, e = 3 עבד בכל הנסיבות.
הערה: התוכנה בודקת באופן אוטומטי את קיומו של יד בתמונה (במהלך ההקלטה של סרטים, ידות מועברות אפילו בתמונה כדי לציין את תחילתה של פגישה). אם יד קיימת, יהיה באופן יוצא דופן רב פיקסלים לבן בפריים binarized כי היד היא הרבה יותר גדולה מאשר עכבר. התנאה בנוכחות יד הוא שיש יותר מ -10,000 פיקסלים לבן בפריים binarized. התוכנה קובעת את ראשיתה של הפעלות I, II ו- III, על ידי גילוי מגוון של מסגרות שבו תנועות ידיים להתרחש.
- בפגישות I ו- II, להמשיך כדלקמן:
- זיהוי הרכיב המחובר הגדול של הסט של פיקסלים לבן (לחץ על "LComp"). הערה: מטרת of צעד זה הוא לחסל פיקסלים לבנים שאינם שייך העכבר, למשל, נגרם על ידי התנועה של עכבר הגירוי בפגישה שני. המרכיב המחובר הגדול נמצא כמעט בכל מסגרות העכבר.
- לקבוע שני פיקסלים לבן הרחוקים ביותר (נקרא "קצוות" של העכבר) על ידי לחיצה על "מצא מסתיים".
הערה: התוכנה קובע את ההמשכיות של שני הקצוות, כלומר, עבור כל הקצוות בפריים הראשון שאליו הקצוות של המסגרות הבאות הם שייכים. הרעיון הכללי הוא כי מאז מסגרות נרשמות בקצב גבוה, הקצוות לא יכול לנסוע רחוק מסגרת אחד למשנהו, כך להמשך הנכון של הקצוות ממסגרת אחת לאחרת הוא זה אשר ממזער את סכום המרחקים כי הקצוות לזוז. ראה דיון לקבלת פרטים נוספים. - קבע איזה סוף העכבר הוא האף.
- לקבוע את הכיוון שבו נע העכבר על ידי התבוננות כיצד מרכז הכובד (COG)שינויים ממסגרים למסגרת (של תנועת בורג היא התנועה של הסכום של כל הפיקסלים העכבר).
הערה: בורג של קבוצה של פיקסלים p 1, ..., p n עם קואורדינטות x 1, .., x n מוגדרת על ידי:
עכברים בדרך כלל להתקדם (כלומר, כלפי האף שלהם). באחד הפרקים של כמה מאות מסגרות, תמיד יש ביטחון גבוה מאוד באיתור ראש / זנב.
הערה: התוכנה קובעת באופן אוטומטי שלקראתו של זוהה מסיים את העכבר נע; לשם כך מזוהה עם האף מסומן בעיגול אדום בסרט. כאשר האף זוהה הוא מסומן בעיגול אדום בכל מסגרת, המשתמש יכול לבדוק את איכות האיתור.
- לקבוע את הכיוון שבו נע העכבר על ידי התבוננות כיצד מרכז הכובד (COG)שינויים ממסגרים למסגרת (של תנועת בורג היא התנועה של הסכום של כל הפיקסלים העכבר).
- במפגש השלישי, להמשיך כדלקמן:
- זיהוי שני מרכיבים גדולים של פיקסלים לבן.
- אם שני הם בגודל מקובל בבוקרעל יד הבית והמרכזי שלהם כובד (ברגים) עולה בקנה אחד עם ברגי העכבר של המסגרת הקודמת, שקולים שני המרכיבים הללו לשני עכברים.
- שקל העכבר גדל מקובלים אם הם לא השתנו על ידי יותר מ -20% מאז המסגרת הקודמת, ולשקול שיני שתי מסגרות רצופות כתואמים אם ההבדל שלהם הוא לא גדול יותר מאשר מרחק עכבר יכול לנסוע בזמן בין מסגרות (מרחק זה כדלקמן מן מהירות העכבר המרבית, כפי שניתן לקבוע במסגרת ההכנות של סדרת ניסוי על ידי ניתוח התנועה של עכברים כמה בודדים (כמו בפגישות I ו- II).
הערה: אם שני המרכיבים הגדולים ביותר הם גדלים מקובלים ולא עכבר, או הברגים שונים מדי מאלה המסגרת הקודמת, התוכנה באופן אוטומטי מעלה את סף binarization עד שני המרכיבים הגדולים ביותר הם של גודל מקובל וגלגלי השיניים שלהם עולות בקנה אחד עם אלה של המסגרת הקודמת.
- לחץ על עכבר המבחןהמסגרת הראשונה. השתמש ניתוח 2.3.1 לזהות הן מבחן ועכבר גירוי בכל מסגרת של מושב III.
- זהה את המסגרות בפגישה III שבה עכבר האחד חברתי מתקרב אחרים. הערה: התוכנה מיישמת שלב זה על ידי סימון אוטומטי שהמרחק בין העכברים הוא קטן ממרחק האינטראקציה הטיפוסי של עכברים (אנו משתמשים 2 סנטימטר).
- כשתוכנת משחק קטע קצר של הסרט עם הגישה זוהתה למשתמש, ללחוץ על כפתור כדי לציין אם גישה זו נחשבת גישה חברתית על ידי עכבר הבדיקה, הימנעות חברתית על ידי עכבר הבדיקה, או אף אחד מהם.
הערה: שלב 2.3.4 ניתן automatized אם ידוע אשר העכבר הוא עכבר הבדיקה. מכיוון שמידע זה הולך לאיבוד כאשר העכברים להתקרב יותר מדי זה לזה (או לטפס על גבי אחד את השני), ומאז יש לנו עדיין לא מצאו דרך לתייג העכברים בצורה כי ניתן לאתר באופן מהימן על ידי התוכנה שלנו ועושה לא להשפיע על התנהגותם, והחזרנו אלסיווג ידני לעת עתה.
- זיהוי שני מרכיבים גדולים של פיקסלים לבן.
- כדי להעריך סרטים מעובדים, סרט עומס באמצעות כפתור Load.
- לחץ על התחל מושב 1 כדי להציג את הפריים הראשון של מושב 1 (או התחלה 2 מושב כדי להציג את הפריים הראשון של הפגישה 2).
- לחץ על Play / Stop לשחק ולהפסיק סרטים.
הערה: סרטי מעובד יציג עכבר עם הראש והזנב מסומן עיגולים צבעוניים. כל האמצעים החברותיים מוצגים על המסך ומעודכן כפי שסרט המשחק. - נתונים חברותי יצוא בפורמט Excel על ידי לחיצה על "יצוא".
- לחץ על "לאסוף נתונים" לרכז את כל הנתונים של כל הסרטים בתיקייה לתוך קובץ יחיד ב- Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מראה מסגרת צבע של סרט התנהגותית עם כלוב ריק. העכבר לא הוכנס לתוך הכלוב עדיין. עמדת הכוסות, (חברתי nonsocial) ואת גבולות התא מורכבת. מסגרת צבע של כלוב ריק מומר 8 בגווני אפור קצת כפי שמוצג באיור 4 ומשמש כמסגרת התייחסות. מסגרת ההתייחסות מופחתת בכל מסגרת אחרת של הסרט בשבי.
איור 5 מראה אחד של פריימים מתוך הסרט במהלך הייתי בפגישה, שוב עם גבולות תא ועמדות כוס חופפות זו לזו. מסגרת ההתייחסות מופחתת מסגרת דגימה והתוצאה, שנקראה מסגרת ההבדל, מוצג באיור 6.
איור 7 הוא גרסת binarized של מסגרת ההבדל. (ראה סעיף 2.1.3.3). הדמות גם מראה את המיקום של האף (העיגול האדום) והבסיס של ת"אil (עיגול אפור), כפי שנקבע בסעיף 2.2.4).
לאחר עמדת האף הוא הוקם עבור כל מסגרת של הסרט, את המסלול של העכבר ניתן לנתח בכל דרך רצויה. איור 8 מציג את העמדות של אף העכבר (עיגולים לבנים) עבור חלק בסרט שמכסה כ -1,000 מסגרות (~ 30 שניות).
איור 9 מראה את התוצאה של ניתוח חברותי עבור I. מפגש מספר המעברים בין תאי כלוב משמש כמדד פעילות של תנועה (בדוגמא, 59 מעברים ב 10 דקות מצביעים פעילות של תנועה נורמלית). השעה בילתה בחלקים שונים של הכלוב לשמש בסיס לשפוט העדפת הכוס החברתית התא / בפגישה השנייה.
איור 10 מראה את התוצאה של הניתוח החברותי עבור הפגישה השנייה. מעניינים במיוחד הם הפעמים בילו ליד הכוס החברתית לעומת nonsocial (ב EXA לראות230.8 mple vs 72.3 שניות) ואת חברתי לעומת התאים הניטראליים nonsocial (314.7 לעומת 109.4 לעומת 185.5 שניות). ההטיה הברורה לכיוון כוס התא החברתי אופיינית עבור עכברים שליטים, והשוואה עם הנתונים מהפעלה אני (איור 9) מדגימה בבירור כי ההטיה באמת היא תוצאה של הנוכחות של עכבר גירוי.
איור 11 מראה את התוצאה של הניתוח החברותי עבור מושב III. המספר הגבוה של גישות חברתיות (35 ב 10 דקות), כמו גם את התגובות החיוביות לגישות חברתיות על ידי עכבר הגירוי (9/10) אופייני של עכברים עם חברותיות נורמלית.
איור 2. ממשק משתמש גרפי. אנא גללקק כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. רוקן קייג '. זה משמש כמסגרת התייחסות לאחר ההמרה לאפור בקנה מידה. המעגל האדום מראה את המיקום של הכוס החברתית כוס nonsocial בצד הנגדי. הקווים הלבנים האנכיים לחלק את הכלוב לתוך תאים שונים ואת המלבן מציג את הגבול הפנימי של הכלוב.
איור 4. גוונים אפורים גרסה של איור 3.
איור 5. מסגרת מקורית. מסגרת סרט בפורמט בגוונים אפור. הגליל החברתי מסומן על ידי עיגול לבן, ומעגל אפור נוסף ברדיוס 2 סנטימטר גדול יותר מזה של הצילינדר החברתי מופנה לתחום את האזור שבו עכבר הבדיקה נחשב "קרוב" אל הגליל החברתי. בפינה ממול, צילינדר nonsocial מסומן על ידי עיגול אפור ושוב, מעגל נוסף עם רדיוס 2 סנטימטר גדול מופנה לתחום את האזור כי הוא נחשב למקורב גליל nonsocial. הקווים הלבנים האנכיים לחלק את הכלוב לתוך תאים שונים ואת המלבן מציג את הגבול הפנימי של הכלוב.
איור תמונת הבדל 6.. תמונה שהושגה על ידי הפחתת הייחוס מהמסגרת המדגמת.
תמונת איור 7. Binarized. ככל שמספר הפיקסלים של diתמונת fference החורגת מסף מסוים (30 בדוגמא זו) נחשבת פיקסלים העכבר מוצג לבן. העיגול האדום מסמן את אף העיגול הלבן הוא הזנב.
איור 8. עכבר מסלול. העיגולים הלבנים הקטנים להציג את מיקומם של האף מתחילת הפגישה הייתי עד מסגרת זו נכבשה.
תוצאות איור 9. ניתוח חברותי עבור המושב I. המספרים מעל התאים בכלוב בהתאמה לציין את פעמי העכבר בילה בם (במקרה זה 254.3 שניות בתא השמאלי, 155.2 שניות בתא הניטראלי, 237.0 שניות בפינה הימנית תָא). המספרים בתוך העיגולים מציינים את הפעמים העכבר בילו קרוב המילכוס pective ( "קרובה" אומרת פחות מ -2 סנטימטרים משם, או בתוך החיצוני של שני עיגולים): 140.0 שניות קרוב כוס השמאל, 105.6 שניות קרובות הגביע הימני. המספר במרכז bottom מציין את התדירות שבה העכבר מעבר בין התאים השונים של הכלוב (59 פעמים בדוגמא).
תוצאות איור 10. ניתוח חברותי עבור מושב השני. המספרים מעל התא ובתוך העיגולים מציינים פעמים בילו חלק אחר של הכלוב כמו הערת I. איור 9 / ישיבה בפגישה השנייה, יש עכבר גירוי באחד של הכוסות ההפוכות (שמאל האחד במקרה זה), אז כוס זה הופכת את הגביע "החברתי". בנוסף לצעדים של לי פגישה, בפעם עכבר הבדיקה לוקחת להתקרב (בתוך 2 סנטימטר) כדי הצילינדר החברתי בפעם הראשונה ניתנתבפינה הימנית התחתונה של המרכז. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות איור 11. ניתוח חברותי עבור המושב III. המספר שאחרי "גישה", נכתב מספר גישות חברתיות שנעשות על ידי עכבר הבדיקה, המספרים אחרי "העדפות. שו"ת. "ו" נג. שו"ת. ", ציין מספר תגובות חיוביות ושליליות על ידי עכבר המבחן לגישות חברתיות על ידי עכבר הגירוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על ידי שילוב של עכברים בוידאו וניתוח סרט אוטומטית, יצרנו סבירה, טכניקת תפוקה גבוהה הקרנה אמינה.
הדיוק של הניתוח האוטומטי הושווה עם התוצאות של ניתוח הוראות עבור יותר מ -100 סרטים. ברוב המוחלט של מסגרות (> 99%) של מסגרות, האף של העכבר מזוהה עם דיוק טוב. רוב misdetections (מעט) אין השפעה על האמצעים חברותיות, כך כ -80% מן הסרטים אינם דורשים תיקונים שום.
בסרטים אלה שכן מכילים misdetections, רב הבעיה הנפוצה ביותר היא כי הראש והזנב מבולבל, אז יש לנו כלל בתוכנת דרך פשוטה לעבור ראש וזנב עבור קטע סרט. גם אם סרטים נתפסים כדי לבדוק ולתקן את כל misdetections, סימון זו יכול להיעשות על 3 פעמים בזמן אמת במהירות, כך שבפעם הערכה נשאר מאוד קצר. הסעיפים של הסרטשבו העכבר הוא לא קרוב אחד הגלילים ניתן לצפות גם במהירות גבוהה.
ההסכם בין כל האמצעים החברותיים נקבעו אוטומטית או ידני הוא מצוין (בהנחה misdetections האפשרי תוקן). למעשה, את איכות האמצעים החברותיים נקבעו אוטומטית עדיפה נקבע באופן ידני אלה, כי קריטריונים אובייקטיביים משמשים באופן עקבי כדי לקבוע מרחקים וזמנים, תוך הערכה ידנית סובלת ממגבלות של תפישה אנושית ואת זמן תגובה. מגבלות אלה המחריפים עם מהירויות צפייה גבוהות, אשר רצוי להגביל את זמן ההערכה.
הערה לגבי צעד 2.2.2 .: שגרה זו מיושמת על ידי הקטנת הקבוצה של פיקסלים לבן גבולה באמצעות כלי עיבוד תמונה רגילים 14 ו חישוב המרחק בין כל שני פיקסלים גבול. מציאת הנקודות המרוחקות ביותר היא שימושית כי האף ובסיס הזנבנוטה להיות קרוב מאוד לשני הקצוות הללו.
למען שלמות, יישום ההמשכיות של הקצוות (שלב 2.3.4) מתואר להלן. בתוך מסגרת נתונה עם ג קצוות ד ומסגרת קודמת עם הקצוות A ו- B, אם ג שייך ו ד B או C שייך B ו- D על (ראה איור 12).
קביעת המשכיות איור 12.. עכבר בצבע אפור בהיר עם אף וזנב מסומן A ו- B בהתאמה הוא העמדה הראשונית. עכבר בצבע לבן עם זנב אף מסומן C ו- D בהתאמה הוא המיקום של עכבר בתוך המסגרת הבאה.
הרעיון הכללי הוא כי להימשך הנכון, סכום המרחקים שעוברים הקצוות קטן יותר להמשך השגוי, כי העכבר נוסע פחות מ אורך משלו ממסגרת אחת לאחרת. בדוגמה (איור 2 δ 1 = | ג - א |, δ 2 = | ד - ב |, Δ 1 = | ג - ב |, ו Δ 2 = | ד - א |, ואומר שבגלל δ 1 + δ 2 <Δ 1 + Δ 2, המשך הנכונה היא ד → C ו- B →. מידה טובה על האמון של קביעה כאמור הוא מקסימום יחס r = (δ 1 + δ 2, Δ 1 + Δ 2) / min (δ 1 + δ 2, Δ 1 + Δ 2), המתאר כיצד הרבה יותר הקצוות ייסעו באחד continuation מול השני. על פי הגדרה, r הוא גדול או שווה ל -1 עבור צורות עכבר מוארכות, r הוא בדרך הכלל גדול יותר מ -10, רק אם צורת העכבר הופכת להיות יותר עגולה (למשל, כי העכבר הוא עומד על רגליו האחוריות), r יכול להתקרב אחד וההמשך אינו מהימן. להמשך אמין, סף של r> 2.5 נוצל בעבר. עם סף זה, בסעיפים של מסגרות, בהן המשכיות של הקצוות מוקמת, נע בדרך כלל בין מאות אלפי מסגרות. עבור כל מקטע, לקבוע שלקראתו לסיים את העכבר נע בתוך קטע. לאחר משכיות קטע נוצרה, "מרכז הכובד" (COG, הקואורדינטות הממוצעות של כל הפיקסלים העכבר) עבור כל מסגרת בסעיף נקבע. הבדל בורג ממסגרת אחת לאחרת מגדיר את המהירות של העכבר בין שתי המסגרות. מהירות זה מוקרן על וקטור המחברת בין שני הקצוות כדי לראות אם וכמה העכבר נע גרירהARDS הראשון או לקראת הסוף השני. ההצעה הכוללת (אשר גם כלפי הראשון או את הקצה השני) היא הסיכום של התנועות של כל המסגרות.
הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שונה בכמה דרכים כדי לתת מענה לצרכים ניסיוניים שונים. אם היבטים שונים של תנועת העכבר (למשל, המהירות הממוצעת) הם בעלי העניין, ניתן לחלץ אלה מתוואי העכבר הממוחשבים. אם תנאי התאורה הם שונים מאוד מאלו המתוארים כאן, הסף בשלב binarization מניב הפיקסלים העכבר יכול להיות מותאם. אפילו שינויים כמו צורת כלוב שונה יכולים להיות מיושמים על ידי שינוי שגרת תצורת כלוב הנוכחית שלנו.
התוכנה המתוארת לעתים מבלבלת ראש וזנב (תוך פחות מ -20% של הסרטים, יש צורך בתיקון משום להעיף ראש / הזנב ישפיע הערכתנו). כתבנו כלי נוח המאפשר למשתמש לזהות את הראשון ואת הדואר המסגרת האחרונה של המרווח שבו ראש צורך הזנב להיות התהפכו ולאחר מכן לבצע תיקון זה בלחיצה אחת. מעט מאוד סרטים (כמה אחוזים) היו בעיות אחרות מאשר להעיף ראש / זנב עבור אלה עשינו כלי תיקון כלליים יותר המאפשרים למשתמש להגדיר באיזה חלק של כלוב אף עכבר בדיקה במהלך כל מרווח. ראוי לציין, כי צורך התיקון מתרחש לעתים רחוקות כל כך שההשפעה על זמן הערכה היא קטנה.
הרחבות מתוכננות של הפרוטוקול הם גם לזהות יותר חברתיים התנהגויות רלוונטיות, כגון רודף anogenital מרחרח (אשר יכול להיות מזוהה על ידי ניטור מרחוק מהאף של עכבר המבחן לגוף לבין פי הטבעת של עכבר הגירוי, בהתאמה). התנהגויות סטריאוטיפיות יכול גם להתגלות, עבור גידול לדוגמה, אשר ניתן לאתרם מהשינוי בצורת העכבר. רחבה מעניינת נוספת היא השימוש של עכברים של צבע שונה, אשר צריך להיות פשוט, כל עוד הצבע של מבחןD יש גירוי העכבר ניגודיות טובה עם צבע קירות הכלוב רצפת הכלוב.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר יש ניסיונית חלק עיבוד תמונה. בחלק הניסוי, הצעדים החשובים ביותר הם לבדוק את התאורה ואת המיקום של הכלוב ואז להקליט את התנהגות העכבר במהלך שלושה מפגשים (אני: לבד בכלוב, שני: עם עכבר גירוי מוגבל, III: אינטראקציה בחופשיות עם גירוי עכבר). בחלק הניתוח, את השלבים הקריטיים הם לטעון תצורת סרט כלוב, לבצע עיבוד תמונה על כל מסגרת סרט כדי לקבוע עמדות אף וזנב ולאחר מכן לחשב את הסטטיסטיקה צורכת לכמת חברותיות מן מסלולי האף וזנב.
מגבלה של השיטה המתוארת היא שזה נבדק רק על עכברים עם פרווה לבנה. זה מתקבל על דעת כי הניתוח האוטומטי יעבוד באותה מידה עם צבעי פרווה אחרים כל עוד קירות המנגנון והרצפה לספקניגוד חזק עם צבע הפרווה, אבל זה לא הוכח עדיין.
מגבלה נוספת היא חוסר אוטומציה של הערכה של המושב השלישי. הקושי העיקרי עבורנו, כמו עבור קבוצות אחרות, הוא לעקוב אחר שבו עכבר הוא עכבר הבדיקה שבו עכבר הגירוי במהלך המפגשים הקרובים התכופים של העכברים. מצאנו כי אנו יכולים לפתור את הבעיה הזו עם סמנים כמו נקודות צבעוניות בין האוזניים של עכברים, אבל כל השיטות סימון שניסינו עד כה יש לפחות באזור המגורה של עכברים שינו את התנהגותם באופן משמעותי. לכן, הניתוח הנוכחי שלנו של מושב III מזהה אוטומטית את כל הגישות אבל דורש סיווג ידני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק מימון ממועצת המנהלים לחקר בריאות העמים של וירג'יניה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas cage | Norva Plastics, Norfolk, VA | custom made | Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing |
| Wire cups | Kitchen plus | 315 | Use one to house stimulus mouse, one empty |
| Video camera | SONY | HDR-PJ790 | Can be replaced by any camera with Comparable specifications |
| OpenCV (Image processing library) | Willow Garage | N/A | Any modern image processing library can be used. |
References
- Brodkin, E. S. BALB/c mice: Low sociability and other phenotypes that may be relevant to autism. Behavioural Brain Research. 176, 53-65 (2007).
- Deutsch, S. I., Burket, J. A., Urbano, M. R., Herndon, A. L., Winebarger, E. E. Impaired sociability of the BALB/c mouse, an animal model of autism spectrum disorders, is attenuated by NMDA receptor agonist interventions: clinical implications. Comprehensive Book on Autism Spectrum Disorders. Mohammadi, M. A. , InTech. Available from: http://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-book-on-autism-spectrum-disorders/impaired-sociability-of-the-balb-c-mouse-an-animal-model-of-autism-spectrum-disorders-is-attenuated 323-342 (2011).
- Dunn, M. E., Burbine, T., Bowers, C. A., Tantleff-Dunn, S. Moderators of stress in parents of children with autism. Community Mental Health Journal. 37, 39-52 (2001).
- Babineau, B. A., Yang, M., Berman, R. F., Crawley, J. N. Low home cage social behaviors in BTBR T+tf/J mice during juvenile development. Physiology & Behavior. 114-115, 49-54 (2013).
- Benson, A. D., Burket, J. A., Deutsch, S. I. BALB/c mice treated with d-cycloserine arouse increased social interest in conspecifics. Brain Research Bulletin. 99, 95-99 (2013).
- Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. Rapamycin improves sociability in the BTBR T(+)Itpr3(tf)/J mouse model of autism spectrum disorders. Brain Research Bulletin. 100, 70-75 (2014).
- Burket, J. A., Benson, A. D., Tang, A. H., Deutsch, S. I. D-Cycloserine improves sociability in the BTBR T+ Itpr3tf/J mouse model of autism spectrum disorders with altered Ras/Raf/ERK1/2 signaling. Brain Research Bulletin. 96, 62-70 (2013).
- Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. Locomotor activity of the genetically inbred BALB/c mouse strain is suppressed by a socially salient stimulus. Brain Research Bulletin. 83, 255-256 (2010).
- Deutsch, S. I., et al. D-cycloserine improves sociability and spontaneous typic behaviors in 4-week old mice. Brain Research. 1439, 96-107 (2012).
- Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Deutsch, S. I. Genetically inbred BALB/c mice differ from outbred Swiss Webster mice on discrete measures of sociability: relevance to a genetic mouse model of autism spectrum disorders. Autism Research. 4, 393-400 (2011).
- Jacome, L. F., Burket, J. A., Herndon, A. L., Cannon, W. R., Deutsch, S. I. D-serine improves dimensions of the sociability deficit of the genetically-inbred BALB/c mouse strain. Brain Research Bulletin. 84, 12-16 (2011).
- Deutsch, S. I., Burket, J. A., Jacome, L. F., Cannon, W. R., Herndon, A. L. D-Cycloserine improves the impaired sociability of the BALB/c mouse. Brain Research Bulletin. 84, 8-11 (2011).
- Shih, F. Y. Image Processing and Mathematical Morphology: Fundamentals and Applications. , CRC Press. (2009).
- Nixon, M. Feature Extraction & Image Processing. , Academic Press. (2008).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , Eighth Edition, The National Academic Press. (2011).
