Eksperimentell Vurdering av Mouse Omgjengelighet hjelp av en automatisert bildebehandling Approach

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å kvantifisere mus omgjengelighet. Mus er filmet mens de beveger seg og samhandle i en spesiell bur. Film behandling gir mulighet for automatisert kvantifisering av omgjengelighet med god nøyaktighet og pålitelighet.

Abstract

Mus er den foretrukne modellorganisme for å teste narkotika utviklet for å øke omgjengelighet. Vi presenterer en metode for å kvantifisere mus sociability som testen mus blir plassert i et standardisert anordning og relevante adferd vurderes i tre forskjellige sesjoner (kalt sesjon I, II og III).

Apparatet består av tre kamre (se figur 1), på venstre og høyre kamre inneholder en omvendt kopp som kan huse en mus (kalt "stimulus mus").

I sesjon I, blir test mus plassert i buret og dets mobilitet er karakterisert ved antallet av overganger gjort mellom kamrene. I sesjon II, er en stimulans mus plassert under en av de inverterte kopper og omgjengelighet av test musen er kvantifisert med beløpene tid det tilbringer nær koppen med vedlagte stimulans mus vs. tom omvendt kopp. I sesjon III, er de inverterte kopper fjernet en d både mus samhandle fritt. Omgjengelighet av test musen i økten III er kvantifisert med antall sosiale tilnærminger det gjør mot stimulus musen og med antall ganger den unngår en sosial tilnærming ved stimulans musen.

Den automatiserte evaluering av filmen oppdager nesen av testen mus, som tillater bestemmelse av alle beskrevet omgjengelighet tiltak i økten I og II (i session III, er tilnærminger identifiseres automatisk, men klassifisert manuelt). For å finne nesen, er bildet av en tom bur digitalt trekkes fra hver ramme av filmen og den resulterende bildet er binærisert å identifisere musen piksler. Den musehale blir automatisk fjernet, og de to mest fjerntliggende steder av de gjenværende mus bestemmes; disse er i nærheten nese og undersiden av halen. Ved å analysere musens bevegelse og ved hjelp av kontinuitets argumenter blir nesen identifisert.

"Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 52508 / 52508fig1.jpg" />
Figur 1. Vurdering av Omgjengelighet Under 3 økter Session I (øverst):.. Akklimatisering av test musen til buret Session II (i midten). Test musen beveger seg fritt i buret mens stimulans musen er omsluttet av en omvendt kopp Session III (nederst): Både test mus og stimulans mus får lov til å bevege seg fritt og samhandle med hverandre.

Introduction

Nedsatt omgjengelighet er en av de viktigste symptom domener i en rekke nevrologiske lidelser, inkludert autismespekterforstyrrelser (ASDer) ^1,2. Det begrenser alvorlig pasientens evne til å utvikle relasjoner og i stor grad påvirker pasienter, familier og omsorgspersoner ^2,3.

I et forsøk på å bedre forstå mekanismen bak svekket omgjengelighet og utvikle behandlinger, har flere musemodeller studert ^1,4-9. En slik belastning er BALB / c mus, en innavlet stamme som viser påfallende lav omgjengelighet, likner funksjonene sett hos pasienter med ASD5 ^8-12. For eksempel viser BALB / c mus en lavere frekvens av sosiale tilnærminger og en vanligvis negativ respons på sosiale tilnærminger av en stimulus mus (f.eks sosial unngåelse) enn den sveitsiske Webster komparator belastning ^10.

For å teste om en foreslått behandling er effective i økende omgjengelighet, er objektiv tiltak er nødvendige. Et allment akseptert rammeverk er å analysere den sociability i en standardisert apparat som har tre kamre (se figur 1).

Venstre og høyre avdelinger som hver inneholder en omvendt tråd cup som huser et sosialt fremtredende stimulus mus. Testen mus slippes inn i apparatet for tre intervaller på 10 min (sesjoner I-III); session jeg vurderer bevegelsesaktivitet av test mus, mens sesjoner II og III vurdere ulike aspekter av testen musens omgjengelighet.

I sesjon Jeg er testen musen akklimatiseres til apparatet. I denne sesjonen, er antallet overganger at testen musen gjør mellom de ulike avdelingene målt. Viktigere, omgjengelighet tiltak oppnås i standard tre-kammer apparat er avhengig av lokomotorisk aktivitet, og redusert lokomotorisk aktivitet kan forvirre tolkning av socievne data.

I sesjon II, er testen musen beveger seg fritt og en stimulans musen er plassert under en av de inverterte kopper (motvekts). Stimulanse mus er fire uker gamle outbred ICR hannmus, alders- og kjønns tilpasset testmusene. Den stimulus mus er innesluttet i en omvendt kopp i siden betegnet som sosial rommet, og en tom omvendt kopp er plassert i siden betegnet som nonsocial rommet. I sesjon II, er omgjengelighet av testen muse kvantifisert ved å sammenligne den tiden den tilbringer nærheten av "sosiale" omvendt kopp (mindre enn 2 cm unna) vs. tiden den tilbringer nærheten av "nonsocial" omvendt kopp, og etter den tid den tilbringer i det sosiale rommet vs. tiden den tilbringer i nonsocial rommet. Swiss Webster komparator mus bruke betydelig mer tid i det sosiale rommet og i nærheten av sosial omvendt kopp forhold til BALB / c mus som viser ingen signifikant preferanse for sosialomvendt kopp eller det sosiale rommet ^12.

I sesjon III, er test og stimulans mus lov til å samhandle fritt (inverterte kopper fjernes). Tiltak av omgjengelighet, stereotype atferd og overganger mellom avdelinger er pålitelig oppnådd i tredje 10 min økt med gratis samspill mellom test og stimulans mus og analysert. I denne rapporten er det omgjengelighet av testen muse kvantifisert via to tiltak: 1) antall sosiale tilnærminger det gjør mot stimulus mus, hvor en sosial tilnærming er definert som beveger seg fremover (nese først) mot stimulus musen slik at nesen er mindre enn 2 cm fra stimulus mus; 2) antall unngåelser av sosiale tilnærminger av stimulans musen. Testen mus anses å være å unngå tilnærming hvis det viser eller beveger seg bort fra stimulus mus, eller om det midlertidig stopper å bevege seg ( "frysing atferd") etter at stimulus musen har nærmet test musen. BALB /c-mus viser en nedgang i antall sosiale tilnærminger laget mot stimulus mus og en økning i antall av negative reaksjoner på sosiale tilnærminger av stimulus mus, sammenlignet med den sveitsiske Webster komparator belastning ^10.

Evalueringen av de atferds filmene har tradisjonelt blitt gjort manuelt, dvs. ved å se filmen nøye (muligens med redusert hastighet) og aktivere stoppeklokker for tiden musen bruker i en bestemt avdeling eller i nærheten av en av de inverterte kopper ^10. Denne metoden krever se av filmen gjentatte ganger og er derfor meget tidkrevende. Dessuten er nøyaktig begrenset av den rater reaksjonstid for stoppeklokke målinger og evne til å oppfatte hvorvidt mus er innen 2 cm fra det omvendt kopp. I senere arbeid, to forbindelser, (D-serin og D-cykloserin) har vist seg effektivt for å gjenopprette sociability i BALB / c-mus ^9,10,12. Det er kjent at begge komponenter MODUsent NMDA-reseptoren, som er kjent for å spille en sentral rolle i sosial atferd ^2,12. Et stort utvalg av forbindelser er kjent for å modulere NMDA reseptor aktivitet i en rekke veldefinerte måter, og potensialet for et gjennombrudd i ASD-behandling så rask evaluering av disse forbindelsene en prioritet og en rask automatisk metode for evaluering svært ønskelig.

Beskrevet nedenfor er en automatisk analyse prosedyre utviklet for vurdering av musen omgjengelighet. Den bruker bildebehandlings metoder på alle rammene av musen filmer for å identifisere posisjonen til mus eller mus. I sesjoner I og II, oppdager det videre nese posisjon og bruker den til å beregne omgjengelighet tiltak. I sesjon III, finner den automatisk alle tilnærminger, men manuell klassifisering (sosial tilnærming, sosial unngåelse eller annet) er påkrevd.

Protocol

Protokollen for å lette forklaringen er delt i 2 deler: 1) Eksperimentell prosedyre og 2) Automatisert analyse. Alle dyr ble behandlet i henhold til Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr ^15, og alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Eksperimentell prosedyre

1. Sett opp buret, noe som er en svart, ikke-reflekterende Plexiglas rektangulær boks (52 x 25 x 23 cm ³⁾ inndelt i tre avdelinger: sosiale, nonsocial, og en nøytral midt i kammeret (figur 1). Plasser inverterte tråd kopper i hver av ende avdelinger under øktene I og II (omtalt nedenfor) og huse stimulans musen under økten II.
2. Oppsett av kameraet på en slik måte at buret fyller synsfeltet. Etter belysning kan forstyrre mus oppførsel, opprettholde en luminans på ikke mer enn 3,5 lux på innsiden av buret, som kommer fra indirekte lys fraen gløde lyspære og måles på buret gulvet i oppadgående retning. Også bruke en infrarød lyskilde som mus ikke kan ane, men kameraet kan oppdage. Spill alle filmer i 720 x 480 standard definisjon.
3. Spill ett enkelt bilde av et tomt bur for senere bildebehandling (kalt "referanseramme") og lagre som et gråtonebilde.
4. Session I: Introduser test musen inn i buret og bølge hånden over buret, noe som indikerer starten av økten (sammenlign Automated Analysis). Vanlig film i 10 min. Ved slutten av 10 min, sett muse tilbake til sin opprinnelige bur.
5. Session II: Sett stimulus musen under en av de inverterte kopper (motvekts).
6. Bruk "Social venstre" eller "Social rett" -knappen for å velge om stimulus musen er i omvendt kopp til venstre eller i omvendt kopp til høyre.
   MERK: omvendt kopp med stimulans musen kalles "sosial cup", mens den andrecup på "nonsocial cup". I rommet i hvilket det sosiale koppen ligger kalles det sosiale kammeret, kammeret med den nonsocial koppen er det nonsocial rommet, og det midtre kammeret er "nøytral rommet".
7. Introduser test musen inn i buret. Wave hånden over buret for å indikere starten av økten. Vanlig film i 10 min. Viktigere, holde mus i omgjengelighet apparatet før du fjerner de inverterte kopper å begynne Session III.
8. Session III: Fjern de inverterte kopper, slipper både mus og la test- og stimulerings mus til å samhandle fritt med hverandre. Wave hånden over buret for å indikere starten av økten. Vanlig film i 10 min. Ved slutten av 10 min, la begge musene tilbake inn i sine respektive bur.

2. Automatisert analyse

MERK: Kommandoene i punkt 2 er gitt via et grafisk brukergrensesnitt (se figur 2) som conTrols vår programvare. Her forklarer vi trinn-for-trinn behandling som vår programvare gjør; programvaren er også i stand til å utføre analysen i batch-modus uten at brukeren må.

1. For hver film, utføre følgende prosesstrinn:
   1. Load filmen (Klikk Load knappen).
   2. Velg bur konfigurasjon, som forteller analyseprogram plasseringen av buret grenser, kupé grenser, og cup steder. Velg ett av fire lagrede konfigurasjoner eller manuelt justere alle koordinater.
      MERK: konfigurasjon vanligvis ikke endres fra ett eksperiment til det neste, og kan derfor brukes om igjen.
   3. For hver ramme av filmen, utføre følgende prosesstrinn (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Konverter rammen til gråtoner ved å klikke på "gråtoner" -knappen.
      2. Digitalt trekke gråtoner referanseramme (se trinn 1.3) ved å klikke på "Trekk" -knappen. MERK: Målet med dette trinnet er å gjøre piksel values av rammen meget nær null overalt bortsett fra mus stilling.
      3. Binarize rammen ved å sette alle piksler under et visst terskelnivå til svart, alle piksler over det nivået til hvit (klikk på "Binarize" -knappen).
         Merk: Tanken er at siden muse piksler generelt har høyere verdier enn de resterende piksler, vil musen piksler blir hvite og alle andre piksler svart. Den optimale terskelnivå avhenger av lysforhold og kan bestemmes ved å vurdere musen form gjennom en film. Dersom terskelen velges for lavt, vises mus for stor, og piksler som ikke tilhører musen kan være farget hvitt. Dersom terskelen er for høy, blir mus liten og kan gå i oppløsning i løsrevne stykker. I innspilte filmer, den optimale terskelen var alltid mellom 20 og 35 (på en skala fra 0 til 255).
      4. Erodere ¹³ det binæriserte bilde e ganger, deretter utvider seg ¹³ 2e ganger, deretter erode igjen e ganger, ved å trykke på knappen "EROD / Dil".
         Merk: Formålet til denne fremgangsmåten er å fjerne halen. For oppløsning (720 x 480) som ble anvendt, e = 3 arbeidet i alle situasjoner.
         Merk: Programvaren sjekker automatisk for tilstedeværelsen av en hånd i bildet (under innspillingen av filmer, er hendene vinket gjennom bildet for å angi begynnelsen av en økt). Hvis en hånd er til stede, vil det være usedvanlig mange hvite piksler i det binæriserte ramme fordi hånden er mye større enn en mus. Betingelsen for tilstedeværelsen av en hånd, er at det er mer enn 10.000 hvite piksler i binærisert ramme. Programvaren bestemmer begynnelsen av sesjoner I, II, og III, ved å registrere omfanget av rammer hvor håndbevegelser forekommer.
2. I sesjoner I og II, fortsett som følger:
   1. Oppdage den største tilkoblede komponenten av settet av hvite piksler (Klikk "LComp"). Merk: Formålet of dette trinnet er å fjerne hvite piksler som ikke tilhører til musen, for eksempel forårsaket av bevegelse av stimulus mus i sesjon II. Den største tilkoblede komponenten er i nesten alle rammer musen.
   2. Bestem de to mest fjernt hvite piksler (kalt "ender" av musen) ved å klikke på "Finn Slutter".
      Merk: Programvaren etablerer kontinuiteten av de to endene, dvs. for hver av endene i den første rammen til hvilke av endene i de påfølgende rammer de tilhører. Den generelle ideen er at siden bildene registreres i høy hastighet, kan endene ikke reise langt fra en ramme til den neste, slik at for korrekt videreføring av endene fra ett bilde til det neste er den som minimerer summen av avstandene som endene flytte. Se diskusjon for flere detaljer.
   3. Bestem hvilken ende av musen er nesen.
      1. Bestemme retningen i hvilken et musen beveger seg ved å observere hvordan tyngdepunktet (COG)endringer fra bilde til bilde (COG bevegelse er bevegelse av summen av alle muse piksler).
         Merk: Den COG av et sett med piksler p _1, ..., p _n med koordinater x _1, .., x _n er definert ved:
         
         Mus vanligvis bevege seg fremover (dvs. mot nesen). I en seksjon av flere hundre rammer, er det alltid meget høy tiltro til hode / hale deteksjon.
         Merk: Programvaren bestemmer automatisk mot hvilken av de oppdaget ender musen beveger seg; dette formål er identifisert som nesen og merket med en rød sirkel i filmen. Når oppdaget nesen er markert med en rød sirkel i hver ramme, kan brukeren kontrollere kvaliteten på gjenkjenning.
3. I sesjon III, fortsett som følger:
   1. Oppdage to største komponentene i hvite piksler.
      1. Hvis begge er av akseptabel størrelse for amOuse og deres tyngdepunkter (tannhjul) er kompatible med musen hjul av forrige bilde, vurdere disse to komponentene de to mus.
      2. Tenk mus størrelser akseptabelt hvis de ikke har endret seg med mer enn 20% siden forrige ramme, og vurdere tannhjul av to etterfølgende rammer som kompatibel dersom forskjellen ikke er større enn avstanden en mus kan reise i tiden mellom rammer (denne avstanden følger fra den maksimale hastighet mus, noe som kan bestemmes som en del av forberedelsene for et eksperiment serie ved å analysere bevegelse av flere individuelle mus (som i sesjoner i og II).
         Merk: Hvis de to største komponentene ikke er akseptable størrelser for en mus, eller hjul er for forskjellige fra de i den forrige rammen, øker programvaren automatisk todelingen terskelen til de to største komponentene er av akseptabel størrelse og sine hjul er kompatible med de av den foregående rammen.
   2. Klikk på test musen pådet første bildet. Bruk analysen i 2.3.1 å identifisere både test og stimulans mus i hver ramme av økten III.
   3. Identifisere rammene i sesjon III hvor en mus sosialt nærmer seg den andre. Merk: Programvaren implementerer dette trinnet ved automatisk å se at avstanden mellom musene er mindre enn den typiske interaksjonen avstand fra mus (vi bruke 2 cm).
   4. Når programvaren spiller en kort segment av filmen med påvist tilnærming til brukeren klikker på en knapp for å angi om denne tilnærmingen kvalifiserer som en sosial tilnærming av testen mus, sosial unngåelse av test musen, eller ingen av delene.
      Merk: Trinn 2.3.4 kan automatiseres hvis det er kjent som mus er testen mus. Siden denne informasjonen blir borte når musene kommer for nær hverandre (eller klatre oppå hverandre), og siden vi har ennå ikke funnet en måte å merke mus på en måte som kan oppdages pålitelig av vår programvare og gjør ikke påvirke deres atferd, har vi gått tilbake tilmanual klassifisering for nå.
4. For å evaluere bearbeidede filmer, last film hjelp Load knappen.
   1. Klikk på Start-Session 1 for å vise det første bildet av økten en (eller Start for Session 2 for å vise det første bildet av sesjon 2).
   2. Klikk på Start / Stopp for å spille og stoppe filmer.
      Merk: bearbeidet filmene vil vise mus med hode og hale merket med forskjellig fargede sirkler. Alle omgjengelighet tiltak vises på skjermen, og oppdateres etter hvert som filmen spilles.
   3. Export omgjengelighet data i Excel-format ved å klikke på "Export".
   4. Klikk på "Compile data" å samle alle data av alle filmer i en mappe i en enkelt Excel-fil.

Representative Results

Figur 3 viser en farge ramme av en atferdsmessig film med et tomt bur. Musen har ikke blitt introdusert inn i buret ennå. Posisjonen av kopper, (sosiale og nonsocial) og seksjonsgrenser blir overlagret. Fargen rammen av tomme bur blir omdannet til 8-bits gråskala som vist i figur 4 og benyttes som en referanse ramme. Referanserammen er subtrahert fra alle andre ramme av den fangede filmen.

Figur 5 viser en av rammene fra filmen under økten jeg, igjen med seksjonsgrenser og cup stillinger lagret. Referanserammen er subtrahert fra prøve ramme og resultatet, kalt forskjellen ramme, er vist i figur 6.

Figur 7 er det binæriserte versjon av forskjellen rammen. (Se avsnitt 2.1.3.3). Figuren viser også posisjonen av nesen (rød sirkel) og undersiden av TAil (grå sirkel), som fastsatt i § 2.2.4).

Når nesen stilling er etablert for hver ramme av filmen, kan banen til mus analyseres på hvilken som helst ønsket måte. Figur 8 viser posisjonene til mus nesen (hvite sirkler) for en del av filmen som dekker ca 1000 rammer (~ 30 sek).

Figur 9 viser resultatet av en analyse for sociability sesjon I. Antallet overganger mellom buret avdelingene blir brukt som et mål på bevegelsesaktivitet (i det viste eksempel 59 overganger i 10 min indikere normal lokomotorisk aktivitet). Tiden i ulike deler av buret fungere som baseline å bedømme preferanse for sosial rommet / cup i session II.

Figur 10 viser resultatet av sociability analyse for økt II. Av spesiell interesse er de ganger brukt nær sosial vs. nonsocial cup (i vist EXAmple 230,8 vs 72,3 sek) og det sosiale vs. de nøytrale og nonsocial avdelinger (314.7 g 109,4 g 185,5 sek). Den klare forspenning mot sosial koppen og kammeret er typisk for kontrollmus, og sammenlignet med data fra sesjon I (figur 9) viser klart at forspenningen virkelig er et resultat av tilstedeværelsen av et stimulus mus.

Figur 11 viser resultatet av sociability analyse for økt III. Det høye antallet sosiale tilnærminger (35 i 10 min), samt de overveldende positive reaksjoner på sosiale tilnærminger av stimulus mus (9/10) er typisk for mus med normal omgjengelighet.

Figur 2. Graphical User Interface. Vennligst cslikke her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Tomme Cage. Dette brukes som en referanse ramme etter omdannelse til grå skala. Den røde sirkelen viser plasseringen av den sosiale cup og nonsocial cup i motsatt side. De vertikale hvite streker deler buret inn i forskjellige rom og rektangelet viser den indre grense av buret.

Figur 4. gråtoner versjon av figur 3.

Figur 5. opprinnelige rammen. En film ramme i gråtoner format. Den sosiale sylinder er preget av en hvit sirkel, ogen ytterligere grå sirkel med en radius på 2 cm større enn den for det sosiale sylinderen er trukket for å avgrense området som testen musen anses som "nær" til det sosiale sylinderen. I motsatt hjørne, er nonsocial sylinder preget av en grå sirkel og igjen, en ekstra sirkel med en 2 cm større radius er trukket for å avgrense området som regnes nær nonsocial sylinder. De vertikale hvite streker deler buret inn i forskjellige rom og rektangelet viser den indre grense av buret.

Figur 6. Forskjellen bilde. Bilde oppnådd ved å subtrahere referanserammen fra prøven rammen.

Figur 7. binæriserte bildet. Pikslene av difference bilde som overskrider en bestemt terskel (30 i dette eksemplet) er ansett som de mus piksler, og er vist hvitt. Den røde sirkelen betegner nesen og hvite sirkelen er halen.

Figur 8. Mus bane. De små hvite sirklene viser plasseringen av nesen fra starten av økten jeg inntil denne rammen ble tatt til fange.

Figur 9. Resultater av Omgjengelighet Analyse for sesjonen I. Tallene over de respektive bur kamrene indikerer ganger mus brukt i dem (i dette tilfellet 254,3 sek i det venstre kammeret, 155,2 sek i den nøytrale rommet, og 237,0 sek i riktig kupé). Tallene inne i sirklene indikerer ganger musen brukte nær respective kopp ( "close" betyr mindre enn 2 cm, eller inne i den ytre av de to sirkler): 140,0 sek nær den venstre koppen, og 105,6 sek nær den høyre koppen. Tallet i nederst i midten indikerer hvor ofte musen overført mellom de ulike avdelingene i buret (59 ganger i eksempelet).

Figur 10. Resultater av Omgjengelighet Analyse for Session II. Tallene ovenfor avdelingene og inne sirklene indikerer ganger brukt i annen del av buret som i figur 9 / sesjon I. Merk at i sesjon II, er det en stimulans mus i en av inverterte kopper (til venstre en i dette tilfellet), så denne koppen blir "sosial" cup. I tillegg til de tiltak av økten jeg, når testen musen tar å komme nær (innen to cm) til sosiale sylinder for første gang er gittnederst til høyre for sentrum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 11. Resultater av Omgjengelighet Analyse for Session III. Tallet etter "Approach" angir antall sosiale tilnærminger gjort av testen musen, tallene etter "pos. Resp. "Og" Neg. Resp. "State antall positive og negative reaksjoner fra testen musen til sosiale tilnærminger av stimulans musen.

Discussion

Ved å kombinere videoopptak mus og automatiske filmanalyse, har vi skapt en rimelig, pålitelig høy gjennomstrømming screening teknikk.

Nøyaktigheten av automatisert analyse ble sammenlignet med resultatene fra manuell analyse for mer enn 100 filmer. I det overveldende flertall av rammer (> 99%) av rammer, er nesen til mus identifisert med god presisjon. De fleste av de (få) misdetections har ingen effekt på omgjengelighet tiltak, slik at rundt 80% av filmene ikke krever noen rettelser.

I de filmene som ikke inneholder misdetections, langt den vanligste problemet er at hode og hale er forvirret, så vi har inkludert i programvaren er en enkel måte å bytte hode og hale for en film segment. Selv om filmene er sett til å se etter og rette alle misdetections, kan denne kontrollen gjøres på ca 3 ganger sanntid hastighet, slik at evalueringen tiden fortsatt er svært kort. De delene av filmenhvori mus ikke er nær en av sylindrene kan sees på enda høyere hastighet.

Avtalen mellom alle automatisk og manuelt bestemt omgjengelighet tiltak er utmerket (forutsatt at eventuelle misdetections har blitt korrigert). Faktisk kvaliteten på automatisk bestemt omgjengelighet tiltak er bedre enn manuelt bestemt seg, fordi objektive kriterier er konsekvent brukt til å bestemme avstander og tider, mens manuell evaluering lider av grensene for menneskelig persepsjon og reaksjonstid. Disse grensene blir mer alvorlig med høyere betraktnings hastigheter som er ønskelig for å begrense beregningstiden.

Notat om trinn 2.2.2 .: Denne rutine er implementert ved å redusere mengden av hvite piksler til sin grense ved bruk av standard bildeprosesseringsverktøy ¹⁴ og beregning av avstand mellom to grensepiksel. Å finne de mest fjerntliggende punkter er nyttig fordi nesen og halerotentendens til å være meget nær disse to ender.

For fullstendighets skyld skal gjennomføringen av kontinuiteten av endene (trinn 2.3.4) er beskrevet nedenfor. I en gitt ramme med ender c og d og en foregående ramme med endene a og b, om c tilhører en og d til b eller c tilhører B og D til en (se figur 12).

Figur 12. Kontinuitet Bestemmelse. Mus i lys grå farge med nesen og halen merket som a og b er henholdsvis utgangsposisjonen. Mus i hvit farge med nesen hale merket c og d er henholdsvis plasseringen av mus i den neste ramme.

Den generelle ideen er at for riktig fortsettelsen, summen av avstandene reist av endene er mindre enn for feil fortsettelsen, fordi musa reiser mindre enn sin egen lengde fra ett bilde til det neste. I eksempelet (figur 2 δ ₁ = | c - a |, δ ₂ = | d - b |, Δ ₁ = | c - b |, og Δ ₂ = | d - a |, og si at fordi δ ₁ + δ ₂ <Δ ₁ + Δ _2, er den riktige videreføring en → c og b → d. Et godt mål for tilliten til en slik bestemmelse er forholdet r = max (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ ₂₎ / min (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ _2), som beskriver hvor mye mer endene ville reise i en continuationn versus den andre. Per definisjon er større eller lik 1. For langstrakte muse former r, r vanligvis større enn 10, hvis musa formen blir mer sirkulær (f.eks fordi musen står på bakbena), kan r komme nær en og videreføring er upålitelig. For pålitelig videreføring, har en terskel på r> 2,5 blitt brukt. Med denne terskel, delene av rammene over hvilken kontinuiteten av endene er etablert, er typisk i området fra flere hundre til tusenvis av rammer. For hver seksjon, bestemme mot hvilken ende musen beveger seg innenfor en seksjon. Når kontinuitet i en seksjon er etablert, vil "tyngdepunktet" (COG, gjennomsnittlig koordinatene til alle mus piksler) for hver ramme i den delen blir bestemt. Forskjellen i COG fra en ramme til den neste definerer hastigheten til musen mellom de to rammer. Denne hastigheten blir projisert på vektoren som forbinder de to endene for å se om og hvor mye musen beveger slepeARDS den første eller mot den andre enden. Den totale bevegelse (som enten mot det første eller det andre ende) er summering av bevegelser av alle rammer.

Denne protokoll kan modifiseres på flere måter å løse ulike eksperimentelle behov. Hvis ulike aspekter av musens bevegelse (f.eks gjennomsnittshastigheten) er av interesse, kan disse hentes ut fra den beregnede musen banen. Hvis lysforholdene er svært forskjellige fra de som er beskrevet her, kan terskelen i binarization trinnet som gir musen piksler justeres. Selv endringer som en annen bur form kan gjennomføres ved å endre vår nåværende bur konfigurasjon rutine.

Den beskrevne programvare tidvis forvirrer hode og hale (i mindre enn 20% av filmene, er det behov for korrigering fordi hodet / halen flip vil påvirke vår evaluering). Vi skrev et praktisk verktøy som gjør det mulig for brukeren å identifisere den første og the siste bildet i intervallet der hode og hale behov for å være snudd, og deretter utføre denne korrigeringen med ett klikk. Svært få filmer (noen få prosent) hadde andre enn hode / hale flip problemer, for disse har vi gjort en mer generell korreksjon verktøy som gjør det mulig for brukeren å spesifisere i hvilken del av buret testen musen nesen er under enhver intervall. Legg merke til at behovet for korreksjon inntreffer så sjelden at effekten på evaluering tid er liten.

Planlagte utvidelser av protokollen skal også detektere mer sosialt relevante atferd, for eksempel forfølge og anogenital sniffing (som kan påvises ved å overvåke avstanden fra nesen av test mus til kroppen og anus av stimulus mus, henholdsvis). Stereotype oppførsel kan også være påvisbart, for eksempel stell, som kan oppdages fra endringen i mus form. En annen interessant forlengelse er bruken av mus av forskjellig farge, som skal være med, så lenge fargen på test end stimulans mus har god kontrast med fargen på bur vegger og bur gulvet.

Oppsummert har den beskrevne protokoll et eksperimentelt og et bildebehandlings del. I forsøket del, de viktigste trinnene er for å kontrollere lys og posisjonering av buret, og deretter til å registrere mus oppførsel under tre behandlinger (I: alene i bur, II: med begrenset stimulus mus, III: fritt i samspill med stimulus mus). I analysen del, de kritiske trinn er å laste en film og bur konfigurasjon, for å utføre bildeprosessering på hver film ramme for å bestemme nese og hale stillinger, og deretter for å beregne statistikk som er nødvendige for å kvantifisere sociability fra nese og hale baner.

En begrensning av den beskrevne metode er at det bare har blitt testet for mus med hvit pels. Det står til grunn at den automatiserte analysen vil fungere like godt med andre pels farger så lenge apparater vegger og gulv gisterk kontrast med pels farge, men dette er ennå ikke klarlagt.

En annen begrensning er mangelen på automatisering av evalueringen av økten III. Den store problemer for oss, som for andre grupper, er å holde oversikt over hvilke mus er testen mus og som stimulans musen under de hyppige nærkontakt av musene. Vi har funnet ut at vi kan løse dette problemet med markører som fargede prikker mellom mus ører, men alle de merkemetoder som vi har prøvd så har langt irritert minst en del av musene og endret sin atferd vesentlig. Derfor vår nåværende analyse av økt III registrerer automatisk alle tilnærminger, men krever manuell klassifisering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.