Experimentell Bedömning av mus Sällskaplighet hjälp av en automatiserad bildbehandling Approach

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att kvantifiera mus sällskaplighet. Möss videofilmas när de rör sig och interagerar i en särskild bur. Filmbearbetning möjliggör den automatiserade kvantifiering av sociability med utmärkt noggrannhet och tillförlitlighet.

Abstract

Musen är den föredragna modellorganism för att testa läkemedel som syftar till att öka trevnad. Vi presenterar en metod för att kvantifiera mus sällskaplighet i vilket test mus placeras i en standardiserad apparat och relevanta beteenden bedöms i tre olika sessioner (kallas sessions I, II, och III).

Apparaten har tre fack (se figur 1), innehåller en inverterad bägare som rymmer en mus (som kallas "stimulus mus") vänster och höger fack.

I session I skall testmus placeras i buren och dess rörlighet kännetecknas av antalet övergångar som har gjorts mellan fack. I session II, en stimulus mus placeras under en av de inverterade koppar och den sociala biten av test musen kvantifieras med de belopp tid det spenderar nära koppen innehåller den medföljande stimulans musen mot den tomma inverterade koppen. I session III, är de inverterade kopparna bort en d både möss interagera fritt. Den sociala biten av test musen i session III kvantifieras genom antalet sociala strategier det gör mot stimulans musen och antalet gånger man undviker en social strategi från stimulans musen.

Den automatiserade utvärdering av filmen detekterar nos testmus, vilket medger bestämning av alla beskrivna Sällskaplighet åtgärder i sessionen I och II (i session III skall tillvägagångssätt identifieras automatiskt men som klassificeras manuellt). För att hitta näsan, är bilden av en tom bur digitalt subtraheras från varje bildruta i filmen och den resulterande bilden är binär att identifiera musen pixlar. Musen svans automatiskt bort och de två mest avlägsna punkter för de kvarvarande mus bestäms; dessa är nära näsa och svansroten. Genom att analysera rörelsen hos musen och med användning av kontinuitets argument, är näsan identifieras.

"Figur 1" src = "/ filer / ftp_upload / 52.508 / 52508fig1.jpg" />
Figur 1. Bedömning av Sällskaplighet Under 3 sessioner Session I (överst).. Acklimatisering av test mus till buren Session II (mitten). Test mus röra sig fritt i buren medan stimulans musen är innesluten i en inverterad kopp Session III (botten): Både prov mus och stimulans mus tillåts röra sig fritt och interagera med varandra.

Introduction

Nedsatt sällskaplighet är en av de primära symptom domäner i en rad störningar av nervsystemets, inklusive autismspektrumstörningar (ASD) ^1,2. Det begränsar allvarligt patienternas förmåga att utveckla relationer och kraftigt påverkar patienter, familjer och vårdgivare ^2,3.

I ett försök att bättre förstå mekanismen bakom försämrad sällskaplighet och utveckla behandlingar har flera musmodeller studerats ^1,4-9. En sådan stam är Balb / c-mus, en inavlad stam som uppvisar påfallande låg sällskaplighet, som liknar funktioner ses hos patienter med ASD5 ^8-12. Till exempel visar BALB / c-mus en lägre frekvens av sociala metoder och en vanligtvis negativt svar på sociala strategier genom en stimulus mus (t.ex. social undvikande) än den schweiziska Webster jämförelse stam ^10.

För att testa om en föreslagen behandling är effective öka sällskaplighet behövs objektiva mått. En allmänt accepterad ram är att analysera den sociala biten i ett standardiserat anordning som har tre fack (se figur 1).

De vänstra och högra fack vardera innehåller en inverterad tråd cup som inrymmer ett socialt framträdande stimulans mus. Test musknappen släpps in i anordningen i tre intervaller av 10 min (sessioner I-III); session I bedömer rörelseaktiviteten hos test mus, medan sessioner II och III utvärdera olika aspekter av testet musens sällskaplighet.

I session I skall testmus får acklimatisera till anordningen. I denna session, är antalet övergångar att test musen gör mellan de olika avdelningarna mäts. Viktigt är sällskaplighet åtgärder som erhållits i standard tre fack apparat beroende rörelseaktivitet och minskad rörelseaktivitet kan förbrylla tolkningen av sociförmåga data.

I session II testet musen röra sig fritt och en stimulans mus placeras under en av de inverterade koppar (motvikts). Stimulans möss är fyra veckor gamla utavlade ICR möss, ålders- och könsmatchade till testmöss. Stimulans musen är innesluten i en inverterad kopp i den sida som betecknas som den sociala utrymmet, och en tom inverterad kopp är placerad i den sida som betecknas som den nonsocial utrymmet. I session II den sociala biten av test musen kvantifieras genom att jämföra den tid man spenderar nära "social" inverterad kopp (mindre än 2 cm) vs tid man spenderar nära "nonsocial" inverterade koppen, och när det tillbringar i social facket mot den tid det tillbringar i nonsocial facket. Swiss Webster jämförelsemöss tillbringar betydligt mer tid i det sociala facket och nära sociala inverterade koppen jämfört med BALB / c-möss som inte visar någon signifikant preferens för socialainverterad kopp eller sociala facket ^12.

I session III, provnings- och stimulans möss tillåts att interagera fritt (inverterade koppar avlägsnas). Åtgärder av sällskaplighet, stereotypa beteenden och övergångar mellan fack tillförlitligt erhålls i den tredje 10 min session fri växelverkan mellan prov och stimulans möss och analyserades. I denna rapport, är den sociala biten av test mus kvantifieras via två åtgärder: 1) antalet sociala strategier det gör mot stimulans mus, där en social strategi definieras som rör sig framåt (nosen först) mot stimulans musen så att näsa är mindre än 2 cm från stimulans mus; 2) antalet undvikanden av sociala metoder vid stimulans musen. Testet musen anses undvika strategi om det visar eller flyttar bort från stimulus mus, eller om det tillfälligt slutar röra ( "frysning beteende") efter stimulans musen har närmat testet musen. BALB /c-möss visar en minskning av antalet sociala strategier som gjorts mot stimulans mus och en ökning av antalet negativa svar på sociala åtgärder från stimulans mus, jämfört med den schweiziska Webster jämförelse stam ^10.

Utvärderingen av beteende filmer har traditionellt gjorts manuellt, det vill säga genom att titta på filmen noggrant (möjligen med reducerad hastighet) och aktivera stoppur för den tid musen tillbringar i en viss avdelning eller i närheten av en av de inverterade kopparna ^10. Denna metod kräver att titta på filmen flera gånger och är därför mycket tidsödande. Dessutom är noggrannheten begränsad av kodarens reaktionstid för stoppuret mätningar och förmåga att uppfatta huruvida musen är inom 2 cm av den inverterade koppen. I senare arbete, två föreningar, (D-serin och D-cykloserin) har visat sig vara effektivt för att återställa sociability i BALB / c-möss ^9,10,12. Det är känt att både komponenter modusen NMDA-receptorn, som är känd för att spela en central roll i socialt beteende ^2,12. En stor mängd föreningar är känd för att modulera NMDA-receptoraktivitet i en mängd olika väl definierade sätt, och potentialen för ett genombrott i ASD behandling gör skyndsam utvärdering av dessa föreningar en prioritet och en snabb automatisk metod för utvärdering högst önskvärt.

Nedan beskrivs en automatisk analysförfarandet utvecklats för bedömning av mus sällskaplighet. Den använder bildbehandlingsmetoder på alla ramar av musen filmer för att identifiera positionen för mus eller möss. I sessioner I och II, upptäcker ytterligare näsa ställning och använder den för att beräkna sällskaplighet åtgärder. I session III, upptäcker automatiskt alla metoder, men manuell klassificering (social strategi, social undvikande, eller annat) krävs.

Protocol

Protokollet för att underlätta förklaringen har delats upp i 2 delar: 1) Försöksförfarande och 2) Automatiserad analys. Samtliga djur behandlades enligt handledningen för vård och användning av försöksdjur ^15, och alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Försöksförfarande

1. Ställ in i buren, som är en svart icke-reflekterande Plexiglas rektangulär låda (52 x 25 x 23 cm ³⁾ uppdelad i tre avdelningar: sociala, nonsocial och en neutral mellersta facket (Figur 1). Placera inverterade tråd koppar i var och en av slut facken under sessioner I och II (diskuteras nedan) och inrymma stimulans musen under sessionen II.
2. Ställa in kameran på ett sådant sätt, att buren fyller synfältet. Eftersom belysning kan störa mus beteende, upprätthålla en luminans på högst 3,5 lux inne i buren, kommer från indirekt ljus frånen glödlampa och uppmätt på burgolvet i uppåtgående riktning. Också använda en infraröd ljuskälla, som möss inte kan känna men kameran kan upptäcka. Spela in alla filmer i 720 x 480 standard definition.
3. Spela in ett enda bildruta av en tom bur för senare bildbehandling (kallas "referensramen") och spara som en gråskalebild.
4. Session I: Introducera testmus in i buren och våg hand över buren, vilket indikerar början av sessionen (jämför automatiserad analys). Spela in film i 10 minuter. Vid slutet av 10 minuter, satte musen tillbaka till sin ursprungliga bur.
5. Session II: Placera stimulus mus under en av de inverterade koppar (motvikts).
6. Använd eller "social rättighet" knappen "Social vänster" för att välja om stimulans musen i den inverterade koppen på vänster eller i den omvända koppen till höger.
   OBS: Den inverterade koppen med stimulans musen kallas "social cup", medan den andracup den "nonsocial cup". Facket där sociala koppen ligger kallas sociala facket, facket med nonsocial koppen är nonsocial facket, och det mellersta facket är "neutral rummet".
7. Introducera testmus in i buren. Våg handen över buren för att indikera början av sessionen. Spela in film i 10 minuter. Viktigt är att hålla möss i den sociala biten apparaten innan du tar bort de inverterade cups att börja Session III.
8. Session III: Ta bort de inverterade koppar, släpp både möss och låta test och stimulans möss för att interagera fritt med varandra. Våg handen över buren för att indikera början av sessionen. Spela in film i 10 minuter. Vid slutet av 10 minuter, satte både möss tillbaka i sina respektive burar.

2. automatiserad analys

OBS: Kommandona i avsnitt 2 utfärdas via ett grafiskt användargränssnitt (se figur 2) som conTrols vår programvara. Här förklarar vi steg-för-steg behandling som vår programvara tillåter, programvaran är också i stånd att utföra analysen i batch-läge utan användarinmatning.

1. För varje film, utföra följande processteg:
   1. Last film (klicka på knappen).
   2. Välj bur konfiguration, som berättar analysprogrammet placeringen av buren gränser, fackgränser och kopp platser. Välj en av fyra sparade konfigurationer eller manuellt justera alla koordinater.
      NOTERA: Konfigurationen vanligtvis inte ändras från ett experiment till nästa och kan därför återanvändas.
   3. För varje bildruta i filmen, utföra följande behandlingssteg (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Konvertera ramen till gråskala genom att klicka på "gråskala" -knappen.
      2. Digitalt subtrahera gråskala referensramen (se steg 1,3) genom att klicka på "Subtrahera" -knappen. OBS: Målet med detta steg är att göra de va pixelLues av ramen mycket nära noll överallt utom för musens position.
      3. Binärisera ramen genom att alla bildpunkter under en viss tröskelnivå för svart, alla bildpunkter över denna nivå till vitt (klicka på "binärisera" -knappen).
         Obs: Tanken är att eftersom musen pixlar har i allmänhet högre värden än de återstående pixlarna kommer musen pixlar blir vita och alla andra pixlar svart. Den optimala tröskelnivån är beroende av ljusförhållandena och kan bestämmas genom att bedöma musformen hela en film. Om tröskelvärdet väljs för lågt, visas musen för stor, och pixlar som inte hör till musen kan färgas vitt. Om tröskeln är för hög, blir musen små och kan upplösas i osammanhängande bitar. I inspelade filmer, var den optimala tröskeln alltid mellan 20 och 35 (på en skala från 0 till 255).
      4. Erodera ¹³ den binariserade bild e gånger, sedan vidgas ¹³ 2e gånger, sedan erode återigen e gånger, genom att trycka på knappen "EROD / Dil".
         Obs: Syftet med detta förfarande är att ta bort svansen. För upplösning (720 x 480) som användes, e = 3 arbetade under alla omständigheter.
         Obs: Programmet kontrollerar automatiskt för närvaron av en hand i bilden (under inspelning av filmer är händer vinkade genom bilden för att indikera början av en session). Om en hand är närvarande, kommer det att finnas ovanligt många vita pixlar i den binariseramen eftersom handen är mycket större än en mus. Villkoret för närvaron av en hand är att det finns mer än 10.000 vita bildpunkter i binäriseras ramen. Mjukvaran bestämmer början av sessioner I, II, och III, genom att detektera de olika ramar i vilka handrörelser uppstå.
2. I sessioner I och II, fortsätter enligt följande:
   1. Identifiera den största anslutna komponenten av uppsättningen av vita pixlar (Klicka på "LComp"). Obs: Syftet of detta steg är att eliminera vita pixlar som inte hör till musen, t.ex., som orsakas av rörelse av stimulus mus i session II. Den största anslutna komponenten är i nästan alla ramar musen.
   2. Bestäm de två mest avlägsna vita pixlar (kallade "ändarna" på musen) genom att klicka på "Sök Ends".
      Obs: Programvaran fastställer kontinuiteten i de två ändarna, dvs, för var och en av ändarna i den första ramen till vilken av ändarna i de efterföljande ramar de tillhör. Den allmänna idén är att eftersom bilderna registreras vid hög hastighet, kan ändarna inte resa långt från en ram till nästa, så att för en korrekt fortsättning av ändarna från en ram till nästa är den som minimerar summan av de avstånd som ändarna flytta. Se diskussionen för mer information.
   3. Bestämma vilken ände av musen är näsan.
      1. Bestämma den riktning i vilken en mus rör sig genom att observera hur tyngdpunkt (COG)ändras från ram till ram (COG: s rörelse är den rörelse av summan av alla mus bildpunkter).
         Obs: Den COG av en mängd av pixlar p _1, ..., p _n med koordinater x _1, .., _Xn definieras av:
         
         Möss flyttar oftast framåt (dvs mot sin näsa). I ett avsnitt av flera hundra ramar, det finns alltid mycket hög tilltro till huvud / svans-detektering.
         Obs: Programmet avgör automatiskt mot vilken den detekterade avslutar musen rör sig; Därför identifieras som näsan och markerad med en röd cirkel i filmen. När den detekterade näsan är markerad med en röd cirkel i varje ram, kan användaren kontrollera kvaliteten på detekteringen.
3. I session III, fortsätter enligt följande:
   1. Detektera två största komponenterna i vita pixlar.
      1. Om båda är av acceptabel storlek för amouse och deras tyngdpunkter (KSV) är kompatibla med mus kuggar hos den tidigare ramen, betrakta dessa två komponenter de två möss.
      2. Betrakta musen storlekar acceptabelt om de inte har ändrats med mer än 20% sedan den föregående ramen, och överväga kuggar av två på varandra följande ramar som förenligt om deras skillnaden är inte större än avståndet en mus kan resa i tiden mellan ramar (detta avstånd följer från högsta mus hastighet, som kan bestämmas som en del av förberedelserna för ett experiment serie genom att analysera rörelsen hos flera individuella möss (som i sessioner i och II).
         Obs: Om de två största komponenterna är inte acceptabla storlekar för en mus eller kuggarna är alltför annorlunda än i den föregående ramen, ökar mjukvaran automatiskt tröskeln binärisering tills de två största komponenterna är av godtagbar storlek och deras kuggar är kompatibla med de av den föregående ramen.
   2. Klicka testet musen iden första bilden. Använd analysen i 2.3.1 för att identifiera både test och stimulans mus i varje bildruta av sessionen III.
   3. Identifiera ramarna i session III där en mus socialt närmar sig varandra. Obs: Programvaran implementerar detta steg genom att automatiskt kontrollera att avståndet mellan möss är mindre än den typiska interaktionsavstånd från möss (vi använder 2 cm).
   4. När programvara spelar en kort segment av filmen med den detekterade strategi för användaren, klicka på en knapp för att ange om detta tillvägagångssätt betraktas som ett socialt synsätt av test mus, social undvikande av test musen, eller ingetdera.
      Obs: Steg 2.3.4 kan automatiseras om det är känt vilken mus är testet musen. Eftersom denna information går förlorad när mössen komma för nära varandra (eller klättra ovanpå varandra), och eftersom vi har ännu inte hittat ett sätt att märka mössen på ett sätt som kan detekteras på ett tillförlitligt sätt genom vår programvara och gör inte påverka deras beteende, har vi återgått tillmanuell klassificering för nu.
4. För att utvärdera bearbetade filmer, last film med hjälp av utmatningsknappen.
   1. Klicka på Start Session 1 för att visa den första bildrutan av sessionen 1 (eller Start Session 2 för att visa den första bildrutan av sessionen 2).
   2. Klicka på knappen Start / Stopp för att spela upp och stoppa filmer.
      Obs: De bearbetade filmer visas musen med huvud och svans märkt med olikfärgade cirklar. Alla sällskaplighet åtgärder visas på skärmen och uppdateras allteftersom filmen spelas upp.
   3. Export sällskaplighet data i Excel-format genom att klicka på "Export".
   4. Klicka på "samla in uppgifter" att sammanställa alla uppgifter om alla filmer i en mapp till en enda Excel-fil.

Representative Results

Figur 3 visar ett färg ram i en beteende film med en tom bur. Musen har inte införts i buren ännu. Placeringen av koppar, (sociala och nonsocial) och utrymmet gränserna är överlagrade. Färgen ram tom bur omvandlas till 8 bitars gråskala som visas i figur 4 och används som en referensram. Referensramen subtraheras från varannan ram från den inspelade filmen.

Figur 5 visar en av ramarna från filmen under sessionen I, återigen med fackgränser och kopp positioner överlagrade. Referensramen subtraheras från provramen och resultatet, som kallas skillnaden ramen, visas i figur 6.

Figur 7 är den binariserade versionen av skillnaden ramen. (Se avsnitt 2.1.3.3). Figuren visar också läget för nosen (röd cirkel) och basen av den TAil (grå cirkel), bestämd enligt punkt 2.2.4).

När näsan läget upprättas för varje bildruta i filmen, kan banan för musen analyseras på något önskat sätt. Figur 8 visar positionerna för musen näsan (vita cirklar) för en del av filmen som omfattar cirka 1000 bilder (~ 30 sek).

Figur 9 visar resultatet av en sällskaplighet Analys för sessions I. Antalet övergångar mellan bur fack används som ett mått på rörelseaktiviteten (i det visade exemplet, 59 övergångar i 10 min ange normal rörelseaktivitet). Tiden i olika delar av buren fungera som en baslinje för att bedöma preferens för sociala facket / cup i session II.

Figur 10 visar resultatet av den sociala biten Analys för sessionen II. Av särskilt intresse är de tider förbrukade nära den sociala vs. nonsocial kopp (i det visade example 230,8 vs 72,3 sek) och sociala kontra de neutrala och nonsocial fack (314,7 jämfört med 109,4 jämfört med 185,5 sek). Den klara inriktning mot social cup och fack är typiska för kontrollmöss, och jämförelse med data från sessionen I (Figur 9) visar tydligt att fördomar är verkligen ett resultat av närvaron av en stimulus mus.

Figur 11 visar resultatet av den sociala biten Analys för sessionen III. Det stora antalet sociala strategier (35 i 10 min) samt överväldigande positiva reaktioner på sociala åtgärder från stimulus mus (9/10) är typiska för möss med normal trevnad.

Figur 2. grafiskt användargränssnitt. Vänligen cslicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. tom bur. Detta används som en referensram efter konvertering till gråskala. Den röda cirkeln visar positionen för den sociala kopp och nonsocial kopp i den motsatta sidan. De vertikala vita linjer dela buren in i olika fack och rektangeln visar den inre begränsning av buren.

Figur 4. gråskala version av figur 3.

Figur 5. Original ram. En film ram i gråskala format. Den sociala cylindern är markerad med en vit cirkel, ochytterligare grå cirkel med en radie 2 cm större än den för den sociala cylindern dras att avgränsa det område där testet musen anses "nära" den sociala cylindern. I det motsatta hörnet är nonsocial cylindern markeras med en grå cirkel och återigen en ytterligare cirkel med en 2 cm större radie dras att avgränsa det område som anses vara nära nonsocial cylindern. De vertikala vita linjer dela buren in i olika fack och rektangeln visar den inre begränsning av buren.

Figur 6. Skillnaden Image. Bild som erhållits genom att subtrahera referensramen från provet ramen.

Figur 7. binära bilden. De bildpunkter av difference bild som överskrider en viss tröskel (30 i detta exempel) anses musen pixlar och visas vit. Den röda cirkeln betecknar näsan och vita cirkeln är svansen.

Figur 8. Mus bana. De små vita cirklar visar placeringen av näsan från början av sessionen jag tills denna ram fångades.

Figur 9. Resultat av Sällskaplighet Analys för Session I. Siffrorna ovanför respektive bur facken anger gånger musen tillbringade i dem (i detta fall 254,3 sek i det vänstra facket, 155,2 sek i neutralfacket och 237,0 sekunder i den högra fack). Siffrorna inom cirklarna indikerar gånger musen tillbringade nära till respective cup ( "nära" innebär mindre än 2 cm, eller i det yttre av de två cirklarna): 140,0 sek nära till vänster koppen och 105,6 sek nära till höger koppen. Numret längst ner i mitten indikerar hur ofta musen gått mellan de olika avdelningarna i buren (59 gånger i exemplet).

Figur 10. Resultat av Sällskaplighet analys för Session II. Siffrorna ovanför facken och inuti cirklarna indikerar gånger tillbringade i olika delar av buren som i figur 9 / session I. Observera att i session II, finns det en stimulans mus i en av de inverterade koppar (den vänstra i det här fallet), så denna kalk blir "sociala" cup. Förutom de åtgärder för sessionen I den tid testet musen tar att komma nära (inom 2 cm) till den sociala cylindern för första gången gesi nedre högra hörnet av centrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11. Resultat av Sällskaplighet Analys för Session III. Siffran efter "Approach" anger antalet sociala strategier som gjorts av test musen, siffrorna efter "Pos. Resp. "Och" Neg. Resp. "Tillstånd antalet positiva och negativa reaktioner från test musen till sociala metoder vid stimulans musen.

Discussion

Genom att kombinera videofilmning möss och automatisk filmanalys, har vi skapat en prisvärd, pålitlig high-throughput screening teknik.

Riktigheten i den automatiserade analysen jämfördes med resultaten av manuell analys för mer än 100-filmer. I den överväldigande majoriteten av ramar (> 99%) av ramar, är näsan av musen identifieras med god precision. De flesta av de (få) misdetections har ingen effekt på den sociala biten åtgärder så att omkring 80% av filmerna inte kräver några korrigeringar.

I de filmer som inte innehåller misdetections, den i särklass vanligaste problemet är att huvud och svans är förvirrad, så vi har inkluderat i programvaran ett enkelt sätt att byta huvud och svans för en film segment. Även om filmer ses för att kontrollera och korrigera alla misdetections kan denna kontroll göras på cirka 3 gånger realtid hastighet, så att den tid utvärdering är mycket kort. De delar av filmendär musen är inte nära en av cylindrarna kan ses på ännu högre hastighet.

Avtalet mellan alla automatiskt och manuellt bestämda sällskaplighet åtgärder är utmärkt (förutsatt att eventuella misdetections har korrigerats). I själva verket är kvaliteten på de automatiskt bestämda sällskaplighet åtgärder överlägsna manuellt bestämd sådana, eftersom objektiva kriterier konsekvent används för att bestämma avstånd och tider, medan manuell utvärdering lider gränserna för mänsklig perception och reaktionstiden. Dessa gränser blir allvarligare med högre tittarhastigheter, som är önskvärt att begränsa den tid utvärdering.

Anmärkning om steg 2.2.2 .: Denna rutin genomförs genom att minska mängden av vita pixlar sin gräns med hjälp av standardbildbehandlingsverktyg ¹⁴ och beräkna avståndet mellan två gränspixlar. Hitta de mest avlägsna punkter är användbart eftersom näsan och basen av svansentenderar att vara mycket nära dessa två ändar.

För fullständig genomförandet av kontinuiteten av ändarna (steg 2.3.4) som beskrivs nedan. I en given ram med ändar c och d och en föregående ram med ändar A och B, om c tillhör en och d till b eller c tillhör b och d till en (se figur 12).

Figur 12. Kontinuitet Fastställande. Mouse i ljusgrå färg med nos och svans markeras som a och b respektive är utgångsläget. Mus i vit färg med nos svans märkt c och d respektive är läget för musen i nästa ram.

Den allmänna tanken är att för korrekt fortsättning, är summan av de sträckor som tillrygga av ändarna mindre än för felaktig fortsättning, eftersom musen reser mindre än sin egen längd från en ram till nästa. I exemplet (Figur 2 δ ₁ = | c - a |, δ ₂ = | d - b |, Δ ₁ = | c - b |, och Δ ₂ = | d - a |, och säga att eftersom δ ₁ + δ ₂ <Δ ₁ + Δ _2, är den korrekta fortsättning en → C och B → d. Ett bra mått för förtroendet för en sådan bestämning är förhållandet r = max (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ ₂₎ / min (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ _2), som beskriver hur mycket mer ändarna skulle färdas i en continuation kontra andra. Per definition är r större än eller lika med 1. För avlånga mus former, r typiskt större än 10, endast om musformen blir mer cirkulär (t.ex. eftersom musen står på bakbenen), kan r komma nära en och en fortsättning är opålitlig. För tillförlitlig fortsättning, har en gräns på r> 2,5 använts. Med denna tröskel, de delar av ramar över vilka kontinuiteten i ändarna är etablerade varierar vanligtvis från hundratals till tusentals ramar. För varje avsnitt, bestämma mot vilken ände musen rör sig inom ett avsnitt. När kontinuitet i en sektion är etablerad, den "tyngdpunkt" (COG, de genomsnittliga koordinaterna för alla mus pixlar) för varje ram i sektionen bestäms. Skillnaden i COG från en ram till nästa definierar hastigheten hos musen mellan de båda ramarna. Denna hastighet projiceras på vektorn som förbinder de två ändarna för att se om och hur mycket musen rör sig towARDS den första eller mot den andra änden. Den totala rörelse (som är antingen mot den första eller den andra änden) är summan av rörelserna hos alla ramar.

Detta protokoll kan modifieras på flera sätt att ta itu med olika experimentella behov. Om olika aspekter av musens rörelser (t.ex. medelhastigheten) är av intresse, kan dessa extraheras från den beräknade mus bana. Om ljusförhållandena skiljer sig mycket från de som beskrivs här, kan tröskeln i binärisering steg som ger musen pixlar justeras. Även förändringar som en annan bur form kan genomföras genom att modifiera vårt nuvarande bur konfigurationsrutin.

Den beskrivna program ibland förvirrar huvud och svans (i mindre än 20% av de filmer, det finns ett behov av korrigering eftersom huvudet / svans flip skulle påverka vår utvärdering). Vi skrev ett praktiskt verktyg som gör det möjligt för användaren att identifiera den första och the sista bildrutan i intervallet där huvud och svans behöver vändas och sedan utföra denna korrigering med ett klick. Mycket få filmer (några procent) hade andra än huvud / svans flip problem för dessa vi gjort en mer allmän korrigering verktyg som gör det möjligt för användaren att ange i vilken del av buren testet musen näsan är under något intervall. Observera att behovet av korrigering inträffar så sällan att effekten på utvärderingstiden är liten.

Planerade förlängningar av protokollet är att också upptäcka mer socialt relevanta beteenden, såsom fullfölja och anogenital sniffa (som kan detekteras genom att övervaka avstånd från näsan av test musen kroppen och anus av stimulans mus, respektive). Stereotypa beteenden kan också vara detekterbar, exempelvis uppfödning, som kan detekteras från förändringen i musformen. En annan intressant förlängning är användningen av möss av olika färg, vilket bör vara enkelt, så länge som färgen på prov end stimulans mus har god kontrast med färgen på bur väggar och burgolvet.

Sammanfattningsvis har de beskrivna protokollet ett experimentellt och ett bildbehandlingsdelen. I experimentet del de viktigaste stegen är att kontrollera belysningen och positioneringen av buren och sedan att spela in mus beteende under tre sessioner (I: ensam i bur, II: med begränsad stimulus mus, III: fritt interagera med stimulans mus). I analysdelen, de kritiska stegen är att ladda en film och bur konfiguration, att utföra bildbehandling på varje filmruta för att bestämma näsa och svans positioner och sedan att beräkna statistik som behövs för att kvantifiera samvaro från näsan och svans banor.

En begränsning hos den beskrivna metoden är att den bara har testats för möss med vit päls. Det är självklart att den automatiserade analysen kommer att fungera lika bra med andra pälsfärger så länge apparaten väggar och golv gerstark kontrast med pälsfärg, men detta har ännu inte fastställts.

En annan begränsning är bristande automatisering av utvärderingen av sessionen III. Den största svårigheten för oss, som för andra grupper, är att hålla reda på vilken mus är testet musen och som stimulans musen under de frekventa närkontakt hos mössen. Vi har funnit att vi kan lösa det här problemet med markörer som färgade prickar mellan mössens öron, men alla märkningsmetoder som vi har provat hittills har irriterad åtminstone en del av mössen och förändrat sitt beteende avsevärt. Därför upptäcker vår nuvarande analys av sessionen III automatiskt alla metoder men kräver manuell klassificering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.