Experimentelle Bewertung der Maus Sociability einer automatisierten Bildverarbeitung Ansatz

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode Maus Kontaktfreudigkeit zu quantifizieren. Die Mäuse werden auf Video aufgezeichnet, wie sie in einem speziellen Käfig bewegen und interagieren. Filmverarbeitung ermöglicht die automatisierte Quantifizierung von Gesellschaftlichkeit mit ausgezeichneter Genauigkeit und Zuverlässigkeit.

Abstract

Maus ist das bevorzugte Modellorganismus für Medikamente entwickelt, zu erhöhen Kontaktfreudigkeit zu testen. Wir stellen eine Methode Maus Kontaktfreudigkeit zu quantifizieren, in dem die Testmaus in einem standardisierten Gerät gestellt wird und relevante Verhaltensweisen werden in drei verschiedenen Sitzungen beurteilt (die so genannte Session I, II und III).

Das Gerät verfügt über drei Fächer (siehe Abbildung 1), die linken und rechten Kammern eine umgekehrte Schale enthalten , die eine Maus aufnehmen kann ( "Stimulus Maus" genannt).

In Sitzungs I, wird der Test der Maus in den Käfig gegeben und seine Beweglichkeit wird durch die Anzahl von Übergängen, die zwischen Kammern gekennzeichnet. In Session II wird ein Stimulus Maus unter einer der invertierten Tassen und die Kontaktfreudigkeit der Test Maus wird durch die Höhe der Zeit , es verbringt in der Nähe der Tasse gegen den leeren umgekehrten Schale enthält die beiliegende Stimulus Maus quantifiziert platziert. In Session III werden die umgekehrten Becher entfernt ein d beide Mäuse frei interagieren. Die Geselligkeit der Test Maus in der Sitzung III wird durch die Anzahl der sozialen Ansätze quantifiziert es der Reiz Maus macht zu und durch die Anzahl der Zeiten vermeidet es einen sozialen Ansatz durch den Reiz der Maus.

Die automatisierte Auswertung des Films erkennt die Nase des Testmaus, die die Bestimmung aller beschriebenen Kontaktfreudigkeit Maßnahmen in der Sitzung I und II ermöglicht (in der Sitzung III werden Ansätze automatisch identifiziert, aber klassifiziert manuell). Um die Nase, das Bild eines leeren Käfig finden wird digital von jedem Frame des Films abgezogen und das resultierende Bild wird digitalisiert die Maus Pixel zu identifizieren. Die Maus Schwanz wird automatisch entfernt und die beiden am weitesten entfernten Punkte der verbleibenden Maus bestimmt werden; diese sind in der Nähe der Nase und der Basis des Schwanzes. Durch die Analyse der Bewegung der Maus und der Kontinuität Argumente wird die Nase identifiziert.

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Abbildung 1. Bewertung der Sociability Während drei Sitzungen Session I (oben):.. Akklimatisierung von Test Maus in den Käfig Session II (Mitte). Test - Maus frei im Käfig bewegt , während der Reiz Maus in einer umgekehrten Schale eingeschlossen ist Session III (unten): Beide Test Maus und Stimulus-Maus erlaubt frei miteinander und interagieren zu bewegen.

Introduction

Impaired Kontaktfreudigkeit ist eine der primären Symptom - Domänen in einer Reihe von Störungen der neurologischen Entwicklung, einschließlich Autismus - Spektrum - Störungen (ASD) ^1,2. Es schränkt die Fähigkeit der Patienten , Beziehungen zu entwickeln und stark beeinflusst Patienten, Familien und Betreuer ^2,3.

In dem Bemühen, besser den Mechanismus verstehen beeinträchtigt Kontaktfreudigkeit zugrunde liegenden und zu entwickeln Behandlungen wurden mehrere Mausmodelle ^1,4-9 untersucht. Ein solcher Stamm ist der Balb / c - Maus, ein Inzuchtstamm , die auffallend niedrige Kontaktfreudigkeit zeigt, ähnlich Funktionen bei Patienten mit ASD5 ^8-12 gesehen. Zum Beispiel zeigt die Balb / c - Maus eine niedrigere Frequenz der sozialen Ansätzen und einer in der Regel negativen Antwort auf die sozialen Ansätze durch einen Reiz Maus (zB soziale Vermeidung) als der Schweizer Webster Komparator Stamm ^10.

Um zu testen, ob eine vorgeschlagene Behandlung ist effective bei der Steigerung sind Kontaktfreudigkeit, objektive Maßnahmen erforderlich. Eine weithin akzeptierte Rahmen ist die Geselligkeit in einem standardisierten Gerät zu analysieren , die drei Fächer hat (siehe Abbildung 1).

Die linke und rechte Kammern enthalten jeweils einen invertierten Draht Tasse, die eine sozial ausgeprägten Reiz Maus beherbergt. Der Test Maus ist für drei Intervallen von 10 min (Sitzungen I-III) in das Gerät freigesetzt; Sitzung I beurteilt die Bewegungsaktivität der Test Maus, während Sitzungen II und III verschiedene Aspekte des Geselligkeits-Test Maus beurteilen.

In Session I, wird der Test Maus an das Gerät akklimatisieren. In dieser Sitzung, die die Anzahl von Übergängen der Test Maus zwischen den verschiedenen Abteilen ermöglicht wird gemessen. Wichtig erhalten, Kontaktfreudigkeit Maßnahmen in der Standard-Drei-Kammer-Gerät auf die Bewegungsaktivität abhängig sind, und reduziert die Bewegungsaktivität kann Interpretation von soci vermengenFähigkeit, Daten.

In Session II wird die Test Maus frei bewegen und ein Reiz Maus wird unter einer der invertierten Tassen platziert (ausgeglichen). Die Stimulus-Mäuse sind 4 Wochen alte männliche ICR outbred Mäuse, Alter und Geschlecht abgestimmt auf die Testmäuse. Der Reiz der Maus wird in einer umgekehrten Schale in der Seite bezeichnet als Sozialraum eingeschlossen ist, und eine leere umgekehrten Schale ist in der Seiten bezeichnet als nonsocial Fach gelegt. In Session II wird die Kontaktfreudigkeit des Test Maus durch einen Vergleich der Zeit , es in der Nähe des "sozialen" Inverted Cup verbringt quantifiziert (weniger als 2 cm entfernt) gegen die Zeit, in der Nähe des "nonsocial" Inverted Cup, und durch die Zeit verbringt sie verbringt im Sozialraum gegen die Zeit, in der nonsocial Raum verbringt. Swiss Webster Komparator Mäuse verbringen deutlich mehr Zeit im sozialen Raum und in der Nähe der sozialen umgekehrten Schale im Vergleich zu Balb / c-Mäusen, die keine signifikante Präferenz für die soziale zeigenInverted Cup oder die soziale Fach ^12.

In Session III, Test und Stimulus Mäuse sind erlaubt, frei zu interagieren (invertiert Tassen werden entfernt). Maßnahmen der Geselligkeit, Stereotypien Verhaltensweisen und Übergänge zwischen den Kammern werden zuverlässig in der dritten 10 min Sitzung der freien Interaktion zwischen Test und Stimulus Mäusen erhalten und analysiert. In diesem Bericht wird die Kontaktfreudigkeit der Test Maus über zwei Maßnahmen quantifiziert: 1) die Anzahl der sozialen Ansätze es in Richtung der Reiz Maus macht, wo eine soziale Ansatz als vorwärts definiert (Nase zuerst) in Richtung der Reiz Maus, so dass die Nase weniger als 2 cm entfernt von der Stimulus-Maus; 2) die Anzahl der Vermeidungen sozialer Ansätze durch den Stimulus Maus. Der Test Maus gilt als Ansatz zu vermeiden, wenn es dreht oder bewegt sich von der Stimulus Maus weg, oder wenn es vorübergehend außer Betrieb ( "Einfrieren Verhalten") nach dem Stimulus Maus zu bewegen hat den Test der Maus angefahren. BALB /c - Mäuse zeigen eine Abnahme der Zahl der sozialen Ansätze gemacht gegenüber dem Stimulus - Maus und eine Erhöhung der Zahl der negativen Reaktionen auf soziale Ansätze durch den Reiz der Maus im Vergleich zum Swiss - Webster - Komparator - Stamm ^10.

Die Auswertung der Verhaltens Filme wurde traditionell manuell durchgeführt worden, dh durch den Film (möglicherweise mit reduzierter Geschwindigkeit) sorgfältig zu beobachten und Stoppuhren für die Zeit , die Maus verbringt in einem bestimmten Fach oder in der Nähe eines der invertierten Becher ¹⁰ zu aktivieren. Dieses Verfahren erfordert wiederholt des Films beobachtet und ist daher sehr zeitraubend. Außerdem wird die Genauigkeit durch die Rater die Reaktionszeit für die Stoppuhr-Messungen und die Fähigkeit zu erkennen, beschränkt, ob die Maus innerhalb von 2 cm von der umgekehrten Schale ist. In den letzten Arbeiten, zwei Verbindungen (D-Serin und D-Cycloserin) haben bei der Wiederherstellung Umgänglichkeit in BALB / c - Mäuse ^9,10,12 wirksam erwiesen. Es ist bekannt, dass beide Komponenten moduEnde der NMDA - Rezeptor, der bekannt ist , eine zentrale Rolle im Sozialverhalten ^2,12 zu spielen. NMDA-Rezeptor-Aktivität in einer Vielzahl von wohldefinierten Weise, und das Potential für einen Durchbruch in ASD-Behandlung Eine große Reihe von Verbindungen ist bekannt, zu modulieren, macht die beschleunigte Bewertung dieser Verbindungen eine Priorität und eine schnelle automatische Methode zur Auswertung sehr wünschenswert.

Nachstehend wird ein automatisches Analyseverfahren für die Beurteilung der Maus Soziabilität entwickelt. Es verwendet Bildverarbeitungsverfahren auf alle Rahmen der Maus Filme der Position der Maus oder Mäuse zu identifizieren. In Sitzungen I und II, sie erkennt weiter Nasenposition und verwendet sie Soziabilität Maßnahmen zu berechnen. In Session III, erkennt er automatisch alle Ansätze, aber manuelle Klassifizierung (soziale Ansatz, soziale Vermeidung oder andere) erforderlich.

Protocol

Das Protokoll für die Vereinfachung der Erläuterung wurde in 2 Teile geteilt: 1) Versuchsdurchführung und 2) Automatisierte Analyse. Alle Tiere wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹⁵ behandelt, und alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Experimentelles Verfahren

1. Stellen Sie den Käfig, der eine schwarze entspiegelte Plexiglas rechteckigen Kasten (52 x 25 x 23 cm ³⁾ gliedert sich in drei Abteilungen: sozial, nonsocial und einem neutralen Mittelfach (Abbildung 1). Platzieren Sie invertiert Draht Tassen in jeder der Stirnfächer während der Sitzungen I und II (siehe unten) und beherbergen die Reiz Maus während Sitzung II.
2. Stellen Sie die Kamera in einer solchen Weise auf, dass der Käfig um das Sichtfeld ausfüllt. Da Beleuchtung mit Mausverhalten stören können, eine Leuchtdichte von nicht mehr als 3,5 Lux in den Käfig halten, aus dem indirekten Licht, das voneine Glühlampe und in Richtung nach oben auf dem Käfigboden gemessen. Verwenden Sie auch eine Infrarot-Lichtquelle, die Mäuse nicht wahrnehmen kann, aber die Kamera erfassen kann. Notieren Sie alle Filme in 720 x 480 Standard-Definition.
3. Nehmen Sie ein einzelnes Bild von einem leeren Käfig für die spätere Bildverarbeitung (die "Referenzrahmen" genannt) und als Graustufenbild zu speichern.
4. Session I: Einführung Test Maus in den Käfig und Wellen Hand über den Käfig, die den Beginn der Sitzung (vgl Automatisierte Analyse). Nehmen Sie Film für 10 min. Am Ende der 10 Minuten, legen Sie die Maus wieder in seine ursprüngliche Käfig.
5. Session II: die Reiz Maus unter einer der invertierten Tassen Put (ausgeglichen).
6. Verwenden Sie die "Social links" oder "Social rechts", um zu wählen, ob der Reiz Maus auf der linken Seite in der umgekehrten Schale ist oder in der umgekehrten Schale auf der rechten Seite.
   HINWEIS: Die umgekehrte Tasse mit dem Reiz der Maus wird die "soziale Tasse" genannt, während die andereKelch ist der "nonsocial Tasse". Das Fach, in dem die soziale Tasse ist die soziale Fach, das Fach mit dem nonsocial Kelch ist der nonsocial Fach, und das mittlere Fach ist das "neutrale Fach" genannt befindet.
7. Führen Sie den Test Maus in den Käfig. Welle der Hand über den Käfig den Beginn der Sitzung anzuzeigen. Nehmen Sie Film für 10 min. Wichtig ist, halten Mäuse in der Geselligkeits Gerät vor der invertierten Tassen Entfernen Session III zu beginnen.
8. Session III: Entfernen Sie die invertierten Tassen, lassen Sie die beiden Mäuse und erlauben Mäuse die Test und Stimulus miteinander zu interagieren frei. Welle der Hand über den Käfig den Beginn der Sitzung anzuzeigen. Nehmen Sie Film für 10 min. Am Ende der 10 Minuten, legte beide Mäuse zurück in ihre jeweiligen Käfige.

2. Automatisierte Analyse

HINWEIS: Die Befehle in Abschnitt 2 werden über eine grafische Benutzeroberfläche ausgegeben (siehe Abbildung 2) , die conKontrollen unserer Software. Hier erklären wir den Schritt-für-Schritt-Verarbeitung, die unsere Software ermöglicht; die Software ist auch in der Lage, die Analyse im Batch-Modus ohne Benutzereingabe durchgeführt wird.

1. Für jeden Film, führen Sie die folgenden Verarbeitungsschritte:
   1. Last Film (klicken Load).
   2. Wählen Käfig-Konfiguration, die das Analyseprogramm die Position des Käfigs Grenzen, Kompartimentgrenzen und Tasse Standorten erzählt. Wählen Sie eine der vier gespeicherten Konfigurationen oder manuell alle Koordinaten einzustellen.
      HINWEIS: Die Konfiguration in der Regel nicht ändert von einem Experiment zum nächsten und somit wiederverwendet werden können.
   3. Für jedes Bild des Films, führen Sie die folgenden Verarbeitungsschritte (2.1.3.1-2.1.3.6).
      1. Wandeln Sie den Rahmen, indem Sie auf die "Graustufen", um in Graustufen.
      2. Digital subtrahieren Sie den Graustufen- Referenzrahmen (siehe Schritt 1.3), indem Sie auf den "subtrahieren" -Taste. HINWEIS: Das Ziel dieses Schrittes ist die Pixel va zu machenLues des Rahmens sehr nahe überall auf Null mit Ausnahme der Mausposition.
      3. Binarisieren den Rahmen, indem alle Pixel unter einem bestimmten Schwellenwert zu schwarz Einstellung, alle Pixel über diesem Niveau auf weiß (klicken Sie auf den "Binarisieren" -Button).
         Hinweis: Die Idee ist, dass, da die Maus Pixel im Allgemeinen höhere Werte aufweisen als die übrigen Pixel, wird die Maus Pixel weiß und alle anderen Pixel schwarz. Der optimale Schwellenwert ist abhängig von den Lichtverhältnissen und kann durch die Beurteilung der Maus Form über einen Film bestimmt werden. Wenn die Schwelle zu niedrig gewählt wird, erscheint die Maus zu groß, und Pixeln, die weiß gefärbt sein, nicht an der Maus gehören kann. Wenn der Schwellenwert zu hoch ist, wird die Maus klein und in getrennte Stücke zerfallen kann. In den aufgenommenen Filmen war die optimale Schwelle immer zwischen 20 und 35 (auf einer Skala von 0 bis 255).
      4. Erodieren ¹³ das binärisierte Bild e - mal, dann ¹³ 2e mal aufzuweiten, dann erode wieder e mal, indem Sie die Taste "Erod / Dil" drücken.
         Hinweis: Der Zweck dieser Prozedur ist es, den Schwanz zu entfernen. Für die Auflösung (720 x 480), die verwendet wurde, e = 3 unter allen Umständen gearbeitet.
         Hinweis: Die Software automatisch auf das Vorhandensein einer Hand in das Bild überprüft (während der Aufnahme von Filmen, die Hände werden durch das Bild, winkte den Beginn einer Sitzung, um anzuzeigen). Wenn eine Hand vorhanden ist, wird es ungewöhnlich viele weiße Pixel in dem binärisierten Frame weil die Hand viel größer als eine Maus ist. Die Bedingung für das Vorhandensein einer Hand ist, dass es mehr als 10.000 weißen Pixeln in dem binärisierten Frame. Die Software bestimmt die Anfänge der Sitzungen I, II und III, durch die Frame-Bereich Erfassung, in der Handbewegungen auftreten.
2. In Sitzungen I und II, gehen Sie wie folgt:
   1. Ermitteln Sie die größte zusammenhängende Komponente des Satzes von weißen Pixeln (Klicken Sie auf "LComp"). Hinweis: Der Zweck of ist dieser Schritt zu weißen Pixeln zu beseitigen , die an die Maus nicht gehören, beispielsweise durch die Bewegung der Maus in Stimulus - Sitzung II verursacht. Das größte zusammenhängende Komponente ist in fast allen Frames, die die Maus.
   2. Bestimmen Sie die beiden am weitesten entfernten weißen Pixeln, indem Sie auf "Suchen Ends" (die "Enden" der Maus genannt).
      Hinweis: Die Software stellt die Kontinuität der beiden Enden, das heißt für jedes der Enden in dem ersten Rahmen , an dem der Enden in den nachfolgenden Rahmen sie gehören. Die allgemeine Idee ist, dass, da Frames mit hoher Geschwindigkeit aufgezeichnet werden, können die Enden nicht weit von einem Rahmen zum nächsten fahren, so daß für die korrekte Fortsetzung der Enden von einem Rahmen zum nächsten ist die, die die Summe der Abstände minimiert, dass die Enden bewegen. Siehe die Diskussion für mehr Details.
   3. Bestimmen Sie, welche Ende der Maus die Nase ist.
      1. Bestimmen Sie die Richtung, in der eine Maus bewegt sich durch die Beobachtung, wie der Schwerpunkt (COG)Änderungen von Rahmen (die Bewegung des COG ist die Bewegung der Summe aller Maus Pixel) zu gestalten.
         Hinweis: Die COG eines Satzes von Pixeln p _1, ..., p _n mit den Koordinaten x _1, .., ist x _n definiert durch:
         
         Mäuse in der Regel bewegen sich nach vorne (dh in Richtung ihrer Nase). In einem Abschnitt von mehreren hundert Bildern, ist es immer sehr hohes Vertrauen in den Kopf / Schwanz-Erkennung.
         Hinweis: Die Software automatisch, auf das der detektierten bestimmt endet die Maus bewegt; Dieses Ende ist als die Nase und markiert mit einem roten Kreis in dem Film identifiziert. Wenn die erfasste Nase mit einem roten Kreis in jedem Frame markiert ist, kann der Anwender die Qualität der Erkennung überprüfen.
3. In Session III, gehen Sie wie folgt:
   1. Erkennen beiden größten Komponenten von weißen Pixeln.
      1. Wenn beide sind von akzeptabler Größe für UhrOuse und ihre Schwerpunkte (COG) sind kompatibel mit den Maus COGs des vorherigen Rahmens, betrachten Sie diese beiden Komponenten, die beiden Mäuse.
      2. Betrachten Maus akzeptable Größen, wenn sie sich nicht um mehr als 20% seit dem vorherigen Rahmen geändert haben, und betrachten COGs von zwei aufeinanderfolgenden Frames als kompatibel, wenn ihre Differenz nicht größer als der Abstand ist eine Maus in der Zeit zwischen den Rahmen bewegen kann (dieser Abstand folgt aus der maximalen Mausgeschwindigkeit, die als Teil der Vorbereitungen einer Versuchsreihe durch die Analyse der Bewegung von mehreren einzelnen Mäusen (wie in Einheiten I und II) bestimmt werden kann.
         Hinweis: Wenn die beiden größten Komponenten nicht akzeptable Größen für eine Maus sind, oder die Zähne sind zu verschieden von denen in dem vorhergehenden Rahmen, die Software automatisch erhöht die Binärumwandlungsschwelle bis die beiden größten Komponenten annehmbarer Größe sind und deren COGs sind kompatibel mit diejenigen des vorherigen Rahmens.
   2. Klicken Sie auf die Test-Maus indas erste Bild. Verwenden Sie die Analyse in 2.3.1 sowohl Test- und Stimulus Maus in jedem Rahmen der Sitzung III zu identifizieren.
   3. Identifizieren Sie die Frames in der Sitzung III, in dem die eine Maus sozial den anderen Ansätzen. Hinweis: Die Software diesen Schritt implementiert, indem sie automatisch überprüft, dass der Abstand zwischen den Mäusen weniger als die typische Wechselwirkungsabstand von Mäusen (wir verwenden 2 cm).
   4. Wenn die Software ein kurzes Segment des Films mit dem erkannten Annäherung an den Benutzer spielt, klicken Sie auf eine Schaltfläche, um anzuzeigen, ob dieser Ansatz durch die Test Maus, soziale Vermeidung durch den Test Maus oder weder als soziale Ansatz qualifiziert.
      Hinweis: Schritt 2.3.4 kann automatisiert werden, wenn bekannt ist, welche Maus ist die Test-Maus. Da diese Information verloren geht, wenn die Mäuse einander zu nahe kommen (oder klettern auf der jeweils anderen), und da wir einen Weg gefunden, noch nicht haben, um die Mäuse in einer Art und Weise kennzeichnen, die zuverlässig durch unsere Software erkannt werden kann und tut Auswirkungen auf ihr Verhalten nicht, haben wir kehrten zumanuelle Klassifizierung für jetzt.
4. Zur Auswertung verarbeitet Filme, Last Film mit Load-Taste.
   1. Klicken Sie auf Start Session 1 den ersten Frame der Session angezeigt werden 1 (oder Start Session 2 den ersten Frame der Session 2 anzuzeigen).
   2. Klicken Sie auf Play / Stop zu spielen und zu stoppen Filme.
      Hinweis: Die verarbeiteten Filme Maus mit dem Kopf angezeigt werden und Schwanz mit verschiedenfarbigen Kreisen markiert. Alle Kontaktfreudigkeit Maßnahmen werden auf dem Bildschirm angezeigt und aktualisiert, wenn der Film abgespielt wird.
   3. Export Kontaktfreudigkeit Daten im Excel-Format von "Export" klicken.
   4. Klicken Sie auf "Compile Daten" alle Daten aller Filme zu kompilieren in einem Ordner in eine Datei einzelne Excel.

Representative Results

Abbildung 3 zeigt einen Farbrahmen eines Verhaltens Film mit einem leeren Käfig. Die Maus hat in den Käfig eingeführt bisher noch nicht. Die Position der Schalen, (soziale und nonsocial) und die Kompartimentgrenzen überlagert werden. Der Farbrahmen von leeren Käfig ist auf 8 Bit - Graustufen umgewandelt , wie in Abbildung 4 und verwendet als Referenzrahmen gezeigt. Der Referenzrahmen wird von jedem anderen Bild des aufgenommenen Film abgezogen.

Abbildung 5 zeigt einen der Rahmen aus dem Film während der Sitzung , die ich, wieder mit den Fach Grenzen und Cup Positionen überlagert. Der Referenzrahmen von der Probenrahmen subtrahiert wird und das Ergebnis, das Differenzrahmen genannt wird , ist in 6 gezeigt.

7 ist das binarisierte Version des Differenzrahmen. (Siehe Abschnitt 2.1.3.3). Die Figur zeigt auch die Position der Nase (roter Kreis) und die Basis des tail (grauer Kreis), wie in Abschnitt 2.2.4 bestimmt).

Sobald der Nasenposition für jeden Rahmen des Films festgelegt ist, kann die Flugbahn der Maus in jeder gewünschten Art und Weise analysiert werden. 8 zeigt die Positionen der Maus Nase (weiße Kreise) für einen Teil des Films, der etwa 1,000 Frames umfasst (~ 30 sec).

Figur 9 zeigt das Ergebnis einer Analyse zur Soziabilität Sitzungs I. Die Anzahl der Übergänge zwischen den Kompartimenten cage wird als Maß für die Bewegungsaktivität verwendet (in dem gezeigten Beispiel sind 59 Übergänge in 10 min in normaler Bewegungsaktivität). Die Zeit in verschiedenen Teilen des Käfigs verbrachte dienen als Grundlage II Präferenz für die Sozialraum / Cup in der Sitzung zu beurteilen.

Abbildung 10 zeigt das Ergebnis der Geselligkeits Analyse für Session II. Von besonderem Interesse sind die in der Nähe der sozialen vs. nonsocial Tasse verbrachte Zeit (in der gezeigten EXAmple 230,8 vs 72,3 sec) und die soziale gegen den neutralen und nonsocial Fächer (314,7 vs. 109,4 vs. 185,5 sec). Die klare Ausrichtung auf die soziale Tasse und Fach sind typisch für Kontrollmäuse und ein Vergleich mit den Daten aus Session I (Abbildung 9) zeigt deutlich , dass die Vorspannung wirklich ein Ergebnis der Gegenwart eines Reizes Maus ist.

Abbildung 11 zeigt das Ergebnis der Geselligkeits Analyse für Session III. Die hohe Zahl der sozialen Ansätze (35 in 10 min) sowie die überwiegend positiven Reaktionen auf soziale Ansätze durch den Reiz der Maus (9/10) sind typisch für Mäuse mit normalen Kontaktfreudigkeit.

Abbildung 2. Graphical User Interface. Bitte clecken hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. leeren Käfig. Dies wird als ein Referenzrahmen nach der Umwandlung verwendet in Graustufen. Der rote Kreis zeigt die Position des sozialen Cup und nonsocial Tasse in der gegenüberliegenden Seite. Die vertikalen weißen Linien unterteilen den Käfig in verschiedene Kompartimente und das Rechteck zeigt die innere Begrenzung des Käfigs.

Abbildung 4. Graustufen Version von 3.

Abbildung 5. Original - Frame. Ein Film Rahmen in Graustufen - Format. Der soziale Zylinder wird durch einen weißen Kreis markiert, undein zusätzlicher grauer Kreis mit einem Radius von 2 cm größer ist als die des sozialen Zylinder ist die Region, in der die Testmaus "nahe" an der sozialen Zylinder wird als abgrenzen gezogen. In der gegenüberliegenden Ecke wird der nonsocial Zylinder durch einen grauen Kreis markiert und wieder ein zusätzlicher Kreis mit einem 2 cm größeren Radius gezogen wird, um den Bereich abgrenzen, die nahe dem nonsocial Zylinder angesehen wird. Die vertikalen weißen Linien unterteilen den Käfig in verschiedene Kompartimente und das Rechteck zeigt die innere Begrenzung des Käfigs.

Abbildung 6. Differenzbild. Bild, erhalten durch den Referenzrahmen aus dem Probenrahmen subtrahiert wird.

Abbildung 7. binarisierte Bild. Die Pixel des difference Bild, das einen bestimmten Schwellenwert (30 in diesem Beispiel) überschreiten, werden die Maus-Pixel betrachtet und weiß dargestellt. Der rote Kreis zeigt die Nase und den weißen Kreis ist der Schwanz.

Abbildung 8. Maus Trajektorie. Die kleinen weißen Kreise zeigen die Lage der Nase vom Beginn der Sitzung , die ich bis zu diesem Rahmen erfasst wurde.

Abbildung 9. Die Ergebnisse der Sociability Analyse für Session I. Die Zahlen über den jeweiligen Käfig Kompartimente zeigen die Zeiten der Maus in ihnen ausgegeben (in diesem Fall 254,3 sec in der linken Kammer, 155,2 sec in der neutralen Kompartiment und 237,0 sec im rechten Abteil). Die Zahlen innerhalb der Kreise zeigen die Zeiten, die Maus ausgegeben Nähe der resweiligen Tasse ( "close" bedeutet, dass weniger als 2 cm entfernt oder innerhalb der äußeren der beiden Kreise): 140,0 sec nahe der linken Cup und 105,6 sec nahe am rechten Tasse. Die Zahl in der unteren Mitte der angibt, wie oft der Maus zwischen den verschiedenen Abteilen des Käfigs (59-mal in dem Beispiel) überführt.

Abbildung 10. Die Ergebnisse der Sociability Analyse für Session II. Die Zahlen über den Fächern und innerhalb der Kreise zeigen Zeiten in verschiedenen Teil des Käfigs ausgegeben , wie in Abbildung 9 / Sitzung I. Beachten Sie, dass in der Sitzung II gibt es einen Reiz Maus in einem der invertierten Becher (die in diesem Fall eine links), so wird dieser Kelch ist der "soziale" Tasse. Zusätzlich zu den Maßnahmen der Sitzung I, nimmt die Zeit der Test Maus in der Nähe (innerhalb von 2 cm) auf die soziale Zylinder zu bekommen zum ersten Mal gegebenin der unteren rechten Ecke des Zentrums. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 11. Die Ergebnisse der Sociability Analyse für Session III. Die Zahl nach "Approach" gibt die Anzahl der sozialen Ansätze gemacht durch den Test - Maus, die Zahlen nach "Pos. Resp. "Und" Neg. Resp. "Zustand die Anzahl der positiven und negativen Antworten der Testmaus auf soziale Ansätze durch den Reiz der Maus.

Discussion

Durch die Kombination von Mäusen und automatischen Filmanalyse videotaping haben wir eine erschwingliche, zuverlässige Hochdurchsatz-Screening-Technik erstellt.

Die Genauigkeit der automatisierten Analyse wurde für mehr als 100 Filme mit den Ergebnissen der manuellen Analyse verglichen. In der überwiegenden Mehrzahl von Rahmen (> 99%) von Vollbildern wird die Nase der Maus mit guter Präzision identifiziert. Die meisten der (wenigen) Fehldetektionen haben keine Auswirkungen auf die Kontaktfreudigkeit Maßnahmen, so dass rund 80% der Filme keine Korrekturen erforderlich.

In diesen Filmen, die Fehldetektionen enthalten, bei weitem das häufigste Problem ist, dass Kopf und Schwanz sind verwirrt, so haben wir in der Software eine einfache Möglichkeit, enthalten zu wechseln Kopf und Schwanz für einen Film-Segment. Auch wenn Filme zu überprüfen sind, angezeigt und korrigieren Sie alle Fehldetektionen kann diese Überprüfung bei etwa 3-mal in Echtzeit Geschwindigkeit durchgeführt werden, so dass die Auswertung Zeit sehr kurz bleibt. Die Abschnitte des Filmsin dem die Maus nicht in der Nähe einer der Zylinder kann bei noch höheren Geschwindigkeit betrachtet werden.

Die Vereinbarung zwischen allen automatisch und manuell bestimmt Kontaktfreudigkeit Maßnahmen ist ausgezeichnet (unter der Annahme, dass mögliche Fehldetektionen korrigiert wurden). In der Tat ist die Qualität der automatisch bestimmt Kontaktfreudigkeit Maßnahmen überlegen Werte manuell bestimmt, weil objektive Kriterien einheitlich angewandt werden Entfernungen und Zeiten, um zu bestimmen, während manuelle Auswertung von Grenzen der menschlichen Wahrnehmung und Reaktionszeit leidet. Diese Grenzwerte werden schwerer mit höheren Betrachtungsgeschwindigkeiten, bei denen es wünschenswert, die Auswertungszeit zu begrenzen.

Hinweis zu Schritt 2.2.2 .: Diese Routine wird durch eine Verringerung der Menge der weißen Pixel zu seiner Grenze mit Standard - Bildverarbeitungs - Tools ¹⁴ implementiert und die Berechnung der Entfernung zwischen zwei beliebigen Randpixel. Finden der am weitesten entfernten Punkten ist nützlich, weil die Nase und der Basis des Schwanzesganz in der Nähe neigen dazu, zu diesen beiden Enden zu sein.

Der Vollständigkeit halber wird die Umsetzung der Kontinuität der Enden (Schritt 2.3.4) unten beschrieben. In einem bestimmten Rahmen mit Enden c und d und einem vorhergehenden Rahmen mit den Enden a und b, ob c gehört zu einer und d zu b oder c gehört a zu b und d (siehe Abbildung 12).

Abbildung 12. Continuity Bestimmung. Maus in hellgraue Farbe mit Bug und Heck als markiert bzw. b ist die Ausgangsposition zurück . Maus in weißer Farbe mit Nasen tail markiert c und d jeweils die Position der Maus in dem nächsten Rahmen.

Die allgemeine Idee ist, daß für die korrekte Weiterführung, die Summe der von den Enden zurückgelegten Entfernungen kleiner als für die falsche Fortsetzung, weil die Maus bewegt kleiner als seine eigene Länge von einem Bild zum nächsten. In dem Beispiel (2 δ ₁ = | c - a |, δ ₂ = | d - b |, Δ ₁ = | c - b | und Δ ₂ = | d - a |, und sagen , dass da δ ₁ + δ ₂ <Δ ₁ + Δ _2, die richtige Fortsetzung ist a → c und b → d. Ein gutes Maß für das Vertrauen einer solchen Bestimmung ist das Verhältnis r = max (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ ₂₎ / min (δ ₁ + δ _2, Δ ₁ + Δ _2), die beschreibt , wie viel mehr die Enden würden in einem continuatio reisenn gegenüber dem anderen. Per Definition r größer oder gleich 1 für längliche Maus Formen, r ist in der Regel größer als 10 ist , nur dann , wenn die Maus Form kreisförmiger wird ( zum Beispiel , weil die Maus auf den Hinterbeinen steht), r nahe kommen kann ein und die Fortsetzung ist unzuverlässig. Für eine zuverlässige Weiterführung, eine Schwelle von r> 2,5 verwendet wurde. Mit dieser Schwelle werden die Abschnitte der Rahmen, über die die Kontinuität der Enden hergestellt wird, liegt typischerweise im Bereich von Hunderten bis Tausenden von Frames. Für jeden Abschnitt bestimmen, zu dem Ende der Maus innerhalb eines Abschnitts bewegt. Sobald die Kontinuität in einem Abschnitt hergestellt wird, der "Schwerpunkt" (COG, die mittleren Koordinaten aller Maus Pixel) für jeden Rahmen in dem Abschnitt bestimmt. Der Unterschied in COG von einem Bild zum nächsten bestimmt die Geschwindigkeit der Maus zwischen den beiden Rahmen. Diese Geschwindigkeit wird auf dem Vektor projiziert, der die beiden Enden verbindet, ob zu sehen und wie viel die Maus bewegt towARDS die erste oder die Richtung des zweiten Endes. Die Gesamtbewegung (der entweder auf dem ersten oder dem zweiten Ende) ist die Summe der Bewegungen aller Rahmen.

Das vorliegende Protokoll kann auf verschiedene Weise modifiziert werden, um verschiedene experimentelle Bedarf zu decken. Wenn verschiedene Aspekte der Bewegung der Maus (beispielsweise die Durchschnittsgeschwindigkeit) von Interesse sind, können diese aus der berechneten Trajektorie Maus extrahiert werden. Wenn die Beleuchtungsbedingungen von den hier beschriebenen sehr unterschiedlich sind, ist die Schwelle in der Binarisierung Schritt, dass die Maus Pixel ergibt eingestellt werden. Auch Änderungen wie eine andere Käfigform kann durch Modifikation unserer aktuellen Käfig Konfigurationsroutine implementiert werden.

Die beschriebene Software verwechselt gelegentlich Kopf und Schwanz (in weniger als 20% der Filme, gibt es einen Bedarf für eine Korrektur, da der Kopf / Schwanz-Flip unsere Bewertung beeinflussen würde). Wir schrieben ein praktisches Tool, das dem Benutzer erlaubt, die erste zu identifizieren und the letzten Frame des Intervalls, in dem Kopf und Schwanz Bedarf umgedreht werden und dann mit einem Klick diese Korrektur auszuführen. Nur sehr wenige Filme (einige Prozent) hatte andere Probleme als Kopf / Schwanz-Flip, für diese wir eine allgemeinere Korrekturwerkzeug hergestellt, die der Benutzer angeben, in dem erlaubt Teil des Käfigs der Test Maus Nase während eines Intervalls ist. Beachten Sie, dass die Notwendigkeit für die Korrektur so selten vorkommt, dass die Wirkung auf die Auswertungszeit klein ist.

Geplante Erweiterungen des Protokolls sind auch gesellschaftlich relevante Verhaltensweisen erkennen, wie der Verfolgung und anogenital Sniffing (die durch die Überwachung der Entfernung von der Nase des Test Maus, um den Körper und den Anus des Reizes Maus nachgewiesen werden können, beziehungsweise). Stereotypical Verhalten kann auch nachweisbar sein, beispielsweise Aufzucht, die sich aus der Veränderung der Mausform detektiert werden kann. Eine weitere interessante Erweiterung ist die Verwendung von Mäusen verschiedener Farbe, die so lang wie die Farbe des Test eine unkompliziert sein solld Stimulus Maus haben einen guten Kontrast mit der Farbe der Käfigwände und Käfigboden.

Zusammenfassend hat das beschriebene Protokoll ein experimentelles und ein Bildverarbeitungsteil. Im Experiment Teil sind die wichtigsten Schritte, die Beleuchtung und die Positionierung des Käfigs zu überprüfen und dann das Mausverhalten während drei Sitzungen aufzeichnen (I: allein im Käfig, II: mit begrenzten Reiz Maus, III: frei Interaktion mit Reiz Maus). Im Analyseteil, sind die kritischen Schritte, um einen Film und Käfig-Konfiguration zu laden, Bildverarbeitung auf jedem Film Rahmen auszuführen Positionen Nase und Schwanz zu bestimmen und dann die Statistiken zur Berechnung notwendigen Kontaktfreudigkeit aus der Nase und Schwanz Trajektorien zu quantifizieren.

Eine Begrenzung des beschriebenen Verfahrens besteht darin, dass es nur für Mäuse mit weißem Fell getestet. Es liegt nahe, dass die automatisierte Analyse genauso gut mit anderen Fellfarben arbeiten, solange die Vorrichtung Wände und Boden zur Verfügung stellenstarken Kontrast mit der Fellfarbe, aber diese etabliert noch nicht.

Eine weitere Einschränkung ist der Mangel an Automatisierung der Auswertung der Sitzungs III. Die größte Schwierigkeit für uns, wie für die anderen Gruppen ist, um zu verfolgen, von denen Maus der Test Maus ist und welche die Reiz Maus während der häufigen Begegnung der Mäuse. Wir haben herausgefunden, dass wir dieses Problem mit Markern wie farbigen Punkten zwischen den Ohren der Mäuse lösen können, aber alle Markierungsmethoden, die wir versucht haben, so haben weit gereizt zumindest ein Teil der Mäuse und verändert ihr Verhalten erheblich. Daher erkennt unsere aktuelle Analyse der Sitzung III automatisch alle Ansätze, sondern erfordert eine manuelle Klassifikation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas cage	Norva Plastics, Norfolk, VA	custom made	Dimensions and layout described in manuscript, can be adjusted according to needs. Use non-reflective plexiglas for to facilitate image processing
Wire cups	Kitchen plus	315	Use one to house stimulus mouse, one empty
Video camera	SONY	HDR-PJ790	Can be replaced by any camera with Comparable specifications
OpenCV (Image processing library)	Willow Garage	N/A	Any modern image processing library can be used.