Summary

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Published: March 04, 2015
doi:

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Ultraschall Mikrobläschenkontrastmittel in Wohn-, isoliert späten Schwangerschaftsphase murine Embryonen zu injizieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Perfusion Parameter und vaskulärer molekularer Marker innerhalb des Embryos mit kontrastverstärkten hochfrequenten Ultraschall-Bildgebung.

Abstract

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Introduction

Die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung nutzt Mikrobläschenkontrastmittel sichtbar zu machen und kennzeichnen das Gefäßumgebung. Diese Agenten ermöglichen die nichtinvasive Beurteilung der Mikrozirkulation, Vaskularität und Herz-Kreislauf-Funktion. Zusätzlich kann eine Modifikation der Blasenoberfläche in gezielter Mikrobläschen führen Bindung an Endothelzellen Biomarkern in der präklinischen Anwendungen der Angiogenese, Arteriosklerose und Entzündung 1,2 Herstellung Molekularultraschallbildgebungs vaskulärer Ereignisse möglich demonstriert. Kontrastverstärkten Ultraschall kann daher verwendet werden, um die komplexen und vielfältigen Umgebungen, die gesunden und erkrankten Gefäßzustände 3-5 beeinflussen zu identifizieren.

In den vergangenen Jahren hat das Interesse an der Nützlichkeit der Mikroblasenabbildungs ​​der vielseitigen Mausembryo Modell erweitert. Als ein Modell der Entwicklung von Säugetieren, die Einführung von Mikroblasen in der embryonalen Gefäßsystem erhöht physiologischenStudie der Entwicklungskreislauf-System (zB Blutfluss, Herzzeitvolumen) und in Fällen von transgenen und gezielte Mutante Mausmodellen der Herzerkrankungen 6,7, kann Einblicke in die genetischen Faktoren Herz-Kreislauf-Funktion zu ändern ergeben. Tatsächlich Analysen von embryonalen Gehirngefäß quantitative und qualitative 2D sind bereits verwirklicht 8. Weiterhin stellt die Mausembryo als ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der Bindung von Zielmikrogefäßmarker in vivo. Bartelle et al. 9, zum Beispiel, haben Avidin Mikroblasen in Embryo Herzkammern eingeführt zu beurteilen, zielgerichtete Bindung in Biotag-BirA transgenen Embryonen und untersuchen Gefäßanatomie. Eine wichtige Benchmark bei der Übersetzung dieser Technik in die Klinik – Die Erzeugung von heterozygote und homozygote Maus-Modelle können auch als Ersatz für die Tumor-Modell-Studien mit dem Ziel, die quantitative Natur der molekularen Ultraschall definieren verwendet werden.

<p class = "jove_content"> Mikroblasen werden am häufigsten an den embryonalen Kreislauf über intrakardiale Injektionen in einzelnen Embryos durch einen Bauchschnitt 8-10 ausgesetzt eingeführt. In utero Injektionen, jedoch mit einer Reihe von Herausforderungen. Dazu gehören Injektion Führung, die Notwendigkeit, die Bewegung in der Mutter und exteriorisierten Embryo zu begegnen, die Aufrechterhaltung der hämodynamischen Lebensfähigkeit in der Mutter und außen gelegt Embryonen Bewältigung langfristigen Auswirkungen der Narkose und Komplikationen durch Blutungen 11. Daher ist das Ziel der Untersuchung war es, eine Technik zum Injizieren von Mikroblasen in isolierte Lebensspätstadium Embryonen 12 zu entwickeln. Diese Option bietet mehr Freiheit hinsichtlich der Einspritzsteuerung und die Positionierung, die Reproduzierbarkeit der Bildebene ohne Hindernis, und vereinfachte Bildanalyse und Quantifizierung.

In der vorliegenden Studie haben wir in lebende Mäuse-Embryonen fo skizzieren ein neues Verfahren für die Injektion von Mikrobläschenr die Zwecke der Untersuchung von Mikrobläschen Kinetik und des Studiums gezielt Mikroblasen-Bindung an endogene endothelialen Oberflächenmarker. Nicht-lineare Kontrast spezifischen Ultraschall-Bildgebung wird verwendet, um eine Reihe von Grund Perfusionsparameter einschließlich Spitzenverstärkung (PE), Wasch in Rate und Zeit (TTP) in isolierten E17.5 Embryonen Spitze messen. Wir zeigen auch die Wirksamkeit des Embryos Modell zur Bewertung der quantitativen Natur der Molekular Ultraschall in einem embryonalen Endoglin Funktionsverlust transgenes Mausmodell, in dem Endoglin ist ein klinisch relevanten Ziel aufgrund seiner hohen Expression in vaskulären Endothelzellen an Stellen aktiver Angiogenese 13 . Die Haftung der Endoglin-bezogene (MB E), Ratte Isotyp IgG 2 Steuer (MB C) und ungezielte (MB U) Mikroblasen in heterozygote Endoglin (Eng +/-) und homozygot Endoglin (Eng + / +) exprimieren Embryonen untersucht. Analyse der zielBinding zeigt, dass molekulare Ultraschall in der Lage, die Unterscheidung zwischen Endoglin Genotypen und beziehen Rezeptordichten quantifizierbare molekulare Ultraschall Ebenen ist.

Protocol

HINWEIS: Die in dieser Studie durchgeführt experimentellen Verfahren wurden von der Animal Care Committee bei Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada) zugelassen. Die Verfahren für die humane Behandlung von Tieren muss jederzeit eingehalten werden. Es wird angenommen, daß der Prüfer in den Grundbetrieb eines Ultraschall-Bilderzeugungssystem ausgebildet. Dieses Protokoll funktioniert am besten mit zwei Personen. 1. Tiermodelle Mate-CD-1 männlich und weiblich <e…

Representative Results

Die Injektion von Ultraschallkontrastmitteln in ex utero Mausembryonen ist abhängig von der erfolgreichen Isolierung von lebenden spät Gestationsalter Embryonen aus dem Uterus und Wartung der Lebensfähigkeit im Verlauf der Injektion und ähnliche Ultraschallbildgebung. Nachdem der Embryo wurde nach außen verlagert und so positioniert, wie in Figur 1 gezeigt, ist eine sorgfältige Injektion von Kontrastmittel in den embryonalen Gefßsystems möglich. Eine typische B-Mode-Ultraschallbild eine…

Discussion

Ultraschallkontrastmittel wurden in der Spätphase der Trächtigkeit Mausembryonen und nichtlineare Kontrastbilder injiziert wurden erworben, um die Perfusion Parameter zu messen und zielgerichtete Mikrobläschen verbindlich. Erfolgreiche Abbildung von Mikrobläschen in embryonalen Vaskulatur war abhängig von einer Reihe von Faktoren, wobei der erste Embryo Lebensfähigkeit. Die gesamte Ausrüstung und die Vorrichtung wurden im Voraus, um die Zeit für die Trennung von Embryonen aus dem Uterus zu Beginn der Einspritzun…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.

Materials

Reagents Company Catalog Number Comments/Description
Antibodies (biotinylated, eBioscience) Antibody choice depends on the experiment
      rat isotype IgG2 control eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
      biotin anti-mouse CD309 eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
     500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose Sigma D5796
     50 mL Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020 lot # 7592456
     Hepes  Gibco 15630 5mL, 1M
     Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140-122 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100×20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60×15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 mL BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8x magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 mL Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 mL VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110oC VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

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Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

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