Her presenterer vi en protokoll for å injisere ultralyd mikrobobleutskillere kontrastmidler i stue, isolerte sent svangerskap scenen murine embryoer. Denne metoden gjør det mulig å studere perfusjon parametere og av vaskulære molekylære markører innenfor embryo ved hjelp av kontrastforsterket høyfrekvente ultralydavbildning.
Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.
Kontrastforsterket ultralydavbildning gjør bruk av agenter mikrobobleutskillere kontrast å visualisere og karakterisere vaskulær miljø. Disse agentene aktiver invasiv vurdering av mikrosirkulasjonen, vaskularitet og kardiovaskulær funksjon. I tillegg kan modifikasjon av bobleoverflaten resulterer i målrettet mikroboble-binding til endotelceller biomarkører, som vist i prekliniske anvendelser av angiogenese, aterosklerose og inflammasjon 1,2 gjør molekylultralydavbildning av vaskulære hendelser mulige. Kontrastforsterket ultralyd kan derfor brukes til å identifisere de komplekse og ulike miljøer som påvirker friske og syke vaskulære tilstander 3-5.
I det siste nummeret av årene har interessen for nytten av mikroboble bildebehandling utvidet til den allsidige museembryo modell. Som en modell for pattedyr utvikling, innføring av mikrobobler inn i den embryonale blodkar forbedrer fysiologiskestudie av utviklingen av sirkulasjonssystemet (for eksempel blodstrøm, minuttvolum) og i tilfeller av transgene og målrettede mutante mus modeller av hjertesykdom 6,7, kan gi innsikt i hvordan genetiske faktorer endre kardiovaskulær funksjon. Faktisk analyserer kvantitativt og kvalitativt 2D av embryonale hjerne vaskulaturen har allerede blitt oppnådd 8. Videre presenterer museembryo som en utmerket modell for å undersøke bindingen av målrettede mikrobobler til vaskulære markører in vivo. Bartelle et al. 9, for eksempel, har innført avidinbelagte mikrobobler inn embryo hjerte ventriklene å vurdere målrettet binding i Biotag-Bira transgene embryoer og undersøke vaskulær anatomi. Generering av heterozygote og homozygote musemodeller kan også brukes som et surrogat for tumormodellstudier tar sikte på å definere den kvantitative innholdet av molekylært ultralyd – et viktig referansesette denne teknikken til klinikken.
<p class = "jove_content"> Microbubbles er oftest introdusert til embryonale sirkulasjonen via intrahjerte injeksjoner i enkelt embryoer eksponert gjennom en laparotomi 8-10. I utero injeksjoner, men står overfor en rekke utfordringer. Disse inkluderer injeksjon veiledning, behovet for å motvirke bevegelse i mor og exteriorized embryo, vedlikehold av hemodynamisk levedyktighet hos mor og utlagte embryoer, adressering langsiktige effektene av anestesi og komplikasjoner på grunn av blødning 11. Derfor er målet med undersøkelsen har vært å utvikle en teknikk for å injisere mikrobobler inn i isolert levende sent stadium embryoer 12. Dette alternativet gir mer frihet i form av injeksjon kontroll og posisjonering, reproduserbarhet på bildeplanet uten hindringer, og forenklet bildeanalyse og kvantifisering.I denne studien, skisserer vi en roman prosedyre for injeksjon av mikrobobler i levende museembryoer for det formål å studere mikroboble kinetisk atferd og studere målrettet mikrobobleutskillere binding til endogene endothelial markører overflate. Ikke-lineær kontrast spesifikk ultralydavbildning brukes til å måle av en rekke grunnleggende perfusjon parametere inkludert peak enhancement (PE), vaske-in rate og tid til maksimal (TTP) i isolerte E17.5 embryoer. Vi demonstrerer også gyldigheten av embryoet modell for vurdering av kvantitativ natur molekylær ultralyd i en embryonale endoglin tap av funksjon transgen musemodell, hvor endoglin er en klinisk relevant mål på grunn av sin høye uttrykk i vaskulære endotelceller på steder med aktiv angiogenese 13 . Heft endoglin-målrettet (MB E), rotte isotypen IgG 2 kontroll (MB C) og vilkårlige (MB U) mikrobobler evalueres i heterozygot endoglin (Eng +/-) og homozygot endoglin (Eng + / +) uttrykker embryoer. Analyse av målrettet binding avslører at molekyl ultralyd er i stand til å skille mellom endoglin genotyper og relatert reseptor-tettheter for å kvantifiserbare molekylultralydnivåer.
Kontrastmidler ultralyd ble injisert i sent stadium svangerskapet museembryoer og bilder lineære kontrast ble kjøpt for å måle perfusjon parametere og målrettet mikrobobleutskillere bindende. Vellykket avbildning av mikrobobler i embryoniske blodkar var avhengig av en rekke faktorer, den første er embryo levedyktighet. Alt utstyr og apparatur ble fremstilt på forhånd, for å minimalisere den tid som er nødvendig for isolasjon av embryoer fra livmoren til begynnelsen av injeksjonen. Siden effekten av enkel eller…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.
Reagents | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibodies (biotinylated, eBioscience) | Antibody choice depends on the experiment | ||
rat isotype IgG2 control | eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
biotin anti-mouse CD309 | eBioscience | 13-5821-85 | |
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
Distilled water | |||
Embryo media | |||
500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose | Sigma | D5796 | |
50 mL Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
Hepes | Gibco | 15630 | 5mL, 1M |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep |
Ethanol, 70% | |||
Ice | |||
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
Equipment | |||
Cell culture plates (4) : 100×20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
Cell culture plates (12) : 60×15 mm | Sigma | D8054 | |
Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
Conical tubes, 50 mL BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
Gloves | Ansell | 4002 | |
Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
Hot plate | VWR | 89090-994 | |
Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
Scissors | |||
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” | VWR | 63010-007 | |
Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
Surgical microscope 5-8x magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
Syringes, 1 mL Normject | Fisher | 14-817-25 | |
Syringes (10), 30 mL | VWR | CA64000-041 | |
Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
Thermometer, -20-110oC | VWR | 89095-598 | |
Timer | VWR | 33501-418 | |
Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 |