Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

doi: 10.3791/52531 Published: April 20, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل 1 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء 2-4.

Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral 6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids.

transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء.

تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد Polyethylenimine (PEI) كما ترنسفكأيشن الكاشف

  1. حل حوالي 150 ملغ من PEI إلى 100 ​​مل من H 2 O.
  2. ضبط حل لدرجة الحموضة 7.4 بإضافة حمض الهيدروكلوريك حتى يصبح حل واضح ويقلب حتى يذوب تماما. وهذا قد يستغرق ما بين 10 و 60 دقيقة والمياه إضافة إلى تركيز نهاية 1 ملغ / مل.
  3. عندما اضح، تصفية حل PEI من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية في aliquots من 5 مل.

2. إنتاج Lentiviral الجسيمات

اليوم 1:

  1. خلايا HEK293T انقسم الى 60٪ -80٪ confluency في 162 سم 2 قارورة أو طبق بتري كبير في خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 2 ملي الجلوتامين الملحق).

يوم 2:

  1. إعداد DNA الحل ترنسفكأيشن التي تحتوي على 45 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد بإضافة معاناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (7 ميكروغرام من pVSVg، 5 ميكروغرام من pRSV مراجعة (13)؛ ميكروغرام من pMDL) و 20 ميكروغرام من البلازميد lentiviral ترميز الجينات في المصالح أو shRNA من الاهتمام. التكيف مع حجم 1 مل باستخدام DMEM.
  2. إعداد PEI الحل ترنسفكأيشن من خلال إضافة 90 ميكرولتر من 1 ملغ / مل PEI إلى 930 ميكرولتر من DMEM واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة DNA الحل ترنسفكأيشن إلى حل PEI. دوامة أو عكس عدة مرات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حل ترنسفكأيشن الحمض النووي.
  4. بالتنقيط 2 مل من محلول ترنسفكأيشن الحمض النووي على الخلايا HEK293T واحتضان لمدة 4 ساعات في ترطيب حاضنة الثقافة خلية على 37 ° C.
  5. بعد 4 ساعات، وتحديث مستنبت لإزالة PEI. وليس من الضروري أن يغسل خلايا قبل أن يضيف الوسيلة الجديدة.
    ملاحظة: PEI غير السامة للخلايا وحضانة مرات أطول من 4 ساعات قد يسبب ضررا للخلايا HEK293T.

اليوم 4:

  1. استبدال سوبrnatant مع الجديد مستنبت. الحفاظ طاف (التي تحتوي على فيروس)؛ هذا وسوف تستخدم في الخطوة 2.10.
  2. وضع طاف في 15 مل قارورة. لإزالة الخلايا الميتة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
  3. دفع طاف من خلال 0.45 ميكرون فلتر باستخدام حقنة كبيرة 60 مل. تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

يوم 5:

  1. جمع الدفعة الثانية من طاف. الطرد المركزي ومرشح كما هو الحال في الخطوات 2،8-2،9.
  2. تجميع supernatants من الخطوات 2.9 و 2.10 في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي في 50،000 x ج في نابذة فائقة السرعة لمدة 90 دقيقة.
  3. تأخذ بها كبسولات تحتوي على أنابيب نابذة فائقة السرعة بعناية فائقة ووضعها في غطاء تدفق الصفحي، وتذكر التوجه من الأنبوب داخل أجهزة الطرد المركزي.
  4. كبسولة مفتوحة عقد أنبوب نابذة فائقة السرعة والمتوسطة صب بعناية في مثل هذه الأزياء التي بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب. منذ الكريات الفيروسية قد يكون من الصعب تصور، تذكر على ماجانب من أنبوب بيليه سيكون قد تشكلت. اتخاذ ممص مكروى وإزالة الجزء الأخير من المتوسط ​​مع الحرص على عدم تستنهض الهمم بيليه البني مبهمة التي مرئيا على جانب من الجزء السفلي من أنبوب نابذة فائقة السرعة.
  5. و resuspend هذا بيليه في 500 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع 10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021، 10 ميكرومتر Y27632 و 8 ميكروغرام / مل polybrene. إعادة تعليق في هذه الوسيلة هي مهمة منذ يستخدم الفيروس عيار عالية لtransduct organoids مباشرة.
  6. اختياريا: تجميد الفيروس في هذه الوسيلة aliquoted على دفعتين من 250 ميكرولتر في -80 ° C.

3. Lentiviral تنبيغ من Organoids

اليوم 0:

  1. تقسيم كامل 0.95 سم 2 جيدا organoids يومين قبل تنبيغ في بئر جديد، وتهدف إلى الحصول على ما يقرب من 50 organoids صغير. تقسيم organoids وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 1 (الشكل 3A، B).
  2. تكملة عضي مستنبت مع 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ملي نيكوتيناميد للحصول فرط الكيسي أقبية التكاثري (الشكل 3C).
    ملاحظة: سوف أقبية الكيسي تطوير أفضل عندما تزرع organoids تقسيم حديثا في وجود Chir99021.

يوم 2:

  1. organoids الحصاد قبل pipetting صعودا ونزولا على matrigel والمتوسطة، وبالتالي تعطيل الخليط مع ممص مكروى P1000. ضع الخليط في أنبوب 15 مل.
  2. تعطيل باستخدام مزيد من باستور الماصة التي قد انخفضت افتتاح البعيدة عن ذوبان. organoids أجهزة الطرد المركزي لتكوير لمدة 5 دقائق في 100 × ز.
    ملاحظة: تعتمد على حجم الطرد المركزي، واستخدام سرعة أجهزة الطرد المركزي مختلفة. فمن الضروري للعثور على سرعة الدقيقة التي تعطلت يتم فصل organoids من الخليط.
  3. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من قبل تحسنت التربسين 1X (على غرار 0.25٪ التربسين). و resuspend organoids في التربسين واحتضان3 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  4. تعطيل التربسين بإضافة 3.5 مل من خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والجلوتامين). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
  5. إزالة طاف لترك بيليه في حوالي 20 ميكرولتر من المتوسط. نقل organoids في هذا المبلغ صغير الأخير من المتوسط ​​في بئر على طبق من ذهب 48-الآبار.
  6. إضافة العالية عيار الفيروسة البطيئة في التنبيغ المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 2.14، في resuspend وانتقل إلى الخطوة 3.10. عندما تواجه منخفضة التنبيغ فعالية، خطوة 3.9 ويمكن أن يضاف.
    ملاحظة: للحصول على التنبيغ كفاءة، وعادة إضافة قسامة واحدة من 250 ميكرولتر من ارتفاع عيار الفيروسة البطيئة للبئر واحدة من organoids. وهذا يمثل 50٪ من جميع الفيروسة البطيئة تحصد من إنتاج واحد كما هو موضح في الخطوة 2 من هذا البروتوكول.
  7. اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، نفذ spinoculation من خلال وضع لوحة تحتوي على الآبار organoids 48 في مرحلة ما قبل درجة حرارة الطرد المركزي على 326؛ C وتدوير في 600 x ج لمدة 1 ساعة.
  8. وضع خليط فيروس عضوي الشكل في الثقافة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة للسماح التنبيغ.
  9. اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، واحتضان organoids لمدة 3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة.
  10. إضافة 1 مل من عضوي الشكل مستنبت و resuspend خليط فيروس عضوي الشكل، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 850 x ج لتكوير organoids.
  11. إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر من matrigel الجليد الباردة. منذ المواد يتصلب عندما يصبح أكثر دفئا، واستخدام نصائح ماصة التي توترت بسبب pipetting صعودا وهبوطا الجليد PBS البارد لعدة مرات.
  12. وضع قطرة في منتصف بئر في لوحة 48 بئرا واحتضان في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيخ.
  13. بعد 15 دقيقة، إضافة بعناية 250 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ميكرومتر Y27632. سوف شظايا عضي تعطلت صغيرة تشكل في organoids الكيسي صغير خلال 24 ساعة.

يوم 5:

  1. تحديث المتوسطة وتكملة مع مضاد حيوي التحديد (لبوروميسين، استخدم 4 ميكروغرام / مل).

يوم 7:

  1. استبدال المتوسطة لمعيار مستنبت عضي، على أن تستكمل مع اختيار المضادات الحيوية.
    ملاحظة: سوف الناشيء تكون كاملة 2-3 أسابيع بعد Chir99021 الانسحاب. بعد الاختيار، قد نمت organoids دون اختيار المضادات الحيوية.

4. عضي إعداد RNA لالكمي RT-PCR أو ميكروأري

  1. لإعداد RNA، واستخدام عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إزالة المتوسطة من organoids وإضافة 350 ميكرولتر من العازلة RLT، على أن تستكمل مع β المركابتويثانول مباشرة على قبة matrigel تحتوي على organoids. Resuspend والعتادالقاعدة في RLT من قبل pipetting باستخدام P1000 ممص مكروى.
  2. أداء مزيد من الإعدادية RNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  3. اختياريا: زيادة الغلة RNA عن طريق التضخيم باستخدام نظام الحفاوة بيكو WTA، والتي تتطلب مدخلات الأولي من 50 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  4. اختياريا: لمراقبة الجودة قبل RNA ميكروأري، تشغيل العينات على 2100 bioanalyzer باستخدام حقيقي النواة مجموع RNA نانو رقاقة، وتهدف لعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من 8.5 أو أكثر (الشكل 5) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

5. معالجة Organoids لتضمين البارافين والمناعية

  1. قبل الشروع في عضي تضمين ما قبل الحارة كتلة الألومنيوم مع الثقوب لتركيب 12 ملم أنابيب زجاجية قطرها في حاضنة عند 70 درجة مئوية للحفاظ على البارافين السائل.
  2. خذ بئر واحد مع organoids كامل نما وإزالة المتوسطة، وترك organoids جزءا لا يتجزأ سليمة.
  3. إضافة 1 ملمن بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني مباشرة إلى جيدا وإصلاح في 4 درجات مئوية في أي مكان من 1 ساعة ليلة وضحاها.
  4. استبدال بارافورمالدهيد مع 1 مل من الجليد الباردة PBS.
    اختياريا: الحفاظ على organoids الثابتة في برنامج تلفزيوني يصل إلى 1 في الاسبوع عند 4 درجة مئوية بعد هذه الخطوة.
  5. و resuspend organoids الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومكان في زجاج القارورة.
  6. السماح organoids تنزل الى القاع لمدة 1 دقيقة، صب PBS واستبدالها مع 70٪ من الإيثانول التي يتم فيها حل بضع قطرات من محلول يوزين لتمكين التصور من organoids في جميع مراحل عملية التضمين.
  7. ترك organoids في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، وإزالة 70٪ من الإيثانول عن طريق الصب بعناية، والقدرة على تصور organoids قبل العين بسبب بسيط وردي اللون يوزين. استبدال تضمين حل مع 96٪ من الإيثانول.
  8. كرر الخطوة 5.7، في كل مرة يحل محل الحل تضمين مع واحد القادم. تمرير organoids من خلال الحلول التالية لاحقا: 70٪ من الإيثانول و 90٪ من الإيثانول و 96٪ من الإيثانول، و 100٪ الإيثانولنول، و 100٪ من الإيثانول، الزيلين والزيلين.
  9. صب غسل زيلين الماضي وتصب البارافين في أنبوب. وضع أنبوب على الفور في مرحلة ما قبل درجة حرارة كتلة الألومنيوم عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واستبدال البارافين مع البارافين نظيفة الجديد.
  10. صب البارافين قبالة والماصة organoids في القالب كتلة البارافين باستخدام درجة حرارة ما قبل باستور الماصة مع فتحة كبيرة. الحفاظ باستور الماصة دافئة باستخدام موقد بنسن. وضع كافة organoids في قالب كتلة البارافين في طبقة صغيرة من البارافين السائل.
  11. قدر الإمكان، في محاولة للتلاعب كل organoids نحو وسط القالب كتلة البارافين باستخدام إبرة تشريح تحسنت. حافظ على تشريح إبرة دافئة باستخدام بنسن الموقد.
  12. عندما توطين organoids في قالب غير مرضية، والبرد القالب قليلا ليصلب طبقة البارافين.
  13. الانتهاء من كتلة بصب المزيد من البارافين على رأس وإضافة معيار النسيجي التضمين الكاسيت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تنبيغ lentiviral عضوي الشكل

تقنية التنبيغ عضوي الشكل باستخدام الجزيئات lentiviral تعتمد على المعالجة الصحيحة للorganoids قبل وأثناء التنبيغ. كانت Organoids (الشكل 3A) مثقف وأنها تعطلت في أقبية واحدة (الشكل 3B). كما ذكرت سابقا، أصبحت هذه الأقبية واحدة، عندما مثقف في وجود المانع GSK3 Chir99021 أقبية الكيسي 9 (الشكل 3C). وفي وقت لاحق تم trypsinized organoids للسماح للاختراق من جزيئات الفيروس إلى الخلايا واحد. عندما transducing الخلايا مع جزيئات lentiviral، عدد من الطرق يجوز محاكمة لتعزيز فعالية التنبيغ مثل spinoculation أو الحضانة لفترات طويلة. وقد استخدم عالية عيار PGK-EGFP الفيروسة البطيئة لتمكين التصور من فعالية التنبيغ بواسطة المجهر الفلورسنت. كانت فعالية تنبيغ organoids مع هذا البلازميد عالية واقتربت 100٪ (شملت رقمالبريد 4E، F). تحسين فعالية استخدام spinoculation (الشكل 4A، B) أو الحضانة لفترات طويلة مع جزيئات lentiviral (الشكل 4C، D) لم بالتالي لا تسفر عن قيمة إضافية.

استخراج الحمض النووي الريبي

كانت تزرع organoids المقبل لاستخراج الحمض النووي الريبي. تم حصاد organoids كامل نمت التي تعرضت لأشعة جاما أو المعاملة التحكم لتظهر انخفاض سلامة الحمض النووي الريبي (الشكل 5). على التشعيع مع 6 غراي، RNA هو المتدهورة ومقارنة للسيطرة على organoids المعالجة، يتم تقليل عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين).

المناعية على البارافين جزءا لا يتجزأ من organoids

بعد احتضان organoids لمدة 2 ساعة في الثقافة المتوسطة تستكمل مع BrdU، كانت ثابتة organoids في الفورمالين ومعالجتها لالمناعية (الشكل 6). باستخدام الماوس مكافحة BrdU، يمكن ملاحظة خلايا التكاثري في سرداب-SEGMالوالدان من organoids وليس في حجرة متباينة.

الشكل (1)
الشكل 1:. تخطيطي للإنتاج الفيروسة البطيئة لالتنبيغ عضوي الشكل كما هو مكتوب في البروتوكول جزء 2، في هذا التخطيطي، وتتمثل الخطوات الأكثر أهمية من إنتاج فيروس مع أرقام خطوة البروتوكول وتوقيت.

الشكل 2
الشكل 2: رسم تخطيطي للتنبيغ lentiviral من organoids كما هو مكتوب في البروتوكول جزء 3، في هذا التخطيطي، وتتمثل الخطوات الأكثر أهمية من التنبيغ عضوي الشكل مع أرقام خطوة البروتوكول وتوقيت.

الشكل (3)
الشكل 3: Organoids قبل وأثناء ترانيتم تقسيم sduction. organoids المتزايد عادة (A) إلى تزايد كثافة organoids صغير (B) التي تصبح الكيسي بعد الحضانة مع Chir99021 لعدد من الأيام (C). على تفكك هذه organoids باستخدام التربسين، وخلايا واحدة وكتل صغيرة من الخلايا تبقى (D) التي تم transduced في وقت لاحق. مقياس شريط 100 ميكرون.

الشكل (4)
. الشكل 4: تنبيغ من organoids باستخدام ناقلات التعبير lentiviral الصور Brightfield (A، C، E، G) والصور الفلورسنت (B، D، F، H) من organoids التي تم transfected مع إما PGK-EGFP الفيروسة البطيئة (A - F) أو السيطرة الفيروسة البطيئة (G، (A، B)، spinoculation فقط (C، D) أو أي خطوات إضافية لزيادة فعالية التنبيغ (E، F)، مقارنة للسيطرة على ناقلات transduced organoids، التي لا التعبير عن EGFP (G، H). لاحظ أن استخدام PGK-EGFP lentiviral بناء، لا يتم زيادة كبيرة فعالية التنبيغ خطوات إضافية. مقياس شريط 100 ميكرون.

الرقم 5 الشكل 5: نتيجة التمثيلية للمحضرات RNA من organoids على bioanalyzer ملاحظة ترسيم قوي من العصابات تمثل سلامة الحمض النووي الريبي عالية في الممرات 2-4 وتشويه حول العصابات على الممرات 5-7 تمثل سلامة سجل RNA. عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من العصابات 2-4 هو 8.7، 9.2 و 9 على التوالي، في حين رانه RIN العصابات 5-7 هو 6.4، 6.6 و 5.5.

الشكل (6)
الشكل 6: تحليل المناعى من الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من organoids الفورمالين البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من 4 ميكرون قسم من organoids مثقف في وجود BrdU لمدة ساعتين وثابتة في وقت لاحق. اتسخت القسم مع الأجسام المضادة لمكافحة BrdU. مقياس شريط 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وسط قاعدي الإضافات
خط الخلية مستنبت DMEM 10٪ FCS
1٪ البنسلين / الستربتومايسين
2 مم جليليutamine
عضوي الشكل مستنبت المتقدم DMEM F12 HEPES
1٪ البنسلين / الستربتومايسين
1X glutamax
1٪ N2 ملحق
2٪ B27 الملحق
125 نانومتر ن-أسيتيل سيستين
الماوس EGF (50 نانوغرام / مل)
10٪ نوج-FC المتوسطة مكيفة (ما يعادل 100 نانوغرام / مل)
10٪ Rspo1-FC المتوسطة مكيفة (ما يعادل 500 نانوغرام / مل)

الجدول 1: الثقافة المتوسطة التكوين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية.

وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي الأبعاد من organoids يجعل من الصعب اختراق من قبل الجسيمات الفيروسية، ويتم استخدام عدد من الأساليب لزيادة الفعالية. المعالجة المسبقة لorganoids باستخدام Chir99021 يزيد انتشار وبالتالي جدوى بعد التنبيغ. فمن المهم للحفاظ على مجموعات زنزانة صغيرة بعد trypsinization، منذ الخلايا واحد قد انخفضت البقاء على قيد الحياة. وعلى النقيض من transductions الفيروسية باستخدام الارتجاعي الفئران، transductions lentiviral هي أكثر كفاءة وعادة لا تتطلب spinoculation، وهي تقنية معروفة لفعالية الزيادات التنبيغ في خلايا ES 10. عند استخدام الفيروسات القهقرية الفئران أو WHأون عوائد تنبيغ lentiviral فعالية منخفضة، ويمكن اختياريا أن تستخدم spinoculation لزيادة معدل التنبيغ. نحن لا تقييم بانتظام عيار الفيروس، حيث أن جميع الفيروس المتوفر من جولة واحدة من الإنتاج لتنبيغ organoids المستمدة من الحد الأقصى اثنين 0.95 سم 2 الآبار كانت تستخدم. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم عموما اختيار المضادات الحيوية لإزالة الخلايا غير transduced. ومع ذلك تقييم عيار الفيروسية قد تكون ذات قيمة عند مواجهة مشاكل مع فعالية التنبيغ.

مطابقة لخلايا ملتصقة، لا يمكن للمستوى اختيار المضادات الحيوية يزيد من عدد من التكامل الفيروسية وبالتالي التعبير عن التحوير. استخدام بوروميسين رفيع المستوى (10 ميكروغرام / مل) للحصول على التعبير المعدلة وراثيا عالية وضربة قاضية فعالة، ولكن عندما علامات organoids معرض سمية، ويمكن استخدام مستويات أقل (الحد الأدنى 1 ميكروغرام / مل). وبالإضافة إلى ذلك، والمضادات الحيوية اختيار بديلة يمكن أن تستخدم أو قد تكون حذفت الاختيار، على الرغم من أن التنبيغ من المرجحأن تكون ناقصة وهذا قد لا يؤدي إلى التعبير مستقرة طويلة الأجل. وعلاوة على ذلك، منذ التكامل lentiviral في الجينوم هو غير متجانس في جميع أنحاء السكان من الخلايا، تعبير عن التحوير يمكن إخضاع إلى التغييرات بعد زراعة الخلايا لفترة طويلة من الوقت. قد يؤدي هذا الضغط الانتقائي من قبل تعبير عن التحوير. على الرغم من أن اختيار المضادات الحيوية تحد هذه التغييرات، فإنها قد لا تزال قائمة، وخاصة في حالة التعبير التأسيسي من الجينات المحورة. ويمكن التغلب على هذا العيب عن طريق الاستنساخ خلية واحدة من organoids، ولكن هذا الأسلوب هو مضيعة للوقت. التنبيغ Lentiviral يمكن القيام بها مع مجموعة واسعة من البلازميدات التي تؤدي إلى إما التعبير مستقر أو محرض من الجينات المحورة. عادة ما يتم التعبير عن هذه الجينات المحورة من المروجين في كل مكان، مثل CMV أو المروج PGK ويمكن أن يؤدي في التعبير خارق للطبيعة. وعلى غرار overexpression المعدلة وراثيا في خطوط الخلايا السرطانية أو الحيوانات نموذج، هناك ما يبرر الحذر تفسير النتائج جيئة وذهابام overexpression.

للتجارب التي تتطلب RNA، وانخفاض عدد خلايا قابلة للحياة نمت عادة في واحدة 0.95 سم 2 جيدا (مساحة قياسية من 48 أيضا) على النقيض من الخلايا الملتصقة التي يمكن بسهولة أن تزرع في قوارير كبيرة هو عامل يحد من معدل للجودة وعدد وافر من تحليل المصب. نجد أن عادة، بئر واحد من ما يقرب من 50 كامل نمت عائدات organoids بين 0.4 ميكروغرام و 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع، ويجري كافية لالكمي RT-PCR RNA وميكروأري دون مزيد من التضخيم. يمكن علاجية معينة أو تغيرات جينية تقلل من المحتوى RNA ولكن إلى حد كبير. الخطوة الأولى لزيادة إجمالي RNA يتم تجميع الآبار متعددة.

لتضمين البارافين من organoids، فمن الأهمية بمكان للحصول على مواد كافية من أجل رؤية organoids أثناء العملية. إضافة كميات ضئيلة من يوزين لorganoids ثابتة تسمح التصور من خلال organoids كلهالعملية، ولكن لا يلزم لتضمين العادي ويمكن حذف عندما تتدخل هذه الخطوة مع مزيد من التحليل. عادة، والأشرطة-تضمين البارافين بها ثقوب فيها للسماح تدفق تثبيتي، وعملية حلول للالأنسجة في الكاسيت.

التنبيغ عضوي الشكل Lentiviral والتحضير للتقنيات القياسية المصب يزيد الإمكانات العلمية لهذه الثقافات ويرفع مستوى في الثقافة الخلية لتقنيات ثلاثية الأبعاد من ظهارة الأمعاء الأولية. مجموعة من التجارب المصب التي يتعين القيام بها ولكن لا تقتصر على التقنيات الموضحة في البروتوكول الحالي ويمكن أن تشمل جميع التقنيات التي تجرى على خطوط الخلايا أو الفئران، ونظرا لكمية المواد الخلوية الناتجة عن ثقافة غير كافية. في البحث عن عناصر محددة الوراثية وظيفتها في ظهارة الأمعاء، وتقنيات إعادة التركيب مثلي في الحيوانات نموذج، وأبرزها الفئران، يبقى معيار الذهب. ثقافات organoids تفعللا يحتوي على الوسيطة أو المتخصصة المناعية الخلايا وأقبية مثقف تتوسع من أي وقت مضى، المتناقضة الوضع وجدت في الجسم الحي. ومع ذلك، فقد أثارت هذه الثقافات نوعية في المختبر النتائج بشكل كبير ومع مراعاة تقنيات المصب لا تعد ولا تحصى التي يمكن القيام بها، والثقافة عضي لها وسوف يعزز إلى حد كبير البحوث على ظهارة الأمعاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene imine Polysciences 23966-2
DMEM medium Lonza BE12-614F
Fetal calf serum Lonza DE14-801F
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Glutamin Invitrogen 25030-024
matrigel BD BD 356231
Advanced DMEM-F12 Gibco 12634-010
N2 Invitrogen 17502-048
B27 Invitrogen 17504-044
N-acetyl cysteine Sigma A9165-1G
mouse Egf Invitrogen PMG8045
Hepes 1 M Invitrogen 15630-056
glutamax 100x Invitrogen 35050-038
Chir 99021 Axon 1386
Y27632  Sigma Y0503-5MG
polybrene Sigma 107689
nicotinamide Sigma N0636
Trypsin Lonza BE02-007E
puromycin Sigma P 7255
Rneasy mini kit Qiagen 74106
β-mercaptoethanol Merck 8,057,400,250
Ovation Pico WTA system NuGen 3300-12
paraformaldehyde Sigma 252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml VWR LSUKM12
Eosin Yellowish VWR 1,159,350,025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40, (1), 63-69 (1982).
  3. Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303, (5664), 1684-1686 (2004).
  4. Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132, (4), 1331-1343 (2007).
  5. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8, (10), e76871 (2013).
  6. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2012).
  7. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3, (4), 1128-1139 (2013).
  8. Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12, (5), 2099-2108 (1993).
  9. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, (7360), 293-297 (2011).
  10. Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54, (2-3), 131-143 (1995).
بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).More

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter