In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.
Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.
אפיתל במעי הוא אחד מרקמות הגוף במהירות הרבה ביותר מתרבות, אשר גרמו לו למשוך עניין רחב ממחקר על תאי סרטן וגזע. בשינה 2009 פורסמה טכניקה ליצירת תרבויות לאורך זמן של מאורות מעי דקים בmatrigel, שימור מבנה ממדי 3 1. מבנים אלה, קרוי organoids מעיים, יכול להיות מתורבת באמצעות טכניקות סטנדרטיים, עם סובבים בתוספת בינונית עם מספר גורמי צמיחה מוגדרים, כולל הגולגולת של מעכב מסלול BMP-איתות (קולב), משפר מסלול Wnt-איתות rspondin 1 (Rspo1) ו גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כל מצא כדי לשפר את התפשטות מעיים 2-4.
Organoids לעלות שורות תאי הסרטן מסורתיות בהיבטים שהם-מוטציה שאינן, יש לשמור על היררכיה בתאי גזע, להציג קיטוב סלולארי ללא פגע ובידול תערוכה לכל תא השושלות שנמצאו בint הקטן המתהווהאפיתל estinal. שכן הם יכולים להיות transduced לבצע transgenes או התערבות RNA בונה 5, הם משמשים ללמוד אלמנטים גנטיים ספציפיים, להכריע ניסויים באמצעות עכברים הטרנסגניים בהיבטים של עלות ומהירות. ביטוי מהונדס בorganoids יכול להתבצע גם באמצעות retroviral העכברית או וקטורי lentiviral 6,7. בשל המגבלות של רטרווירוסים עכבריים, מסוגלים transducing תאי mitotic באופן בלעדי 8, התמרה lentiviral היא בתדירות גבוהה יותר בשימוש בתאים שקשה להדביק, כגון organoids.
באופן ויראלי transduced וorganoids המהונדס ביציבות להביע יכול לשמש למספר רב של ניתוחים במורד הזרם, כולל RNA ניתוחים כמותיים ואימונוהיסטוכימיה. יחדיו, התרבות של organoids מתאי אפיתל במעי עיקרי התפתחה טכניקה שגרתית שהיא קל ליישום ללא דרישות מעבדה ספציפיות, והפכה לסטנדרט ברומן ceתרבות ll במחקר על אפיתל במעי.
טכניקות של התמרה ויראלית וניתוח במורד הזרם שלאחר מכן בorganoids הן מייגע לבצע ולסייע לניסויי organoid נוצר פרוטוקול וידאו זה, המציג שיטות לתמרת lentiviral של organoids התרבותי. אנחנו בנוסף להראות כיצד נכונים עיבוד של organoids יכול להגדיל את התשואה ולכן לשפר את הביצועים של ניתוח במורד הזרם תוך שימוש בטכניקות RNA או אימונוהיסטוכימיה. בפרוטוקול, organoids שנגזרים ממאורות מעיים קטנים שימש באופן בלעדי, למרות שהטכניקות המתוארות ניתן להחיל organoids מעי הגס גם כן.
פרוטוקול הווידאו הנוכחי מתאר התמרה lentiviral של organoids מאפיתל במעי ראשוני וניתוח במורד הזרם של organoids אלה תוך שימוש בטכניקות RNA כמותי ואימונוהיסטוכימיה.
התמרה lentiviral מבוצעת לעתים קרובות בתאים חסיד או צפים בצלחות תרבות. מכיוון שהמבנה הת?…
The authors have nothing to disclose.
J. Heijmans is supported by a stipendium from the Dutch cancer foundation (KFW). G.R. van den Brink is supported by funding from the European Research Council under the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013)/European Research Council grant agreement number 241344 and by a VIDI grant from the Netherlands Organization for Scientific Research (GvdB).
Reagent | Company | Cat. No. |
Polyethylene imine | polysciences | 23966-2 |
DMEM medium | Lonza | BE12-614F |
Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 |
Glutamin | Invitrogen | 25030-024 |
matrigel | BD | BD 356231 |
Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 |
N2 | Invitrogen | 17502-048 |
B27 | Invitrogen | 17504-044 |
N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G |
mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-056 |
glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 |
Chir 99021 | axon | 1386 |
Y27632 | Sigma | Y0503-5MG |
polybrene | Sigma | 107689 |
nicotinamide | Sigma | N0636 |
Trypsin | Lonza | BE02-007E |
puromycin | sigma | P 7255 |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 |
b-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 |
Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 |
paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L |
glass vial conical 12mm x 75mm 5ml | VWR | LSUKM12 |
Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |