Introduction
bağırsak epitel kanser ve kök hücreleri üzerinde araştırma geniş ilgi çekmek için neden olmuştur en hızlı çoğalan vücut dokuları biridir. 2009 yılında bir teknik 3 boyutlu bir yapı 1 korunması, matrigel küçük bağırsak kript uzun ömürlü kültürlerini oluşturmak için yayınlandı. Bu yapılar, bağırsak organoids orta BMP-sinyal yolu önleyicisi Noggin (Nog) de dahil olmak üzere tanımlanmış bir büyüme faktörü, bir dizi ile takviye çevreleyen, standart teknikler kullanılarak kültür edilebilir olarak adlandırılan 1 (Rspo1) rspondin Wnt-sinyal yolu güçlendirici ve epidermal büyüme faktörü (EGF) tüm bağırsak proliferasyonunu 2-4 arttırdığı bulunmuştur.
Organoids, kök hücre hiyerarşi korumuştur, bunlar olmayan mutasyona olduğunu yönleriyle geleneksel kanser hücre hatları aşmak doğmakta olan küçük int bulunan tüm hücre soylarının içine sağlam hücresel kutuplaşma ve sergi farklılaşmasını görüntülerestinal epitel. Bunlar transgenlerin taşımak için aktarılacak olan veya RNA interferans 5 oluşturur olduğundan, eksiksiz ve hız yönü de, transjenik fareler kullanılarak deneyler outweighing, spesifik genetik elemanları incelemek için kullanılır. Organoids transjenik ifadesi sıçangil retroviral veya lentiviral vektörler 6,7 kullanarak gerçekleştirilebilir. Nedeniyle mitotik hücre özel olarak 8 transduse edebildiği sıçangil retrovirüslerin sınırlamaları, lentiviral transdüksiyon daha sık örneğin organoids olarak enfekte zor olan hücreler için kullanılır.
Viral transdüksiyonlu ve stabil bir şekilde eksprese eden transgenik organoids analiz eder ve immünohistokimya kantitatif RNA dahil olmak üzere, akış aşağı analizler çok sayıda için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, primer intestinal epitel hücrelerinden organoids kültürü özel laboratuvar şartlarına olmadan uygulanması kolay bir rutin tekniği haline gelmiştir, ve ce roman standart haline gelmiştirbağırsak epiteli üzerinde araştırma ll kültürü.
Viral iletimi ve organoids sonraki mansap analiz teknikleri gerçekleştirmek ve kültürlü organoids lentiviral transdüksiyon için yöntemler göstererek, bu video protokolü oluşturulan organoid deneyler yardım için sıkıcı bulunmaktadır. Biz ayrıca verimi artırmak ve dolayısıyla RNA teknikleri veya immunhistokimya kullanan alt analiz performansını artırabilirsiniz ne kadar doğru işlem organoids arasında gösteriyor. Tarif edilen teknikler de kolon organoids tatbik edilebilir, ancak protokol, ince bağırsak kript türetilen organoids sadece kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Transfeksiyon Reaktif olarak polietilenimin (PEI) hazırlanması 1.
- H2O, 100 ml PEI'nın yaklaşık 150 mg çözülür
- Solüsyon berrak hale gelir ve tam olarak çözülene kadar karıştırın kadar HCI eklenerek pH 7.4 çözeltisi ayarlayın. Bu durum, 10 ila 60 dakika sürer ve 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar su ilave edilebilir.
- Ne zaman açık, 5 ml hacimde ° C derin dondurucuda bir -80 steril 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden PEI çözüm filtre.
Lentiviral Parçacıkların 2. Üretim
1. Gün:
- 162 cm2 şişeye ya da hücre hattı kültürü ortamında büyük bir petri (% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM glutamin takviyesi ile desteklenmiş DMEM) içinde% 60 -80% konfluansa Split HEK293T hücreleri.
Gün 2:
- Birlikte ekleyerek toplam plazmid DNA 45 ug içeren DNA transfeksiyon çözüm hazırlayınLentiviral ambalaj vektörleri (7 pVSVg ug, pRSV rev 5 ug; 13 pMDL ug) ilgi faiz veya shRNA genini kodlayan lentiviral plazmid ve 20 ug. DMEM ile 1 ml 'lik bir hacme kadar ayarlayın.
- DMEM 930 ul 1 mg / ml bir PEI 90 ul ekleyerek PEI transfeksiyon çözelti hazırlanır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- PEI solüsyonuna DNA transfeksiyon solüsyonu ekleyin. Vorteks birkaç kez ters çevirin ve DNA transfeksiyon çözelti elde etmek için, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe veya.
- HEK293T hücrelerine, DNA transfeksiyon solüsyonu 2 ml damla ve 37 ° C nemlendirilmiş bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 4 saat boyunca inkübe edilir.
- 4 saat sonra, PEI çıkarmak için kültür ortamı yenileyin. Bu yeni orta eklemeden önce Hücreleri yıkamak için gerekli değildir.
NOT: 4 saat daha uzun PEI olan sitotoksik ve inkübasyon süreleri HEK293T hücrelere zarar verebilir.
4. Gün:
- Supe değiştirinyeni kültür ortamı ile rnatant. Süpernatant (virüs içeren) tutun; Bu aşamada 2.10 kullanılacaktır.
- 15 ml'lik bir şişe içinde süpernatant koyun. 500 x g'de 5 dakika boyunca ölü hücreleri, santrifüj kaldırın.
- Büyük bir 60 ml şırınga kullanılarak 0.45 um filtre içinden yüzer itin. 4 ° C 'de bir gece boyunca muhafaza ediniz.
5. Gün:
- Süpernatant ikinci parti toplayın; adımlarda 2.8-2.9 gibi santrifüj ve filtre.
- 90 dakika boyunca bir ultrasantrifüjdeki 50.000 x g'de adımlar 2.9 ve ultrasantrifüjdeki tüpleri 2.10 ve santrifüj süpernatantlar Havuz.
- Çok dikkatli ultrasantrifüjdeki tüpleri içeren kapsüller çıkarın ve santrifüj içinde tüp yönünü hatırlayarak, bir laminer akış kaputu koymak.
- Topak, tüp üst tarafında olmasını sağlayacak bir şekilde, dikkatli bir ultra santrifüj tüpüne ve dökme sıvı ortam tutan açık kapsül. Viral pelet görselleştirmek için zor olabilir çünkü, üzerinde ne hatırlıyorumtüpün yan bir pelet oluşmuş olacaktır. Bir mikropipet alın ve ultrasantrifüjdeki tüpün alt tarafında görünür opak kahverengi pelet kışkırtmak dikkat çekerken orta son bit çıkarın.
- 10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 ve 8 ug / ml polibren ile takviye organoid kültür ortamında 500 ul bu pelletini. Yüksek titre virüs doğrudan organoids Transduct için kullanılan bu yana bu ortamda tabanda önemlidir.
- İsteğe bağlı olarak: -80 ° C'de 250 ul'lik iki seri olarak alınmıştır, bu ortamda virüs dondurma.
Organoids 3. lentiviral İletimi
Gün 0:
- Yaklaşık 50 küçük organoids elde etmek amacıyla, yeni bir kuyunun içine transdüksiyon için iki gün önce organoids tam 0.95 cm 2 kuyu bölün. Daha önce yayınlanan bir protokolün 1 (Şekil 3A, B) işlemine göre organoids Böl.
- Kistik aşırı çoğalma crypts (Şekil 3C) elde etmek için 10 uM Chir99021 ve 10 mM nikotinamid ile kültür ortamı Organoid Supplement.
Not: taze bölme organoids Chir99021 varlığında büyütülür kistik kript iyi gelişir.
Gün 2:
- Böylece P1000 mikropipet ile karışımı bozarak, yukarı pipetleme ve matrigel ve orta aşağı Hasat organoids. 15 ml'lik bir tüp içinde karışımın yerleştirin.
- Distal açıklık eritilerek azalmış olan Pasteur pipeti kullanılarak daha bozabilir. Santrifüj organoids 100 x g'de 5 dakika boyunca pelet için.
NOT: santrifüj büyüklüğüne bağlı olarak, farklı bir santrifüj hızı kullanın. Bu organoids karışımdan ayrılır bozulduğu olan tam hız bulmak için gereklidir. - Süpernatantı ve (% 0.25 tripsin benzeri) önceden ısıtılmış 1x tripsin 500 ul ekleyin. Tripsin içinde organoids yeniden süspanse ve inkübe37 ° C'lik bir su banyosu içerisinde 3 dakika.
- Hücre hattı kültürü ortamı içinde 3.5 ml tripsin inaktive (DMEM,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve glutamin ile takviye edilmiş). 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
- Orta yaklaşık 20 ul pelet bırakmak süpernatantı. Bir 48-kuyu plaka üzerinde kuyuya ortamının bu son küçük miktarda organoids aktarın.
- Adım 2.14, tekrar süspansiyon tarif edilir ve 3.10: adım olarak iletim ortamı içinde yüksek titre lentivirüs ekleyin. Düşük transdüksiyon etkinliğini karşılaşmak, 3.9 eklenebilir adım.
Not: etkin iletimi için, tipik olarak organoids bir oyuğuna yüksek titre lentivirüs 250 ul bir kısım ilave edin. Bu protokolün adım 2'de tarif edildiği gibi, tek bir üretim Hasat lentivirüs% 50'sini oluşturur. - İsteğe bağlı olarak: 32 ile ilgili, bir önceden ısıtılmış bir santrifüj içinde 48 gözenekli plaka ihtiva organoids koyarak spinoculation yerine, transdüksiyon etkinliğinin arttırılması için6, C ve 1 saat süre ile 600 x g'de döndürün.
- Kültürü inkübatöründe organoid-virüs konacak ve transdüksiyonunu izin vermek için bir kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
- İsteğe bağlı olarak: bundan başka, iletim etkinliğini geliştirmek kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de 3 saat daha organoids kuluçkalanması.
- Organoids peletleştirmek için 850 x g'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj içine transfer organoid kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve organoid-virüs karışımı tekrar süspansiyon.
- Süpernatantı ve buz-soğuk matrigel 20 ul pelletini. Daha sıcak olduğunda malzeme katılaşır beri, birkaç kez soğuk PBS yukarı pipetleme ve buz aşağı soğutulmuş olan pipet uçları kullanın.
- 48 kuyu plakasında iyi olarak ortasında damlacık koyun ve katılaşmaya 15 dakika için 37 ° C 'de kültür inkübatörü içinde inkübe edilir.
- 15 dakika sonra, dikkatli bir şekilde ilave edilmiş organoid kültür ortamında 250 ul10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021 ve 10 uM Y27632. Küçük kesintiye organoid parçaları 24 saat içinde küçük kistik organoids içine oluşturacak.
5. Gün:
- Orta yenileme ve bir seçim antibiyotiği ile ek (puromisin için, 4 ug / ml kullanımı).
Gün 7:
- Seçim antibiyotik ile desteklenmiş standart organoid kültür ortamı için orta değiştirin.
Not: geliştirici Chir99021 çekilmesinden sonra 2-3 hafta tamamlanır. Seçimden sonra, organoids seçimi antibiyotiksiz yetiştirilebilir.
Kantitatif RT-PCR veya Mikrodizi 4. organoid RNA Preparasyonu
- RNA preparasyonu için, üreticinin protokolüne göre, ticari bir kit kullanılır. Organoids orta çıkarın ve düz matrigel içeren organoids kubbesi üzerindeki β-mercaptoethanol ile takviye tampon RLT 350 ul ekleyin. Materyali yeniden süspanseP1000 mikropipet kullanarak pipetleme RLT al.
- Üreticinin protokolüne göre başka bir RNA hazırlık yapın.
- İsteğe bağlı olarak: üreticinin protokolüne uygun olarak 50 ug toplam RNA, ilk giriş gerektiren Ovation Pico WTA sistemi kullanılarak amplifikasyon RNA verimi artar.
- İsteğe bağlı olarak: RNA, mikrodizi önce kalite kontrolü için, üreticinin protokolüne uygun olarak 8.5 ya da daha çok (Şekil 5) bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) hedefleyen bir ökaryot toplam RNA, nano çipini kullanan bir 2100 Bioanalyzer çalışacak örnekleri.
Parafin Yerleştirilmiş ve İmmünohistokimya için 5. İşleme Organoids
- Önceki gömme organoid başlamasından parafin sıvı tutmak için 70 ° C 'de delikli inkübatör bağlantı 12 mm çaplı cam tüpler bir alüminyum blok önceden ısıtın.
- Bozulmamış gömülü organoids bırakarak, tam yetiştirilen organoids tek bir kuyu alın ve orta kaldırmak.
- 1 ml ilave edilir% 4 paraformaldehid, PBS içinde düz iyi ve 1 saat her yerde, 4 ° C'de gece boyunca sabitlemek.
- Buz soğukluğunda PBS, 1 ml paraformaldehid yerine.
İsteğe bağlı olarak: bu aşamadan sonra, 4 ° C'de 1 hafta kadar PBS içinde sabit organoids tutun. - 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve sabit organoids bir cam şişe içine koyun.
- , Organoids 1 dakika boyunca dibine çöker olsun PBS süzün ve eozin çözeltisinin damlacıklarının bir çift gömme işlemi boyunca organoids görselleştirme sağlamak için çözülmüş olan% 70 etanol ile değiştirin.
- Oda sıcaklığında% 70 etanol içinde organoids bırakın. 30 dakika sonra, dikkatli bir şekilde, çünkü hafif pembe eozin renk gözle organoids görselleştirmek için güçlü olmak, boşaltılarak% 70 etanol çıkarın. % 96 etanol ile gömme çözüm değiştirin.
- Adımı yineleyin 5.7, yanında bir gömme çözüm yerini her zaman. % 70 etanol,% 90 etanol,% 96 etanol,% 100 etano: daha sonra, aşağıdaki çözeltiler ile organoids geçirinmetanol,% 100 etanol, ksilen, ksilen.
- Son ksilen yıkama Durusu ve tüpe parafin dökün. 30 dakika boyunca 70 ° C'de önceden ısıtılmış alüminyum bloğunun Tüp hemen koyun ve yeni, temiz parafin ile parafin değiştirin.
- Geniş açıklığı bulunan bir önceden ısıtılmış Pasteur pipet kullanarak parafin blok kalıp içine kapalı parafin ve pipet organoids dökün. Bunsen beki kullanarak Pasteur pipet sıcak tutun. Sıvı parafin, küçük bir tabaka halinde parafin blok kalıp tüm organoids yerleştirin.
- Mümkün olduğunca, bir ısıtılmış diseksiyon iğne kullanılarak parafin blok kalıp merkezine doğru tüm organoids işlemek için deneyin. Bunsen beki kullanarak diseksiyon iğne sıcak tutun.
- Kalıptaki organoids lokalizasyonu tatmin edici olduğunda, soğuk kalıp biraz parafin tabakası katılaşmaya.
- Üst daha fazla parafin dökülerek blok bitirin ve bir standart histolojik gömme kaseti ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoid lentiviral transdüksiyon
Lentiviral parçacıklar kullanılarak organoid iletimi tekniği öncesi ve transdüksiyon sırasında organoids doğru kullanımı bağlıdır. Organoids (Şekil 3A) kültürlenmiştir ve bir kript (Şekil 3B) içine dağıtıldı. Daha önce belirtildiği gibi, GSK3 inhibitörü Chir99021 mevcudiyetinde kültürlenmiş, bu tek kript kistik crypts 9 (Şekil 3C) olmuştur. Daha sonra organoids tek hücrelere virüs parçacıklarının içeri geçmesine imkan vermek için tripsinize edilmiştir. Lentiviral parçacıklarla hücrelerini transduse zaman, bir dizi yöntem, böyle bir spinoculation ya da uzun süreli kuluçkadan olarak iletim etkinliğini geliştirmek için denenebilir. Yüksek titre PGK-EGFP lentivirüs floresan mikroskopisi ile transdüksiyon etkinliğinin görselleştirme etkinleştirmek için kullanılır. Bu plasmid ile organoids transdüksiyonu etkinliği yüksek ve% 100 yaklaştığı (Figüre 4E, F). Lentiviral parçacıklar (Şekil 4C, D) ile etkinliği kullanılarak spinoculation (Şekil 4A, B) veya uzun süreli inkübasyon artırma nedenle ek değer vermemiştir.
RNA ekstraksiyonu,
RNA ekstraksiyonu için bir sonraki organoids büyütülmüştür. Tam yetiştirilen organoids azaltılmış RNA bütünlüğünü (Şekil 5) göstermek için gama ışıması veya kontrol işlemine tabi ki hasat edildi. Gy RNA bozulmuş ve işlenmiş organoids kontrol ile karşılaştırıldığında 6 ile ışımaya tutma üzerine, RNA bütünlüğü numarası (RIN) azalır.
Parafin organoids immünhisto-
BrdU ile takviyeli kültür ortamında 2 saat organoids inkübe edildikten sonra, formalin içinde organoids sabitlendi ve immünohistokimya (Şekil 6) için işlendi. Fare anti BrdU kullanarak proliferatif hücre kript-segm müşahade edilmemiştirorganoids arasında olup farklı bölmesine hastalar.
Şekil 1:. Organoid iletimi için lentivirüs üretim şematik bu şemadan, protokol kısmında 2 yazıldığı gibi, virüs üretiminin en kritik adımlar protokol adımı numaraları ve zamanlama ile temsil edilmektedir.
Şekil 2:. Organoids lentiviral transdüksiyon şematik bu şemadan, protokol kısmında 3 yazıldığı gibi, organoid iletimi en kritik adımlar protokol adımı numaraları ve zamanlama ile temsil edilmektedir.
Şekil 3: Organoids önce ve tran sırasındasduction. Normal olarak büyüyen organoids (A), bir gün sayısı (C) Chir99021 inkübasyonu sonrası kistik hale yoğun büyüyen küçük organoids (B) ayrılır. Tripsin kullanarak bu organoids ayrışması üzerine, tek hücre ve hücrelerin küçük kümeleri daha sonra transdük edilmiştir (D) kalır. Ölçek çubuğu 100 um.
. Şekil 4: lentiviral sentezleme vektörleri kullanılarak organoids transdüksiyonu aydınlık görüntü (A, C, E, G) ve floresan görüntü (B, D, E, lH) PGK-EGFP lentivirüs ile transfekte edildi organoids (A - E) ya da (G lentivirüs kontrol
Şekil 5:. Bioanalyzer üzerine organoids RNA preps Temsilcisi sonucu şerit 2-4 yüksek RNA bütünlüğünü temsil eden bantların güçlü çizme Not ve günlük RNA bütünlüğünü temsil eden şeritleri 5-7 bantları etrafında smear. Bantların 2-4 RNA bütünlüğü numarası (RIN) t ise, sırasıyla 8.7, 9.2 ve 9bantların 5-7 o RIN 6.4, 6.6 ve 5.5.
Şekil 6:. Formalinde tespit edilmiş parafine gömülmüş organoids immünohistokimyasal analizi formalinde tespit edilmiş parafine iki saat boyunca BrdU mevcudiyetinde kültürlenmiş organoids 4 um bölümü gömülü ve daha sonra sabit. Bölüm, anti-BrdU antikoru ile boyandı. Ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Temel ortam | İlaveler | |
| Hücre hattı kültür ortamı | DMEM | % 10 FCS |
| % 1 penisilin / streptomisin | ||
| 2 mM Glutamine | ||
| Organoid kültür ortamı, | Gelişmiş DMEM F12 | HEPES |
| % 1 penisilin / streptomisin | ||
| 1x glutamax | ||
| 1% N2 takviyesi | ||
| % 2 B27 takviyesi | ||
| 125 nm N-asetil sistein | ||
| fare EGF (50 ng / ml) | ||
| (100 ng / ml eşdeğer)% 10 Nog-Fc uygun hale getirilmiş ortam | ||
| (500 ng / ml eşdeğer)% 10 Rspo1-Fc uygun hale getirilmiş ortam |
Tablo 1: kültür ortamı bileşim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut video protokolü primer bağırsak epiteli ve kantitatif RNA teknikleri ve immünohistokimya kullanılarak, bu organoids aşağı doğru analizden organoids lentiviral iletimini tarif etmektedir.
Lentiviral transdüksiyon genellikle kültür plakaları içinde yapışık veya yüzen hücrelerin içinde gerçekleştirilir. Organoids bölgesinin üç boyutlu yapısı, viral parçacıklar tarafından nüfuz onları zor hale yana etkinliğini artırmak için bir dizi yöntem kullanılır. Chir99021 kullanılarak organoids ön işlemden geçirilmesinin, transdüksiyon sonra yayılması ve bu şekilde yaşam sürelerini uzatır. Bu tek hücre sağkalım azalmış beri, trypsinization sonra küçük hücre kümeleri korumak için önemlidir. Murin retrovirüs kullanılarak viral transdüksiyon aksine, lentiviral iletiminin daha etkili ve ortalama spinoculation, ES hücreleri 10 artışlar transdüksiyon etkinliği bilinen bir teknik gerektirmez. Sıçangil retrovirüsleri veya mile kullanırkenLentiviral transdüksiyon verimleri düşüktür etkinlik, en-spinoculation isteğe bağlı olarak iletim hızını arttırmak için kullanılabilir. Düzenli kullanılan maksimum iki 0,95 cm2 oyuklardan alınan organoids transdüksiyonu için bir üretim tek bir turda mevcut tüm virüs, çünkü virüs titresi değerlendirmez. Buna ek olarak, genel olarak deforme olmayan kalıt aktarımlı hücrelerin çıkarılması için antibiyotik seçimi kullanılır. Transdüksiyon etkinliği ile ilgili sorunlar karşılaşmak virüs konsantrasyonunun değerlendirilmesi, ancak yararlı olabilir.
Özdeş yapışık hücrelere, seçim antibiyotik düzeyi viral entegrasyonların sayısını ve transgen böylece ifadesini artırabilir. Yüksek transgenik ekspresyonu ve etkili demonte elde etmek için yüksek seviyeli puromisin (10 ug / ml) kullanarak, ancak toksisite organoids işaretleri gösterdikleri daha düşük seviyeleri (minimal 1 ug / ml) ile birlikte kullanılabilir zaman. Transdüksiyon olasıdır, ancak ek olarak, alternatif bir seçim antibiyotikler kullanılabilir veya seçimi iptal edilebilireksik ve bu uzun vadeli istikrarlı ifadesinde neden olabilir. Genomuna lentiviral entegrasyon hücre popülasyonu içinde heterojen bir Bundan başka, transgenin ifadesi uzun bir süre boyunca hücrelerin kültürlenmesi sonrasında değişikliklere bastırmak olabilir. Bu transgenin ekspresyonu ile selektif basınç kaynaklanabilir. Antibiyotik seçimi, bu değişiklikleri sınırlar birlikte, daha çok transgenlerin bünyesel anlatımı durumunda kalabilir. Bu dezavantaj organoids tek hücre klonlaması ile aşılabilir, ancak bu teknik, zaman alıcıdır. Lentiviral transdüksiyon transgenlerin sabit veya uyanlabilir ifadesi ya da neden plazmid geniş bir çeşitliliği ile gerçekleştirilebilir. Bu transgenler genellikle CMV ya da PGK promoter olarak her yerde bulunan bir promotörler, ekspresyonu ve olağanüstü ifade neden olabilir. Kanser hücre hatları veya model hayvanlarda transgenik aşırı ekspresyonu benzer, dikkatli sağa sola sonuçları yorumlama garantilidirm aşırı ifadesi.
RNA gerektiren deneyler için, canlı hücrelerin sayısının düşük normalde kolayca büyük şişelerde yetiştirilen olabilir yapışık hücrelere aksine bir tek 0.95 cm 2 de (iyi 48 standart yüzey alanı) yetiştirilen kalitesi için hız sınırlayıcı faktördür ve alt analiz çokluk. Bulunamayan normal olarak, daha fazla büyütme olmadan 0.4 ug, 1 ug toplam RNA, nicel RT-PCR için yeterli olan ve RNA mikrodizi arasında yaklaşık 50 tam yetiştirilen organoids verimi tek bir sıra. Bazı tedavi rejimleri veya genetik değişiklikler anlamlı ancak RNA içeriğini azaltabilir. Bir ilk adım, toplam RNA birden kuyu havuzu olduğunu artırmak için.
Organoids ve parafine için, bu işlem sırasında organoids görselleştirmek için yeterli malzeme elde etmek için kritiktir. Sabit organoids için eozin dakika miktarda eklenmesi tamamı boyunca organoids görselleştirme sağlarişlem olup, ancak normal yerleştirilmesi için gerekli değildir ve bu aşama, daha fazla analiz kesintiye uğrattığı zaman göz ardı edilebilir. Genel olarak, parafın gömme kasetleri bunların delikleri kasetine dokuya sabitleyici ve işlem çözeltilerinin akışına izin vermek gerekir.
Alt baş standart teknikler için lentiviral organoid iletimi ve hazırlanması, bu kültürlerin bilimsel potansiyelini artırır ve primer intestinal epitelden üç boyutlu tekniklere hücre kültürü içinde standart yükseltir. alt baş deneylerin aralığı yeterlidir kültürü tarafından üretilen hücresel malzeme miktarı göz önüne alındığında, ancak mevcut protokolde tarif edilen teknikler ile sınırlı değildir ifa edilecek olan ve hücre çizgileri veya fareler üzerinde yapılan tüm teknikleri kapsayabilir. Belirli genetik elementlerin ve bağırsak epiteli onların işlevi, modeli hayvanlarda homolog rekombinasyon teknikleri, en önemlisi fareler üzerinde araştırma, altın standart olmaya devam etmektedir. Organoids kültürleri yapmakmezenkimal veya immünolojik niş hücreleri ve kültürlü kriptler içermemesi hiç in vivo bulundu durumun tezat, arttırıyoruz. Bununla birlikte, bu kültürlerin büyük ölçüde in vitro bulguların kalitesini yükseltti ve dikkate, organoid kültürü vardır yapılabilir ve büyük bağırsak epiteli üzerinde araştırma artıracaktır sayısız mansap alma teknikleri var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene imine | Polysciences | 23966-2 | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| Fetal calf serum | Lonza | DE14-801F | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Glutamin | Invitrogen | 25030-024 | |
| matrigel | BD | BD 356231 | |
| Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
| N2 | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A9165-1G | |
| mouse Egf | Invitrogen | PMG8045 | |
| Hepes 1 M | Invitrogen | 15630-056 | |
| glutamax 100x | Invitrogen | 35050-038 | |
| Chir 99021 | Axon | 1386 | |
| Y27632 | Sigma | Y0503-5MG | |
| polybrene | Sigma | 107689 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Trypsin | Lonza | BE02-007E | |
| puromycin | Sigma | P 7255 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| β-mercaptoethanol | Merck | 8,057,400,250 | |
| Ovation Pico WTA system | NuGen | 3300-12 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 252549-1L | |
| glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml | VWR | LSUKM12 | |
| Eosin Yellowish | VWR | 1,159,350,025 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
- Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871 (2013).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
- Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
- Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).
