En protokoll for Lentiviral Transduksjon og Nedstrøms Analyse av Intestinal Organoids

Summary

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Abstract

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introduction

Tarmepitelet er en av de mest raskt prolifererende kroppsvev, noe som har forårsaket den til å tiltrekke bred interesse fra forskning på kreft og stamceller. I 2009 en teknikk ble publisert for å generere langvarige kulturer av tynntarms krypter i matrigel, bevare en 3-dimensjonal struktur ^1. Disse konstruksjoner, betegnet tarm organoids, kan dyrkes ved hjelp av standardteknikker, med omgivende medium supplert med et antall definerte vekstfaktorer, inkludert BMP-signalveien inhibitor noggin (Nog), Wnt-signalveien enhancer rspondin 1 (Rspo1) og epidermal vekstfaktor (EGF) alle funnet å forsterke tarm proliferasjon ^2-4.

Organoids overgå tradisjonelle kreftcellelinjer i de aspektene som de er ikke-mutert, har opprettholdt stamcelle hierarki, viser intakt celle polarisering og utstillings differensiering i alle celle linjene som finnes i den begynnende lite intestinal epitel. Siden de kan bli omformet til å gjennomføre transgener eller RNA interferens konstruerer ^5, blir de brukt til å studere spesifikke genetiske elementer, oppveier eksperimenter ved hjelp av transgene mus i fasetter av pris og hastighet. Transgene expression in organoids kan utføres ved hjelp av enten murint retrovirale eller lentivirale vektorer ^6,7. På grunn av begrensninger i murine retrovirus, i stand til transducing mitotiske celler utelukkende ^8, er lentiviral transduksjon oftere brukt for celler som er vanskelige å infisere, for eksempel organoids.

Viralt transdusert og stabilt uttrykker transgene organoids kan brukes til en rekke nedstrøms analyser, inkludert kvantitative RNA analyser og immunhistokjemi. Til sammen har kultur av organoids fra primær intestinale epitelceller utviklet seg til en rutinemessig metode som er lett å implementere uten spesielle laboratoriekrav, og er blitt den nye standard på cell kultur i forskning på tarm epitel.

Teknikker for viral transduksjon og påfølgende nedstrøms analyse i organoids er kjedelig å utføre og å hjelpe organoid eksperimenter vi genererte denne videoen protokollen, som viser metoder for lentiviral transduksjon av dyrkede organoids. Vi viser i tillegg hvor riktig behandling av organoids kan øke utbyttet og dermed forbedre ytelsen til nedstrøms analyse ved hjelp av RNA-teknikker eller immunhistokjemi. I protokollen, ble organoids som er avledet fra tynntarms krypter utelukkende brukt, selv om de teknikker som er beskrevet kan anvendes på colonic organoids også.

Protocol

1. Utarbeidelse av polyetylenimin (PEI) som Transfeksjon Reagens Oppløs ca. 150 mg av PEI i 100 ml H 2 O. Juster løsningen til pH 7,4 ved å tilsette HCl inntil løsningen blir klar, og omrør inntil det er fullstendig oppløst. Dette kan ta fra 10 til 60 min og tilsett vann til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml. Når klar, filtrere PEI løsning gjennom sterilt 0,22 mikrometer filter og oppbevar i en -80 ° C fryser i porsjoner av 5 ml. 2. Pr…

Representative Results

Organoid lentiviral transduksjon Teknikken med organoid transduksjon hjelp lentiviral partikler avhenger korrekt håndtering av organoids før og under transduksjon. Organoids (figur 3A) ble dyrket, og de ​​ble forstyrret til enkle krypter (Figur 3B). Som tidligere rapportert, disse enkelt krypter, når de ble dyrket i nærvær av GSK3p-inhibitor Chir99021 ble cystiske krypter 9 (figur 3C). Deretter organoids ble tryp…

Discussion

Den nåværende video protokollen beskriver lentiviral transduksjon av organoids fra primær intestinal epitel og nedstrøms analyse av disse organoids benyttet kvantitative RNA teknikker og immunhistokjemi.

Lentiviral transduksjon er ofte utført i tilhenger eller flytende celler i kultur plater. Siden den tredimensjonale strukturen av organoids gjør dem vanskelig å trenge gjennom av virale partikler, anvendes en rekke metoder for å øke effekten. Forbehandling av organoids bruker Chir99…

Materials

Reagent	Company	Cat. No.
Polyethylene imine	polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
b-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12mm x 75mm 5ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025