Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dorsalrodsganglier neuroner og differentierede adipøst afledte stamceller: An Published: February 26, 2015 doi: 10.3791/52543
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Centre for Neuroprosthesis, EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair, The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

Summary

Dorsal root ganglier (DRG) er strukturer, der indeholder de sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. Når dissocieret, kan de være co-dyrket med SC-lignende adipøst afledte stamceller (ASC), giver en værdifuld model til at studere in vitro nerve regenerering og myelinering, efterligne in vivo miljøet på læsionsstedet.

Introduction

Perifere nerveskader er fælles med ca. 9.000 sager i Storbritannien forekommer hvert år i en overvejende ung og erhvervsaktive befolkning 1. Trods microsurgical nerve reparation teknikker, normal genoprettelse af funktionen er uopnåelig med deraf forringet hånd sensation, nedsat motorik og hyppige smerter og kulde intolerance 2. Sådanne skader har en dyb og varig indflydelse på patienten og deres evne til at udføre dagligdags aktiviteter, med mindre end 60% vender tilbage til arbejdsmarkedet 3.

Efter skade, fænotype og morfologi af neuroner og Schwann-celler (SC) ændring for at skabe et passende miljø for at tillade Axon spiring. Ved overskæring er nerven opdelt i proksimale og distale stumper; den proksimale stump er det punkt, hvorfra den regenerative proces finder sted, mens den distale stump gennemgår Wallerian degeneration hvorefter SC detachfra de sårede axoner, de-differentiere og formere sig. Dette er afgørende i retning af at fjerne myelin debris og forberede den distale stump for nerve re-generation 4,5. Axon spiring understøttes af produktionen af neurotrofiske faktorer og kemokiner frigivet af SC i den distale stump, og styret af den basale lamina efterladt efter Wallerian degeneration 6,7. SC tilpasse siden af ​​regenererende axon danner bånd Büngner, hvilken støtte Axon vækst mod målorgan, reducerer forgrening uden for endoneurale rør. Efter reinnervation, SC danne nye myelinskeden indpakning de regenererede axoner, men sensorisk og motorisk funktion kun delvis genoprettet 8.

Dorsal root ganglier (DRG) er strukturer placeret i det intervertebrale huller af rygsøjlen, der indeholder de sensoriske nerveceller innerverer de perifere organer. Når dissocieret, kan de anvendes som en egnet in vitro model for studiet af nerveregenerering 9-11, herunder undersøgelser af myelin formation. Navnlig voksen DRG-neuroner efterligne in vivo egenskaber af disse celler og giver en formidabel værktøj til at studere nye strategier for perifer nerve reparation vævsmanipulation.

Co-kulturer repræsenterer et dynamisk system, der simulerer in vitro samspillet mellem to (eller flere) celletyper i et bestemt in vivo miljø. En af fordelene ved disse celle co-kultur modeller er den fleksibilitet og høj kontrol, der kan udøves på det ekstracellulære miljø. DRG-neuroner er blevet brugt hyppigt i samarbejde dyrkningssystemer med SC at efterligne de faktiske samspil, der opstår mellem de to celletyper i det perifere nervesystem 10,12 - 14. Det blev påvist, at SC udskiller ekstracellulær matrix (ECM) proteiner og vækstfaktorer, som kan bemærkelsesværdigt forbedreevne DRG-neuroner at overleve og spire neuritter 15,16. Men SC kræver langvarige tidsrum for at proliferere og til trods for de fremskridt i cellekultur teknik, er det stadig svært at generere et passende antal celler til vævsdyrkningsapplikationer. Desuden er offer for en sund nerve nødvendiggjort at høste autolog SC. Derfor er forskellen i sourcing SC er vigtig for både vævsmanipulering og in vitro test af nerveregenerering. I denne visning kan ASC betragtes et værdifuldt alternativ til udvikling af et væv-manipuleret konstruktion skal anvendes til perifere nerve reparation 17,18. Tidligere arbejde demonstreret evnen af disse celler til at differentiere til SC-lignende ASC, udtrykker karakteristiske glia-markører, såsom S-100, p75 og glial fibrillært surt protein (GFAP) 19, samt myelinprotein nul (P0) 20 . Udskillelsen af ​​gliale vækstfaktorer, såsom hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF) blev nervevækstfaktor (NGF) og glial celle-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) også observeret 21,22. Derfor kan SC-lignende ASC anvendes som promotor for perifer nerveregenerering, som demonstreret ved både in vitro og in vivo studier 23-26. Desuden kan ASC høstes ved hjælp af minimalt invasive procedurer i større antal i forhold til andre stamceller celletyper; hyppigheden af stamceller i fedtvæv er 100 til 1000 gange højere end i knoglemarv 27, og de ​​har en højere proliferationshastighed sammenlignet med SC og knoglemarv mesenkymale stamceller.

Dette arbejde har til formål at give en detaljeret protokol til at udføre højeffektive høsten af ​​dissocierede DRG neuroner og ASC henholdsvis sidstnævnte differentieret i SC-lignende celler. Den co-kultur af disse to celletyper vil derfor give en meget praktisk system, der kan blive anvendt til fremtidige undersøgelser på evnen af ​​DRG neurons at spire neuritter og mekanismerne i myelin formation på forskellige stillads for nerve tissue engineering.

Protocol

Bemærk: Alle forsøg med dyr blev udført i overensstemmelse med de britiske Dyr (Videnskabelige procedurer) Act, 1986.

1. forsøgsopstilling

  1. Før starte væv og celler høst, kontrollere, at alle redskaber er sterile. Uanset om det er nødvendigt, autoklavere et par skarpe kirurgiske sakse, en meget fin pincet og en fin standard pincet. Også sterilisere hvert substrat før cellepodning anvendelse af UV sterilisering, ethanol eksponering eller dampsterilisering som passende.
  2. Udarbejdelse af medier til stamcelle høst og differentiering
    1. Forbered stamceller vækstmedium indeholdende Minimum Essential Medium (α-MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 200 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin (PS).
    2. Forbered en 10 mM stamopløsning af forskolin ved at opløse 10 mg forskolin i 2,436 ml sterilt dimethyl sulfoxyde. Brug ved slutkoncentration på 14 uM. </ Li>
    3. Forbered en 35 mg / ml stamopløsning af retinsyre ved at opløse 50 mg i 1,43 ml sterilt dimethyl sulfoxyde. Brug i en slutkoncentration på 350 ng / ml.
    4. Forbered blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) lagre (100 ug / ml) ved at opløse 10 ug lyofiliseret pulver i 100 pi destilleret sterilt vand. Brug ved endelig koncentration på 5 ng / ml.
    5. Forbered basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) lagre (100 ug / ml) ved at opløse 50 ug lyofiliseret pulver i 500 pi destilleret sterilt vand. Brug ved endelig koncentration på 10 ng / ml.
    6. Forbered stamcelle-differentiation medium indeholdende vækst stamcelle medium suppleret med 14 pM forskolin, 126 ng / ml glial vækstfaktor-2 (GGF-2), 5 ng / ml blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) og 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF).
  3. Udarbejdelse af medier og stamopløsninger til neuron høst og dissociation
    1. Forbered BottenstEin og Sato s (BS) medium 28, ved at tilsætte 1% PS og 1% N2 supplement til Hams F12 medium. Beregn den endelige brug som 500 pi per brønd volumen (hvis anvendelse af en 24-brønds plade).
    2. Forbered collagenase IV lagre i Hams F12-medium i en koncentration på 1,25% vægt / vol. Filter-sterilisere opløsningen og opbevares ved -20 ° C som 200 pi alikvoter.
    3. Forbered bovine pankreatiske trypsin lagre i Hams F12-medium i en koncentration på 2,5% vægt / volumen, filter-sterilisere og opbevares ved -20 ° C til 200 pi alikvoter.
    4. Forbered nervevækstfaktor (NGF) stamopløsning i en koncentration på 5 ug / ml i en filtersteriliseret 1 mg / ml fedtsyre-fri bovint serumalbumin (BSA) opløsning i F12-medium og opbevares ved -20 ° C til 200 pi alikvoter. Du må ikke filtrere NGF efter rekonstitution.
  4. Hvis der ikke overflademodifikation er blevet udført, coat dækglas / plader med poly-D-lysin (0,1 mg / ml i 15 minutter ved stuetemperatur) Og / eller laminin (2-10 ug / cm2 i 2 timer ved 37 ° C) til støtte neuron vedhæftning og neuritudvækst relevant.
  5. Altid varme op medier i et vandbad ved 37 ° C før brug.

2. adipøst afledte stamceller (ASC) Harvest og differentiering til en SC Fænotype

  1. ASC høst fra visceral og lyske fedt voksne Sprague-Dawley rotter
    1. Før at starte, forberede et rør med 10-15 ml Hanks Balanced saltvandsopløsning (HBSS) suppleret med 1% v / v PS løsning og butik på is indtil fedt høst.
    2. Afslut rotte ved cervikal dislokation og halshugning. Barber rotter og lave et snit gennem den abdominale hud, udsætter de indre organer og undgå blødning. Fjern visceralt fedt omslutter mave og tarme (sædvanligvis karakteriseret ved en fed gul konsistens) og inguinal fedt omgiver testiklerne fra en voksen Sprague-Dawley rotte. Overfør the fedt i rør indeholdende HBSS på is.
    3. I et biologisk sikkerhedsskab (klasse II) Hak fedt ved hjælp af en saks og en steril barberblad indtil fine konsistens er nået, og overføre det til et rør indeholdende 15 ml 0,2% vægt / volumen collagenase type I løsning frisklavet og filtersteriliseret på dagen.
    4. Overfør røret i et vandbad ved 37 ° C og forlade fedtvævet at fordøje i tilstedeværelse af enzymet i 30 minutter-1 time under kontinuerlig omrøring. Overvåg fordøjelsen nøje og stoppe, før vævet er helt adskilt, vil det forbedre cellernes levedygtighed og celle udbytte. Filter Theun-dissocieret væv gennem en 100 um cellefilter.
      BEMÆRK: God vævsfordøjelse vil resultere i homogen konsistens af fedtstoffet, synlig med det blotte øje, når forsigtigt hvirvlende røret, erhvervelse af et beige udseende.
    5. Neutraliseres enzymet ved tilsætning af 15 ml af stamceller vækstmedium indeholdende føtalt bovint serum ved 37 ° C og centrifugeropløsning ved 160 g i 10 minutter for at indsamle det stromale vaskulær fraktion, herunder stamceller ved bunden af ​​røret.
    6. På dette stadium kan pelleten resuspenderes i 1 ml af røde blodlegemer lysis buffer for at fjerne forurening blodlegemer. Efter resuspension og pipettering i 1 min tilsættes 10 ml frisk vækst stamcelle medium og centrifugeres ved 160 g i 10 min.
    7. Aspireres forsigtigt supernatanten fra røret, der tager sig af den deponerede cellepellet nederst. Resuspender cellerne i 10 ml stamceller vækstmedium, overføre dem til en 75 cm2 kolber og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2. Opretholde cellerne ved sub-sammenflydende niveauer indtil passage 1-2, skiftende medium hver 3. dag.
  2. ASC differentiering til en SC fænotype
    1. Ved passage 1-2 fjerne væksten stamcelle medium fra 75 cm2 kolbe og erstatte det med 10 ml frisk medium indeholdende 1 mM β-mercaptoethanol frisk preparød og filtersteriliseret på dagen. Inkuberes cellerne ved 37 ° C, 5% CO 2 til 24 timer. På dette tidspunkt er det vigtigt, at cellerne podet ved lav densitet (30%) før start af differentiering.
    2. Vask cellerne forsigtigt med HBSS, aspireres og erstatte den med 10 ml medium indeholdende 350 ng / ml retinsyre. Inkuberes cellerne ved 37 ° C, 5% CO 2 i 72 timer. Prøv at minimere eksponering af cellemedium for lys.
    3. Efter 3 dage vaske cellerne forsigtigt med HBSS, aspireres og erstatte den med 10 ml stamcelle differentiering medium (se trin 1.2.6). Oprethold cellerne ved sub-sammenflydende niveauer, ændre medium hver 3. dag.
      BEMÆRK: Efter 2 ugers inkubation ASC differentieret i SC-lignende ASC, udtrykker deres karakteristiske fænotype (som vist ved Kingham et al. 5). De kan derefter bruges indtil den 10. passage uden mærkbare ændringer i adfærd 29.
<p class = "jove_title"> 3. Høst og Dissociation af dorsalrodsganglier (DRG) neuroner

  1. Afslut rotte ved cervikal dislokation og halshugning. Barber rotter og løfte huden for at blotlægge rygsøjlen. Ved hjælp af en skarp saks, excide rygsøjlen tage ekstra pleje af de indelukkede organer og blodkar. Overfør rygsøjlen i et biologisk sikkerhedsskab (klasse II) ved hjælp af en petriskål og fjerne dorsale del.
  2. Opdel rygsøjlen i halve langs længdeaksen anvendelse af sterile og skarpe kirurgiske sakse for at blotlægge ledningen væv. På dette tidspunkt, er det nyttigt at skære rygsøjlen i to mindre segmenter under niveauet for brystkassen, at gøre det lettere at håndtere under DRG neuron høst. Ved hjælp af fine pincet, forsigtigt fjerne al ledningen væv, opmærksomhed på ikke trække og fjerne DRG rødder. På denne måde DRG og rødderne vil blive udsat inden for de vertebrale kanaler stadig indkapslet i kolonnen. Overhold DRG som hvide filamenter Coming direkte fra kanalerne.
  3. Træk hele DRG rod (ikke kun DRG) fra vertebrale kanaler ved hjælp af meget fine pincet, går dybt ind i vertebrale kanaler og være opmærksom på ikke at beskadige rødderne af ganglier. Overfør DRG i en lille petriskål (60 mm 2) indeholdende 3-4 ml Hams F12 medium suppleret med 1% PS. Hvis du bruger forskellige dyr, anvende separate retter.
  4. Under et dissektionsmikroskop, rengøre DRG af et eventuelt overskydende af nerve rødder omkring ganglier med sterile pincetter og en skalpel for at reducere forurening gliacelle. Overfør DRG i en lille petriskål (35 mm 2) med 1,8 ml frisk F12 medium.
  5. Tilsæt 200 pi 1,25% vægt / vol collagenase type IV stamopløsning (endelig koncentration på 0,125%) og inkuberes DRG ved 37 ° C, 5% CO 2 til 1 time. Aspirere forsigtigt mediet med et glas pipette opmærksom på ikke at aspirere eller beskadige DRG. Tilføj frisk F12 medium smidigmenteret med 0,125% vægt / vol collagenase type IV enzym og inkuber i 1 time som tidligere beskrevet.
  6. Aspirer mediet og forsigtigt vaske DRG med F12 medium. Tilføj derefter 1,8 ml F12-medium og 200 pi trypsin (slutkoncentration på 0,25% vægt / volumen) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 for 30 min.
  7. Fjern trypsin og tilsæt 1 ml F12 medium suppleret med 500 pi FBS at arrestere den enzymatiske reaktion. Aspirer mediet og forsigtigt vaske DRG med F12-medium tre gange for at fjerne spor af serum.
  8. Tilsæt 2 ml frisk F12 medium og omhyggeligt overføre DRG med mediet i et 15 ml rør ved hjælp af en glaspipette. Forsigtigt dissociere DRG-neuroner ved at pipettere op og ned (omkring 8-10 gange) med glasset pipette (plast tips kan anvendes som alternativ).
  9. Pellet sig på bunden af ​​røret og indsamle mediet i et nyt rør. Tilsæt 2 ml frisk F12 medium til røret indeholdende pelleten og gentag mekaniske dissociation med glaspipette. Gentag dette trin, indtil suspensionen bliver homogene (ca. 3-4 gange) og indsamle alle de dissocierede DRG i det nye rør. Denne metode reducerer stress som følge af mekanisk dissociering og forbedrer levedygtigheden af ​​de neuroner.
  10. Filtrer den resulterende homogeniserede suspension i et nyt 15 ml glas med en 100 um cellefilter at fjerne un-dissocierede neuroner og andet affald. På dette stadium, kan det være praktisk først at filtrere cellesuspensionen i et 50 ml rør og derefter overføre opløsningen i mindre rør under anvendelse af en glaspipette. Centrifugeres suspensionen ved 110 g i 5 min.
  11. Der fremstilles en 15% bovint serumalbumin (BSA) ved tilsætning af 500 pi af en 30% BSA-opløsning til 500 pi F12 medium. Langsomt pipetteres opløsningen ned væggen af ​​et 15 ml rør til at skabe en gradvis protein trail. På dette stadium er det nyttigt at holde røret ved en vinkel på 45 ° og langsomt frigive BSA hjælp af tallene påFalcon rør som reference for at danne "spor".
  12. Aspirer supernatanten fra trin 3.10 forlader 500 pi på bunden af ​​røret og resuspender cellepelleten i det samme medium. Langsomt pipettere suspensionen langs protein trail tidligere fremstillede i trin 3.11 (bruge tallene på røret som reference) og centrifugeres ved 500 g i 5 min.
  13. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i 1 ml modificeret BS medium (eller et blandet medium til SC-lignende ASC / DRG co-kultur, som beskrevet nedenfor i trin 4.5.
    BEMÆRK: Lydstyrken at re-suspendere DRG-neuroner kan gøres op til den faktiske nødvendige mængde, afhængigt af den celle koncentration endelige ønskede, og antallet af prøver, der skal podes. Et dyr vil give nok celler til en 24-brønds plade eksperiment.
  14. Inkubér podede prøver ved 37 ° C, 5% CO 2 i 2 timer for at tillade cellebinding og endelig tilføje frisk BS-medium suppleret med 50 ng / ml nervevækstfaktor factor (NGF).

4. Direkte Co-kultur af SC-lignende ASC og DRG-neuroner

  1. Oprethold SC-lignende ASC i kultur på sub-sammenflydende niveauer, som beskrevet i trin 2.2.3. Fireogtyve timer før DRG høst, opsug stamcelle differentiering medium og vask af cellerne med HBSS. Aspirer og inkuberes i 3 ml trypsin ved 37 ° C, 5% CO 2 til 3 min.
  2. Kontroller under et lysmikroskop, at alle celler er adskilt fra kolben. Bank forsigtigt på kolben for at hjælpe løsrivelse. Tilsættes der 7 ml medium at stoppe trypsin reaktionen indsamle cellesuspensionen i et 15 ml rør og centrifugeres ved 110 g i 5 minutter.
  3. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml stamcelle-differentiation medium. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og fortyndes cellesuspensionen ifølge den endelige koncentration, der kræves. Ideelt set podning 20.000 SC-lignende ASC / cm2 ville garantere et konfluent lag af celler.
  4. Seed SC-lignendeASC på substratet og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 til 24 timer for at tillade cellevedhæftning.
  5. Efter 24 timers inkubation, aspireres medium og tilsæt DRG-neuroner på toppen af ​​cellerne som beskrevet i trin 3.14 og 3.15. Skift medium til en blandet medium indeholdende 50% af stamcelle-differentiation medium og 50% af BS medium. Desuden reducerer FBS fusions 1-2,5% i den endelige blandede medium hjælper undgå spredning af kontaminerende satellit celler afledt fra DRG dissociation.
  6. Inkubér samdyrket prøver ved 37 ° C, 5% CO 2 og vedligeholde i kultur i den krævede tid for fremtidige forsøg.

Representative Results

Kulturer af dissocierede DRG-neuroner repræsenterer en egnet in vitro-model til undersøgelse af nerveregenerering. Men ubehandlede substrater ikke et passende miljø for DRG fastgørelse og udvidelse af neuritter. SC-lignende ASC er i stand til at producere vækstfaktorer og kemokiner 19, som kan forbedre muligheden for DRG-neuroner til at spire neuritter når de frigives i dyrkningsmediet. Tilstedeværelsen af ​​SC-lignende ASC i kulturen system, kan derfor spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​DRG funktioner.

Denne protokol (figur 1) illustrerer fremgangsmåden til at udføre en direkte co-kultur af SC-lignende ASC og DRG-neuroner, hvorunder neuronale celler kommer i direkte kontakt med tidligere podet SC-lignende ASC. Den største vanskelighed er forbundet med denne procedure er den høje variabilitet af antallet af DRG-neuroner, der er høstet fra forskellige dyr. Derfor kan resultaterne være nogle gange svært at COMPARe og en særlig opmærksomhed bør rettes under såning procedure for altid at opnå en sammenlignelig celletæthed i hvert forsøg. Protokollen er optimeret til at reducere mindst antallet af satellit celler tilbage fra DRG neuron dissociation ved hjælp af BSA gradient (trin 3.11). Desuden kan cytosin-arabinose (Ara-C) supplement sættes til BS medium med henblik på yderligere at minimere satellit cellepopulation, som beskrevet af Kingham et al. 11. Valget af behandlingstiden skal dog være nøje afbalanceret med DRG og SC-lignende ASC vitalitet, også påvirket af tilstedeværelsen af ​​ARA-C supplement i dyrkningsmediet. Derfor er det meget svært at opnå en satellit celle frit system.

Figur 2 viser betydningen af SC-lignende ASC for DRG neurite spiring i en co-kultur model ved hjælp af ubehandlede og kemisk modificerede poly - caprolacton (PCL) film som substrater. DRG-neuroner var maintained i kultur i 3 dage i nærvær eller fravær af SC-lignende ASC, ved anvendelse af en blandet opløsning indeholdende 50% af BS-medium og 50% af stamcelle-differentiation medium, som beskrevet i trin 4.5. Efter denne periode blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med β-tubulin III (DRG-neuroner) og S100 (SC-lignende ASC) at undersøge cellemorfologi og til at undersøge evnen af ​​DRG-neuroner stikke neuritter. Ingen neuritter blev observeret på ubehandlede overflader i fravær af SC-lignende ASC (figur 2A), medens dannelse af neuritter var klart forbedret i co-kultur (figur 2C). I gennemsnit er antallet af neuritter per celle organ steget betydeligt fra 0 til 3 i nærvær af stamceller. Bekræftelse af disse resultater blev også givet ved scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse, der er vist i figur 3. Navnlig SEM billeder viser, at evnen af DRG-neuroner til at spire neuritter forekommer fortrinsvis i forbindelsemed SC-lignende ASC, som angivet ved de gule pile i figur 3C.

Det skal bemærkes, at anvendelsen af laminin-modificerede substrater (herunder laminin-afledte peptider) i kultur indeholdende DRG-neuroner er ofte blevet defineret som en egnet betingelse for neuronal cellekultur, der bemærkelsesværdige virkninger på neurit formation og udvidelse 30-32 . Resultaterne er vist i figur 2D og figur 3D viser imidlertid, at kombinationen af kemiske og biologiske signaler kan yderligere forbedre responset af DRG-neuroner.

Figur 1
Figur 1. Fremstilling af direkte DRG-SC-lignende ASC co-dyrkningssystem. DRG-neuroner og ASC stammer henholdsvis fra rygsøjlen og visceralt og lyske fedt voksen male Sprague-Dawley rotter. Efter fordøjelse af fedtvæv gennem en kaskade af enzymatiske reaktioner, der ASC differentieret i SC-lignende celler og bibeholdes i sub-sammenflydende forhold indtil brug. SC-lignende ASC er præ-podet på hvert substrat 24 timer før DRG høst. På den dag, DRG-neuroner ekstraheres og adskilles ved en række enzymatiske og mekaniske påvirkninger. Neuronerne podes derefter på toppen af den tidligere podet SC-lignende ASC og opretholdt i kultur indtil analyse (blandet medium: indeholdende 50% af stamcelle-differentiation medium og 50% modificeret BS medium). Venligst klik her for et større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2. Fluorescensbilleder af DRG-neuroner i forskellige dyrkningsbetingelser.(A) ubehandlede PCL film; (B) RGD-modificerede PCL film; (C) co-dyrket med SC-lignende ASC på ubehandlede PCL film; (D) co-dyrket med SC-lignende ASC på RGD-modificerede PCL film. Celler blev holdt i kultur i 3 dage under anvendelse af en blandet opløsning indeholdende 50% modificeret BS medium og 50% af stamcelle-differentiation medium. Efter denne tid blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd, permeabiliseret i en Triton-X opløsning, og ikke-specifikke bindingssteder blev blokeret med 1% BSA. Neuronale celler blev derefter farvet mod β-tubulin III (FITC; grøn) og SC-lignende ASC mod S-100 (AlexaFluor568; rød) antistoffer. Endelig kerner blev farvet med DAPI (blå). Billeder blev erhvervet ved anvendelse af en fluorescens mikroskop (Olympus BX60, Japan). (Re-print med tilladelse fra de Luca et al. 30. Klik her for at se et større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. SEM billeder af DRG neuroner i forskellige dyrkningsbetingelser (A) ubehandlede PCL film (B) RGD-modificerede PCL film;. (C) co-dyrket med SC-lignende ASC på ubehandlede PCL film; (D) samdyrket med SC-lignende ASC på RGD-modificerede PCL film. De gule pile angiver kontaktpunkterne mellem SC-lignende ASC og DRG, bekræfter deres direkte interaktion i co-kultur-systemet. Celler blev holdt i kultur i 3 dage og fikseres i 2,5% glutaraldehyd. Efter dehydrering i gradueret ethanol serien (50%, 70%, 90%, 100%) blev cellerne til sidst skyllet i hexamethyldisilazan og tørres, før montering på stubbe og guld forstøvning til SEM-analyse. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en SEM (Zeiss EVO60, UK) med en accelererende volTage af 10kV. (Re-print med tilladelse fra de Luca et al. 30. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

DRG-neuroner anvendes hyppigt blandt neuronceller for primær kultur til at studere regeneration af neuroner efter axotomi in vivo. Her en nøjagtig protokol for DRG høst fra voksne rotter præsenteres, for at nedbringe bestanden af ​​satellit celler i det omkringliggende miljø uden at kompromittere neuronal overlevelse. Som ASC differentieret i en SC-lignende fænotype er et gyldigt alternativ til SC for celleterapi er en SC-lignende ASC / DRG co-dyrkningssystem også beskrevet i detaljer.

Det er almindeligt kendt, at laminin (eller laminin-afledte peptidsekvenser) har en gavnlig effekt på neuron overlevelse og neurit formation 31-33. Når der udføres DRG neuron kulturer er det tilrådes derfor at tidligere frakke hvert substrat med laminin for at undgå ethvert tab af funktionalitet neuronale celler. Begrebet laminin belægninger gælder også biomateriale substrater til udformning afVævsmanipulering konstruktioner, såsom poly - caprolacton (PCL), der ofte anvendes til fremstilling af nerve ledningerne 30. Også tidligere arbejde viste, at fibrin matricer er egnede materialer til neuronale kulturer i tre dimensioner 11.

Ud over protein belægning, co-kultur modeller giver værdifulde betingelser for DRG neuron overlevelse og et passende miljø for at studere det samspil, der opstår mellem neuroner og SC i det perifere nervesystem efter skade. Celler kan også transplanteres in vivo ved anvendelse af neurale enheder for at forkorte rekruttering tid af autologe celler ved skadestedet. Dette er især vigtigt i alvorlige skader, som kan føre til celleældning / dødsfald og muskelatrofi. Selvom SC er de vigtigste glialceller involveret i processen af ​​perifer nerve regenerering og myelinering, deres begrænsede tilgængelighed og deres langsomme proliferationshastighed gør dem uegnedefor vævsdyrkningsapplikationer 34. ASC er et gyldigt alternativ på grund af deres overflod og evne til at differentiere til SC fænotype, der udtrykker specifikke glial markører og vise funktionelle ligheder til native SC 19. ASC er også i stand til at producere proteiner og vækstfaktorer 5, som kan være til fordel for dannelsen og udvidelsen af neuritter af DRG-neuroner i et co-kultursystem. Dog kan to forskellige co-kultur systemer sættes op som funktion af de eksperimentelle behov. Det foreslås i dette papir metode er en revideret udgave af et veletableret protokol i vores laboratorium 11 og den indebærer en direkte kontakt mellem de to celletyper (direkte co-kultur) hvor den anden type celle (DRG-neuroner) podes på toppen af ​​de andre (SC-lignende ASC). Denne tilgang er baseret på tidligere resultater, som vist betydningen af tilstedeværelsen af en glial celle lag på underlaget når såning neuronkulturer 35 37. Denne effekt skyldes sandsynligvis celle-celle interaktioner gennem DRG integriner og ECM-molekyler deponeret fra ASC og andre signaler på stilken celleoverfladen. Det blev også observeret, at en reduktion af protein serum i mediet reduceret proliferation af kontaminerende satellit celler, som kan udlede fra dissociationen af ​​DRG-neuroner, uden at påvirke ASC funktioner. Men satellit celler, herunder en lille population af SC er vanskeligt helt at fjerne fra kulturer af DRG-neuroner og få tilbageværende celler vil også være til stede i co-kultur-systemet. Derfor er det vigtigt at bemærke, at disse små delpopulationer også kan deltage på myelinering processer i in vitro-studier, der minder om de autologe celler, der er til stede in vivo efter skade. Den anden fremgangsmåde (ikke vist her) indebærer anvendelse af cellekultur skær undgå en direkte kontakt mellem de to forskellige celletyper (indirekte samdyrkning). HowevER, er det ikke repræsentativ af in vivo forhold under nerveregenerering (reduceret evne neuronale celler udvikle lange neuritter), men det anvendes til at undersøge virkningen af frigivne diffunderbare faktorer i mediet ved en bestemt cellepopulation til den anden 38 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer BD Biosciences 352360 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative
15 ml plastic tubes Sarstedt 62.554.002
50 ml plastic tubes Sarstedt 62.547.004
75 cm2 flasks Corning BC301
Retinoic Acid >98% HPLC Sigma R2625
ARA-C supplement Sigma C6645
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) Peprotech 100-18B
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9205
Collagenase type I Gibco 17100-017 Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion
Collagenase type IV Worthington Biochemical LS004188 Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1001
Forskolin  Sigma F3917
Glass pipettes Fisher Scientific FB50253 Sharp material to be disposed accordingly
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) Acorda Therapeutics GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml
Nutrient Mix F12 HAM Sigma N6658 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9394 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
N-2 supplement (100x) Invitrogen 17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands  (NGF) Millipore NC011
Penicillin-Streptomycin (PS) Sigma P0781
Name Company Catalog Number Comments
Petri dishes Corning 430165
Recombinant Human PDGF-AA Peprotech 100-13A
Trypsin  Invitrogen 25200-056 Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks
Trypsin (2x bovine pancreatic) Worthington Biochemical LS003703 This is used for DRG dissociation
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma M8042 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
2-mercaptoethanol Sigma M3148 Prepare the solution in the biological cabinet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
  2. Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
  3. Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
  4. Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
  5. Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
  6. Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
  7. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
  8. Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
  9. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
  10. Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
  11. Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
  12. Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
  13. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
  14. Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
  15. Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
  16. Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
  17. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
  18. Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
  19. Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
  21. Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
  22. Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
  23. Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
  24. Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
  25. Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
  26. Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
  27. Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
  28. Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
  29. Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
  30. Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  31. Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
  32. Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
  33. Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
  34. Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
  35. Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
  36. Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
  37. Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
  38. Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).

Tags

Neuroscience Co-kultur neuroner stamceller neuritudvækst perifer nerve reparation celle-celle-interaktion
Dorsalrodsganglier neuroner og differentierede adipøst afledte stamceller: An<em&gt; In vitro</em&gt; Co-kultur Model til Uddannelse Perifere nerveregenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. … More

de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration. J. Vis. Exp. (96), e52543, doi:10.3791/52543 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter