This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
鳃ionocytes(集成电路)的功能单元进行调控离子鱼。在成人中,它们被发现在鳃的丝状和片状上皮那里运输离子如Na +,Cl –的和Ca 2+通过多种离子通道,泵和热交换器的。的硬骨鱼鳃由面部(VI)中,舌咽(Ⅸ)和迷走(X)中的神经外在支配。在第九和第十的神经也鳃IC支配的外在来源。这里,用于研究神经支配,增殖和IC的分配两种技术进行了说明:一个时间差是染色技术和全双边鳃去神经技术。简言之,金鱼暴露于重要线粒体特异性染料( 例如,MitoTracker红),其标签(红色荧光)预先存在的IC。鱼不是被允许恢复为3 – 5天,立即进行了全面的双边鳃去神经。后3 – 回收的5天,在克弊病收获和固定的免疫组化。然后将组织与α-5初级抗体染色(目标的Na + / K + ATP酶含有细胞)与二次抗体结合该标签的所有(新的和预先存在的)集成电路绿色。使用共焦成像,证明该预先存在的IC出现黄色(标有两个可行的线粒体特异性染料和α-5)和新的IC出现绿(标有α-5只)。串联使用两种技术可用于研究在鳃丝IC的神经支配,增殖和分发时鱼暴露于环境挑战。
集成电路是离子型调控鱼类功能单元,并发现鳃丝上皮表面上和片晶4,6-8,10。虽然各种亚型已经描述了具有独特的功能,许多IC的特征在于一个高密度线粒体的(因此它们也被称为线粒体富细胞)和/或酶的丰度的Na + / K + ATP酶(NKA)。通常情况下,这些IC房子多种其他泵,离子通道和交换涉及离子调控( 例如, 钠 / H +交换, 钠 / Cl –的共转运H +泵)的2,10,11。 IC的再分配和扩散的一种代偿机制是中央对维持离子稳态特别是在离子胁迫( 如,接触离子水的差)4,8,9。
这项研究描述了一个时间差的染色TECHNI阙1,以确定鱼鳃新增殖ionocytes(集成电路)。这种技术被加上鳃弓的完整双边去神经。金鱼( 鲫鱼 ),在这些研究中所使用的品种,非常适合学习鳃上皮细胞的增殖,因为他们有非凡的能力,以结构改造鳃2。鳃重塑是指层间细胞团时,鱼(通常保持在15 – 30℃)的生长或回缩(ILCM)被驯化冷水(<15℃)或缺氧,分别为3。使用于金鱼时间差染色技术以往的研究都集中在集成电路上的鳃中鳃的上下文重塑4,5再分配,支配和增殖。加藤和金子1开发的这种新技术,研究在鳉鱼的改造和更换鳃集成电路(Fundulus heteroclitus)transferred海水(SW)淡水(FW)。在这项研究中,重点是在金鱼集成电路驯化至25℃的增殖和神经支配。
使用它表明时间差的染色技术,在鳃重塑的上下文中,金鱼保持IC的缺氧暴露和随后的含氧量正常的恢复过程中的恒定数量,但是,神经支配的细胞的百分比在整个含氧量正常恢复期5下降。有人建议超过70年前,在鱼类摄取离子机制下神经控制12。的硬骨鱼鳃由面部(Ⅶ),舌咽(Ⅸ)和迷走(X)中的神经也被称为“鳃神经”13,14支配。对斑马鱼的研究由Jonz和护士(2003)( 斑马鱼 )鳃神经支配表明神经支配的起源是外源性(神经纤维的细胞体是外在的鳃),以及本征(的细胞体神经纤维是内在的鳃)。同一作者还表明,鳃集成电路外在支配7。
在这项研究中,再加满双边鳃失神经时间差的染色技术被用于研究集成电路缺乏金鱼外在神经支配的增殖。满双边鳃去神经是指切断脑神经IX和X中,这两种方法都在金鱼可行的,因为它们的尺寸比较大(从30 – 200克),简化了精密的外科手术,和ionocytes使用标准免疫组织化学技术容易地鉴定。发育研究杂交瘤库,大学;在本研究中,集成电路是用一个重要线粒体特异性染料( 例如,MitoTracker红)或针对α亚单位中的Na + / K + -ATP酶(α-5的初级抗体可视化爱荷华州,爱荷华市IA)。该协议提供了一个简单的实现方法具ð可视化和分析上的鱼鳃IC的再分配和扩散。
时间差的染色技术可以理解离子吸收的动态调节和检查IC的时间再分配在鳃上皮的有用工具。虽然一个简单的过程,有一个数字,是至关重要的时间差染色技术的成功关键点。金鱼必须暴露于线粒体富含染料为分配在该协议的时间。短曝光将导致染料由线粒体的富细胞( 即 ionocytes)摄取不良。期间固定,鳃组织必须迅速切下并保持在黑暗处避免光漂白。的组织,必须进行成像2周固定内处理。在双侧神经切片程序确保鱼以及麻醉;神经和血管都明确;和鱼恢复全鳃函数之前它被移动到回收罐中。
“>该FW环境平衡的被动离子损失和渗透水增益14的双重挑战提出了鱼。被动离子损失的平衡,通过盐跨越这些本地化的丝状和片状上皮在那里他们可以在集成电路的主动摄取发生使与外部环境2,4,8,9,16直接接触。但是,IC的鳃位置不是一成不变的。在过去的三十年里的一些研究表明,一些FW鱼的种类,当面对与离子性和/或温度的挑战下,引入薄片向薄片1,2,4,5,17-21的更远侧区的长丝或碱鳃集成电路。这种再分配可能增加薄片的厚度可以妥协气体转移(O 2,CO 2)在整个鳃上皮22。研究人员已经用在这个手稿中描述的时差染色技术来跟踪搬迁和应急电源电子这些不同的实验条件( 图1C)1,4,5下鳃上皮新的集成电路。鳃,想必鳃集成电路,由IX和X颅神经支配7,23-25。这些神经同时承载传出和传入输入和从鳃上。它们分别位于第 4鳃弓背后的口腔内的背侧。神经和与该双边去神经过程可以进行的容易性的辅助功能是物种特异性的。在鳟鱼,例如,磁头的尖头和扁平解剖学允许神经在于在第 4 次鳃弓后面的单一平面下的薄层的组织。这使得神经可见的,很容易接触到的研究人员进行的失神经支配的过程。与此相反,金鱼有较短的鼻子和一个圆的头。金鱼IX和X颅神经说谎更深的背SI德第 4鳃弓占据不同的平面后腔。该取向限制了易于获得的神经,并且需要更仔细的方式来确定和切断相应的神经。去神经过程的目的是除去感觉传入和传出的输入和从鳃上。鳃弓的去神经,也可以再加上使用放射性同位素离子通量实验( 例如,22钠)。这些技术可用于在串联研究神经输入对离子移动穿过鳃上皮的贡献。另一个限制的去神经过程是不能切断的神经从而当感觉和运动神经元之间进行区分,束可能的是两种类型的神经支配的要被删除。切断任何运动神经元可能会影响鱼的鳃鳃盖和运动。因此,在执行鳃去神经试验时,也监视后,通风是非常重要的鱼已经从过程中回收,以确保有足够的鳃运动气体和离子交换。
在这个手稿利用成年动物中所述的协议保持在12:12的光:暗周期,美联储商业食物颗粒。这些方法可以通过多种方式进行修改。首先,线粒体富含染料曝光后的恢复期可以调整,以研究人员的协议( 例如,1,3,5,或14天)的要求。复苏的实验室线粒体丰富的染料暴露后最长期限已经14天4,5。有没有在线粒体富含染料后恢复14天的荧光的强度的显著降低。第二,利用α-5初级抗体被限制为仅识别NKA富含细胞和鳃IC的不同亚型之间没有区分。幸运的是,在金鱼已确定的大多数集成电路都是mitochondr离子富含(标签与MitoTracker)和NKA富含(标签与α-5)的细胞可能并不适用于所有的鱼类物种4,27的情况。未来的实验可以专注于通过对各种渠道,泵和换热器( 例如,NHE,H +泵)的专门针对抗体以下具体IC亚型的时空再分配。以前的研究发现,大多数ionocytes沾上线粒体丰富染料展NKA免疫4。可以通过使用一个初级抗体对斑马鱼来源的神经元特异性抗原(ZN-12)来检测所述IC的支配。在这项研究中,α-5和Zn-12通过使用相同第二抗体(的Alexa Fluor 488),用于既检测第一抗体。这种限制是由于被提出在小鼠宿主初级抗体和由一个事实,即NKA富含细胞和神经元可以形态区分开来,即使它们发荧光相同的颜色被克服。连续染色用不同的第二抗体( 例如,第一个α-5的Alexa Fluor 488然后ZN-12的Alexa Fluor 594),也可用于消除具有两个标记发荧光的颜色相同的问题。最后,充满双侧神经切片协议可以被修改为目标神经具体鳃弓。例如,选择性神经切片可以在第一鳃弓轻轻分开第一和第二鳃弓暴露导致第一鳃弓的鳃篮( 图2B-E)的背底的神经进行。时间差的技术也可用于研究在幼虫斑马鱼ionocytes的分布,因为他们发展和从皮肤到鳃离子迁移过渡。
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |