Abstract
아가미 ionocytes (IC는) 물고기 이온 규제 기능 단위이다. 성인의 경우, 그들은 아가미 filamental와 라멜라 상피에서 발견되는 경우와 같은 나트륨 +, CL대로 전송 이온 - 이온 채널, 펌프 및 다양한 교환기를 통해 및 칼슘. 경골 아가미는 extrinsically, 설인 (IX)과 미주 (X) 신경 (VI) 얼굴에 의해 신경 지배된다. IX 및 X 신경도 아가미 IC의 신경 분포의 외부 소스입니다. 여기, 신경 분포, 확산 및 IC를 분포를 연구하는 데 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 한 번에 차등 염색 기술과 전체 양자 간 아가미 탈 신경 기술. 간단히, 금붕어 중요한 미토콘드리아 특정 염료에 노출 (예를 들어, MitoTracker 레드) 레이블 (적색 형광) 기존의 집적 회로 (IC)가있다. 물고기는 중 3 복구 할 수 있었다 - 5 일 또는 즉시 전체 양자 간 아가미 탈 신경을 시행 하였다. 3 후 - 복구 5 일, g악 수확 및 면역 조직 화학이 고정되어 있습니다. 조직이 다음 α-5 일차 항체로 염색한다 (대상 세포를 포함하는 + / K + ATPase의 나) 모든 (신규 및 기존) IC를 그린 레이블 차 항체와 함께. 공 초점 영상을 사용하여, 그것은 기존의 IC를 새로운 IC를 (가능한 미토콘드리아 특정 염료와 α-5 모두 표시) 노란색 표시 (α-5 전용으로 표시) 녹색 나타나는 증명되었다. 직렬로 사용 두 기술은 물고기는 환경 적 도전에 노출되는 경우에 필라멘트 아가미 IC의 신경 분포, 확산 및 분포를 연구하기 위해 적용될 수있다.
Introduction
IC는 물고기 이온 규제 기능 단위이며, 아가미 필라멘트의 상피 표면에 발견하고 4,6-8,10를 얇은 판. 아형의 다양성이 독특한 특징을 갖고 그 설명 하였지만, IC는 많은 미토콘드리아의 높은 밀도 (따라서 또한 이들은 미토콘드리아 과다 세포들로 알려져있다) 및 / 또는 효소의 풍부한 특징 나트륨 + / K + ATP 아제 (NKA). 일반적으로 이러한 IC를 집 이온 규정 (예를 들어, 나 + / H + 교환기, 나 + / CL - 공동 수송, H + 펌프)에 관련된 다른 펌프, 이온 채널과 교환기의 다양한 2,10,11. 보상 메커니즘으로 IC의 재분배 및 확산은 특히 이온 성 스트레스 (예를 들면, 이온이 물 부족에 노출) 4,8,9 동안 이온 항상성을 유지하기위한 핵심이다.
이 연구는 시간 차동 염색 TECHNI 설명가야 1은 물고기 아가미에 새로 증식 ionocytes (ICS)를 식별합니다. 이 기술은 아가미 아치 완전한 탈 신경 양측에 연결되어있다. 금붕어 (붕어 속 auratus),이 연구에 사용 된 종은, 그들은 구조적으로 아가미 2 개조 할 수있는 놀라운 능력을 가지고 있기 때문에 아가미 상피 세포의 증식을 연구하기에 적합합니다. 차가운 물 (<15 ° C) 또는 저산소증, 각각 3 순응 - 길 리모델링 (30 ° C 일반적으로 15에서 유지) 물고기가 interlamellar 세포 질량의 성장 또는 후퇴 (ILCM)을 의미한다. 금붕어의 시간 미분 염색 기술을 사용하여 이전 연구 4,5- 리모델링 아가미의 맥락에서, IC의 아가미에 재분배, 신경 분포 및 확산에 초점을 맞추고있다. Katoh과 가네코 1 송사리의 변화와 아가미 IC를 교체를 연구하는이 새로운 기술을 개발 (Fundulus의 heteroclitus) transfe신선한 물 (FW)에 바다 물 (SW)에서 rred. 이 연구에서, 포커스는 25 ° C에 순응 금붕어 IC의 증식 및 신경 분포에있다.
아가미 리모델링의 맥락에서, 그것은 그 도시 된 시간 차분 염색 기술을 사용하여, 금붕어 저산소 노출 이후 정상 산소의 회복시, IC의 상수를 유지하지만, 분포하는 세포의 비율은 정상 산소의 회복 기간 (5)에 걸쳐 감소. 그것은 신경 제어 (12)에서 70 년 전 물고기 이온 흡수 메커니즘이라는 것을 제안했다. 경골 아가미는 "아가미 신경"13, 14라고 얼굴 (VII), 설인 (IX)과 미주 (X)에 의해 신경의 지배를한다. 제브라 피쉬에 Jonz 간호사 (2003)에 의한 연구 (다니오 레 리오 (rerio)) 아가미 신경 분포는 신경 분포의 기원은 외인성 (세포체 (신경 섬유의 세포체는 아가미 외적한다)뿐만 아니라 진성 인 것으로 나타났다신경 섬유)는 아가미의 본질이다. 같은 저자들은 아가미 IC를 extrinsically 7 분포하는 것을 보여 주었다.
본 연구에서는 전체 양측 아가미 탈 신경 결합 시간 미분 염색 기술은 금붕어 외인성 신경 분포 결여 IC의 증식을 조사 하였다. 섬세한 수술 절차를 간소화하고, ionocytes 쉽게 표준 면역 조직 화학적 기술을 사용하여 식별 - 전체 양자 간 아가미 탈 신경은 뇌신경의 IX와 X에 상대적으로 큰 크기 (200 g을 30에서) 때문에 이러한 두 가지 접근 방법이 금붕어 가능하다을 절단을 의미한다. 발달 연구 하이 브리 도마 은행, 대학 본 연구에서는 IC는 (예를 들어, MitoTracker 레드) 중요한 미토콘드리아 특정 염료 나 + / K + -ATPase (α-5의 α-서브 유닛에 대한 일차 항체를 사용하여 시각 하였다 아이오와, 아이오와시 IA). 이 프로토콜은 간단 운전 방식을 제공합니다시각화 및 물고기의 아가미에 IC의 재분배 및 확산을 분석 D.
Protocol
두 프로토콜은 동물 관리 (CCAC)의 캐나다 협의회의 지침을 따른다 오타와 동물 관리위원회의 대학 (프로토콜 BL-226)의 승인을 수행 하였다.
1. 시간 차등 염색 기술 : 미토콘드리아 풍부한 염료 목욕
- 디메틸 설폭 사이드 (DMSO 100 %)의 94.0 μL에 50 μg의 용해시킴으로써 1 ㎜ MitoTracker 레드 스톡 용액을 준비한다. 사용하지 않을 때는 -20 ° C에서 어둠 속에서 원액을 유지합니다. 동결 / 해동 사이클을 피하십시오.
- 600 ml의 최대 볼륨으로 - (6 상자 3) 어두운 상자를 준비합니다. 시스템 400ml의 물 (물 일반적에서 개최 된 생선)와 함께 상자를 채우고 O 2의 소스를 제공하기 위해 각 상자에 공기 돌을 배치합니다. 금붕어 받기 (30~40g)을 400 ml의 물과 공기 돌 상자에 넣습니다. 30 분 후, 0.1 μM 및 0.01 % DMSO의 최종 농도를 산출하기 위해 가능한 미토콘드리아 풍부한 염료를 추가합니다. 4 시간 동안 물고기를 목욕R.
- 이러한 제어 물고기 (즉, 아무 탈 신경) 경우, 상자에 물 흐름을 켜 염료를 세척 및 프로토콜에 할당 된 시간의 기간 동안 물고기를 복구 할 수 있습니다. 5 일 - 생선은 일반적으로 3 복구됩니다.
- 회복 기간 후 3 절 진행 : 시간 차등 염색 기법 : 면역 조직 화학 염색을. 이 물고기는 denervated 할 경우 제 2 항에 진행 : 전체 양자 간 탈 신경 절차.
2. 전체 양자 간 탈 신경 절차
- (곡선) 학생 Vannas 스프링 가위, 표준 패턴 집게 직선 일쌍 1 쌍을 확보, 표준 패턴 집게 곡선 일쌍, 제 5 호 집게 이쌍, 조직 견인기 일쌍, 작은 면봉 (1 - 2 직경 ㎜), 면봉 (Q 팁 또는 동급).
- 마취 수조를 준비합니다. 먼저, 100 ml의 최종 부피 벤조 카인의 10g을 용해99 % 에탄올 스톡 용액을 제조 하였다. , 마취 수조를 준비 필요한 온도에서 폭기 시스템 물 30 L로 주식 벤조 카인 용액 15 ml에 용해합니다. 공기 펌프 또는 물 탱크로 중앙 에어 라인에 연결된 공기 돌을 배치하여 탄산 가스를 물.
- 마취 수조 (그림 1A)에 물고기를 놓습니다.
- 호흡이 정지되면, 수술대에 물고기를 배치하고도 1b에 도시 된 바와 같이 그것을 삽관. 화난 마취 용액으로 아가미를 관개하기 위해 구강에 튜브를 삽입하여이 작업을 수행합니다. 아가미의 관개 물고기가 탈 신경 절차를 수행하는 동안 O 2와 마취의 충분한 양이 공급되도록합니다. 헤드가 약간 아래쪽으로 기울어 지도록 배치 물고기. 이 네 번째 아가미 아치 뒤에 지역에 더 나은 액세스 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 똑바로 표준 패턴 집게로 아가미를 들어 올립니다그리고 아가미와 머리의 내부의 조직 견인기를 놓습니다. 조심스럽게 머리에서 아가미를 유지하고 노출 아가미를 유지하기 위해 조직 견인기를 엽니 다.
- 마취 솔루션은이 절차를 수행하는 동안 아가미를 관개되어 있는지 확인합니다. 트랙터 네 아가미 아치에 대한 액세스를 제공하는 머리 옆에 처리 휴식.
- 머리에 네 번째 아가미 아치를 부착 인대의 긴장을 만들을 열고 부드럽게 네 번째 아가미 아치와 머리 뒤쪽 사이의 곡선 표준 패턴 집게를 놓고. 아가미 구멍에 아가미 아치의 지느러미 끝을 연결하는 상피를 관통하여 - (3 mm의 2) 호 한 쌍의 5 집게는 작은 구멍을 만드십시오. 주요 혈관 손상의 위험이 있기 때문에 너무 깊이에서 이동하지 않도록주의하십시오.
- 5 집게 천천히 조심스럽게 제 개최 작은 솜 IX (설인) 및 X (미주) 신경을 노출하는 절개를 확장합니다. 무료다시 혈관을 손상하지 않도록주의하면서, 제 5 집게를 사용하여 모든 결합 조직에서 신경.
참고 : 금붕어의 아가미 IX 및 X 신경은 네 번째 아가미 아치 뒤에 깊은 휴식과 아가미 아치에 공급하는 주요 혈관에 근접하고 있습니다. - 신경이 사용을 확인하고 나면 곡선 표준 모양 집게로 열린 절개를 누른 상태에서 곡선 스프링 가위는주의 깊게 신경을 잘라. 신경을 절단 한 후, 부드럽게 곡선 집게를 철회. 48 시간 - 상피가 매우 얇으며 일반적으로 절개가 24 내에 자체적 닫기 때문에 봉합 절개를 닫을 필요가 없다. 조직 견인기를 제거합니다.
- 헤드의 다른 측면에서 동일한 과정을 반복한다.
- 마취에서 물고기를 복구하는 신선한 화난 물에 마취에서 아가미의 관개를 전환합니다. 일단 아가미 운동은 최소 24 시간 동안 회복하기 위해 실험 탱크에 물고기를 이동 재개했다.
3. 시간 차등 염색 기법 : 면역 조직 화학
- (; PBS의 96 ml의에서 4g PFA PBS) 첫째, 1X 인산 완충 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비합니다. PFA는 실온에서 PBS에 쉽게 용해되지 않습니다. 수욕 중에서 가열 용액을 PFA를 용해. 흄 후드에서이 작업을 수행합니다. PFA 솔루션에 있으면 사용하기 전에 식힌다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 8 섬광 유리 병 (아가미 아치 당 1 병) 총 섬광 유리 병에 4 % PFA의 4 ml의 - 아가미 조직을 물고기를 안락사 및 추출하기 전에, 3 놓습니다. 또한, 작은이 1X PBS로 보트의 무게를 채우기 걸릴. 이것은이 절개 된 후 조직을 세척하기 위해 사용될 것이다. 얼음에 모든 솔루션을 보관하십시오.
- 가능한 미토콘드리아 풍부한 염료 노출 후실험은 벤조 카인의 과다 복용으로 물을 욕조에 배치하여 금붕어를 안락사, 완료했습니다.
- 아가미 아가미 바구니의 각 끝을 절단 한 머리의 측면과 곡선 가위에 아가미를 들어 올릴 무딘 집게를 사용합니다. 조심스럽게 무딘 집게를 사용 레이커로 아가미를 선택하고 아가미 구멍 밖으로 들어 올립니다. 즉시 초과 벤조 카인과 혈액을 제거하기 위해 PBS 1X 얼음 추위에 아가미를 씻는다.
- 4 % PFA로 가득 별도의 유리 병에 절제 아가미 (각 아가미 아치를위한 유리 병)을 넣고 4 ℃에서 O / N을 고정합니다.
- 고정 후, 1X PBS의 초과 PFA 씻어 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 6 시간 동안 진탕 기에서 1 % 트리톤 X 1.5 ml로 채워진 2 ml의 총알 튜브에 조직을 배치합니다. 이 단계에서는 조직 permeabilizes. 전체 아가미가 2 ML 튜브에 배치 너무 큰 경우 필라멘트가 손상되지 튜브 돌보는 맞게 충분히 작은 섹션으로 조직을 잘라.
- 마일에 의해 차 항체 희석을 준비합니다싱 1X PBS의 992 μL에 각각의 일차 항체 (8 μL 총)의 주식 솔루션의 4 μL. NKA는 (NKA 풍부한 세포 레이블) 있는지 확인하고 ZN-12 (레이블 뉴런) 차 항체가 동일한 호스트에서 제기되고있다. 연구자들은 상이한 숙주 종에서 발생하는 일차 및 이차 항체를 사용하는 것, 동시에 특정 IC 서브 타입을 식별하는 것을 결정하는 경우에 중요하다.
- 트리톤 X 용액을 제거하고 조직이 하나 추가 세척없이 : NKA 모노클로 날 항체 250 희석 (1X PBS에 희석) (α-5) NKA 과다 세포 및 지브라 피쉬 특정 신경 세포 항체를 검출하기 위해 (Zn으로-12) 신경 섬유 (주 항체)을 검출하고 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 6 시간 동안 진탕 배양한다.
- 1X PBS를 사용하여 3 분마다 차 항체 제거하는 과정을 3 회 반복한다. 이렇게하려면, 피펫을 사용하여 그것을 흡입하여 관에서 차 항체 솔루션을 제거합니다.
- 에서 차 항체를 준비합니다1 : 1X PBS의 995 μL에 재고 차 항체의 5 μl를 혼합하여 200 희석. 이차 항체 (알렉사 플 루어 488)를 적용하고 진탕 기에서 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 6 시간 동안 배양한다.
참고 : MitoTracker 레드 ~ 594 nm 파장에서의 흥분과 빨간색 형광 것이다. ~ 488 nm 파장에서 흥분과 녹색 형광되는 이차 항체는 NKA 레이블과 ZN-12 일차 항체를 사용해야합니다. - (단계 3.7에 기재된 바와 같이)을 5 분마다 조직을 3 회 세척하여 과량의 차 항체를 제거한다.
4. 영상
- 세척 후, 세포와 신경 섬유의 촛점 촬상 마운트 전체에 대한 오목 슬라이드 조직을 탑재. 조직을 마운트하려면, 먼저 평면 현미경 슬라이드에 1X PBS 한 방울 (200 μL)에 넣습니다. 이 조직은 마르다하지 않는 것을 보장한다.
- 곡선 마이크로 가위로 아가미 hemibranchs을 분리합니다. 1X PBS의 드롭 및 오목 슬라이드에 장착 매체의 드롭을 배치.
- 위로 향하게 필라멘트의 리딩 엣지와 오목 슬라이드로 분리 hemibranchs를 놓고 커버 슬립 커버. 주변 조직과 이동 변위로부터 커버 슬립을 방지하기 위해 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 DAB. 이미징 전에 15 분 - 조직 (10)의 오목 슬라이드의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- 각 아가미 아치를 들어, 아가미 아치 당 여섯 이미지를 생산, 이미징을위한 무작위로 여섯 아가미 필라멘트를 선택합니다. 3 μm의 광학 조각 - 1을 복용하여 이미지에 조직을 기존 공 초점 현미경을 사용합니다.
참고 : 모든 기존의 세포는 MitoTracker 빨간색으로 표시되며 NKA에 긍정적는 노란색 표시됩니다. 빨간색 만 나타납니다 세포 NKA를 포함하지 않는 기존의 IC를합니다. 새로 증식 된 세포는 NKA에 대한 긍정적 인 것입니다 만 녹색으로 표시됩니다. 신경 섬유는 또한 녹색 나타납니다.
Ionocyte 정량화 5. 이미지 분석
- EAC를 들어이미지화 된 H 아가미 필라멘트, Z 스택의 부분을 스크롤하고 본 그들이 새로 분화 여부를, 선재, 및 / 또는 신경 지배 층상 및 filamental IC의 수를 카운트하여 IC 및 관련 신경 분포를 정량화 .
- 필라멘트 (mm 2) 필라멘트 당 또는 면적 당 IC를 정량화. IC를 정량 하였다 된 필라멘트의 영역을 포괄 필라멘트의 라멜라 윤곽을 화상을 얻기 위해 사용하는 소프트웨어와 연관된 그리기 도구를 사용하여 수행. 대부분의 공 초점 이미지 소프트웨어 프로그램은 이미지 윤곽 영역의 면적을 계산하는 옵션이있다. 만약 영역이 취득 할 수 있도록 결상 소프트웨어 옵션을 사용.
- (mm 당 2 예)의 단위 면적당의 IC 측정치를 획득하기 위해 소프트웨어에 의해 산출 된 면적으로 계산 IC를 나눈다.
Representative Results
그림 1은 설정 수술 테이블 (그림 1A)를 보여, 수술 중 물고기의 위치 (그림 1B) 및 시간 차이 염색 기법 (그림 1C)에 대한 세 가지 가장 중요한 단계. 단계 1에서, 물고기 어둠 속에서 25 ° C 웰 화난 수조에서 30 분 동안 유지된다. 30 분의 기간 동안, 연구자는 2 단계 (도 1C) 동안 물에 첨가 DMSO에서 미토콘드리아 - 리치 다이 분취 량을 준비 할 수있다. 2 단계의 배양 기간은 미토콘드리아 풍부한 세포 (즉, IC) 데이터에 물에서 미토콘드리아 풍부한 염료의 흡수 수 있습니다. 물고기는 다음 중 하나를 전체 양자 간 탈 신경 절차 나 물고기가 마취 된 가짜 절차 및 조작 opercula을받을 수 있지만 신경은 그대로 유지됩니다. 3 단계에서 설정은 에이가 물고기를 흐르는 물과 함께 제공 복구 챔버를 나타냅니다거기는 전체 양자 간 탈 신경 또는 "가짜"절차를 겪었다.
회복 기간 후, 물고기 안락사하고 아가미 절제 및 면역 조직 화학 고정되었다. "가짜"절차를 시행 한 물고기의 아가미 필라멘트에 IC의 전체 분포와 신경 분포는 그림 2에 도시되어있다.이 IC는 interlamellar 지역. 그림 2A 쇼의 기지에서뿐만 아니라 filamental 상피 세포에 존재 미토콘드리아가 풍부한 염료로 표지 기존 IC를 (탈 신경 / 가짜 절차가 수행되기 전에 즉, 이들 IC는 존재).도 2B는 신경 섬유가 기존 및 새롭게 형성된 IC를 (NKA 면역 반응에 의해 식별) filamental의 및에 분포 도시 층상 상피. 마지막으로, 두 이미지의 병합 (도 2c)은 명확 기존 IC를 (노란색 표시) 및 새로운 IC가 (녹색 표시) 드러낸다.도 2D는도 2A-C에 도시 된 필라멘트 용 IC 부량의 대표적인 그래프이다. 이러한 특정 필라멘트에서 IC를 기존보다 2 mm 당 새로 증식, IC의 많은 수있을 표시 (N = 1). 외부 아가미 신경 분포의 원인을 제거하려면, IX 및 X 뇌신경 (외부 신경 분포가) 절단 하였다. 그림 3a는 아가미 필라멘트 후 아가미 구멍의 등 영역을 보여주고 신경을 덮고있는 상피는 IX와 X를 노출 제거 두 개의 주요 신경 줄기에서 스팬 (로마 숫자로 표시) 뇌신경은 네 개의 아치 (그림 3A)를에 분포하는 단계; 아가미 아치는 첫 번째 아가미 아치의 선택적 탈 신경을 설명 4. 그림 3B-E를 통해 1 번호가 지정됩니다. 첫 번째 아가미 아치 나머지 부분에 신경 분포 O에 영향을주지 않고 제거 할 수 있습니다 모두 IX와 X 뇌신경 (그림 3B)에 의해 신경 지배한다아가미 아치 (그림 3C-E) 바. 아가미 필라멘트에 외부 신경 분포의 점진적 손실 (도 4a-C)에서 전체 양자 간 탈 신경 결과. 제어 물고기는 필라멘트 (그림 4A)의 길이에 걸쳐있는 명백한 신경 다발을 나타낸다. 전체 양자 간 탈 신경은 회복 2 일 (그림 4B) 후 외부 신경 분포의 일부 손실이 발생했습니다. 외부 신경 분포의 또 다른 실종 탈 신경 (그림 4C)에서 복구 5 일 후에 관찰되었다. 회복의 오일은 아마도 아가미 필라멘트 내에서 세포 기관과 신경에서 유래 된 후 IC를에 남아있는 신경 분포 (고유 신경 분포, 그림 4C).
그림 1. 실험은 사용 단계의 탈 신경 절차 및 순서에 대해 설정시간 미분 염색 기술. 마취 및 복구 탱크를 보여주는 탈 신경 절차를 설정 (A) 수술 테이블. 마취, 삽관 물고기의 배치 (B) 예. 시간 미분 염색 기법에 사용 (C) 주요 단계. 단계 1에서, 물고기 30 분 동안 온도 제어, 정전기 폭기 수조에 위치된다. 미토콘드리아가 풍부한 염료 0.1 μM의 최종 농도 2 단계에서 첨가하고, 물고기 4 시간 이상 동안 용액에서 목욕시킨다. 물 흐름이 단계 물고기가 아가미의 전체 양자 간 탈 신경 또는 가짜 수술를 거쳐 지적하는 3에서 다시 시작됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 이일 전체 양자 간 탈 신경 후 (25 ° C에 적응) 금붕어의 시간 미분 염색 기술을 나타내는 2. 가벼운 현미경 사진. (A) 기존 ionocytes (IC를 화살표)의 분포. 하나의 아가미 필라멘트에이 미토콘드리아 풍부한 염료 염색으로 밝혀 (B) IC의 분포를 (신규 및 기존) 및 아가미 신경 (점선 화살표) 각각, α-5 및 Zn으로-12 항체로 염색하여 계시된다. 화살표는 IC가 나타내는 (C)는 (A)와 (B)의 중첩은 기존 IC를 구별한다. (; 화살표로 나타내는 녹색 표시)으로부터 IC를 새롭게 증식 (노란색 표시 화살촉 표시됨). 삽입 위치 (C)가 분포하는 기존 ionocyte의 배율이다. (D) 패널 (AC)에 도시 필라멘트 용 IC 부량의 대표적인 그래프. 패널에서 N = 1 스케일 바 (C)는 50 μm의를하고 모든 패널에 적용됩니다./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아가미 신경 분포의 다양한 단계를 묘사 3. 대표 이미지를 그림. IX 및 X 뇌신경이 4 아가미 아치를 지배하는 표시 구강의 (A) 느 러 미보기. 길 아치 1-4으로 번호가 매겨집니다. 아가미 필라멘트와 신경이 더 신경 분포를 시각화 제거 덮고있는 조직. (B) 1 차 및 2 차 아가미 아치는 감각 기관을 나타 내기 위해 분리하고, IX 및 X 두개골 신경의 가지가 1 일 아가미를 지배하는 아치. IX 및 X 두개골 신경의 가지를 절단하여 1 차 아가미 아치의 선택 탈 신경의 이미지를 보여주는 (CE) 순서. 개략적 다시 들어경골 어류의 아가미 신경 분포의 프리젠 테이션, Milsom 보낸 사람 등의 그림 1 참조 (26) 이미지의 흰색 선 현미경 조명에서 물 반사입니다.; 그들은 어떤 형태 학적 구조를 정의하지 않습니다. 패널의 스케일 바 (E)는 4mm이고 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
25 ℃ Ionocytes (화살표 머리로 표시)에 적응 금붕어의 1 차 아가미 아치의 단일 필라멘트에 ionocytes의 분포 및 신경 분포를 묘사하는 그림 4. 빛 현미경가 표시 α-5 항체 및 신경 (염색 하였다 BY 화살표). 아연-12 항체로 염색 아마도 광범위한 층상가 분기와 IX 및 X 신경 (외부 신경 분포)에서 발생하는 중추 신경 다발을 보여주는 제어 물고기 (A) 길 필라멘트했다. 표시된 ionocytes 중 일부는 (삽입). (B) 아가미 필라멘트 이일 전체 양자 간 탈 신경 후 신경 지배를하고 있습니다. 라멜라 신경 분포 5 일 외부 신경 분포가 크게없는 것을 보여주는 전체 양자 간 탈 신경 후. (C) 아가미 필라멘트 대부분 그대로 등장하면서 중추 신경 다발의 감소가 있었다. 정성 분석은 전체 양자 간 탈 신경이 아가미 필라멘트 내에서 세포 기관 (고유 신경 분포) 필라멘트를 통해 얇은 판으로 신경의 네트워크를 만드는 신경을 유지하면서 외부 아가미 신경 분포의 저하를 야기하는 것이 좋습니다. 하십시오이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
시간 차분 염색 기술은 이온 흡수량의 동적 조절을 이해하고 아가미 상피에서 IC의 시간적 재분배를 검사 유용한 도구가 될 수있다. 비교적 간단하지만, 시간 차분 염색 기술의 성공에 매우 중요하다 요점들이있다. 금붕어는 프로토콜에 할당 된 시간의 미토콘드리아 풍부한 염료에 노출되어야합니다. 짧은 노출은 미토콘드리아 풍부한 세포 (즉, ionocytes)에 의한 염료의 가난한 흡수가 발생합니다. 정착 중에 아가미 조직을 절개해야 신속 및 포토 블리 칭을 방지하기 위해 어두운 유지. 조직을 고정 2 주 이내에 이미징 처리해야합니다. 양측 신경 절편을 수행하는 동안에는 물고기가 아니라 마취 있는지 확인; 신경과 혈관이 명확하게 식별됩니다 이 회수 탱크로 이동하기 전에 물고기가 가득 아가미 기능을 다시 시작합니다.
"> FW 환경. 수동적 인 이온 손실과 삼투 물 이득 (14) 균형의 이중 도전에 물고기를 제공 수동적 인 이온 손실의 균형 filamental 및 층상 상피 그들이 할 수있는 언어로 번역 IC를 가로 질러 소금의 활성 흡수를 통해 발생 외부 환경 2,4,8,9,16과 직접 접촉을합니다. 그러나, 아가미에 IC의 위치가 고정되지 않습니다. 지난 30 년 동안 많은 연구가 여러 FW 물고기 종을 보여 주었다 직면했을 때 이온 성 및 / 또는 온도 도전 과제 1,2,4,5,17-21 라멜라의보다 말단 영역에 라멜라의 필라멘트 또는 염기로부터 아가미 IC를 재분배. 이러한 재분배는 라멜라의 두께를 증가시킬 수있다 가스 이송 손상시킬 수있다 (O 2, CO 2, 22). 연구원이 원고에 기재된 타임 디퍼렌셜 염색 기술을 사용한 아가미 상피를 가로 질러 및 재배치에 의한 비상을 추적이러한 서로 다른 실험 조건 (그림 1C) 1,4,5에서 아가미 상피 세포에 새로운 IC는 전자.아가미, 그리고 아마도 아가미의 IC들은, IX 및 X 뇌신경 7,23-25에 의해 신경 지배를하고 있습니다. 이 신경은 각각과 아가미에서 원심성과 구 심성 입력을 모두 수행한다. 그들은 4 번째 아가미 아치 뒤에 구강의 등쪽에 위치한다. 신경 및 양자 탈 신경 절차가 수행 될 수있는 용이성 접근성은 특정 종이다. 신경 조직의 얇은 층 아래 4 번째 아치 길 뒤에 단일 평면 내에 놓여 송어, 예를 들어 헤드의 뾰족 평평 해부한다. 이렇게 신경이 가시 탈 신경 절차를 수행하는 연구자 쉽게 접근한다. 반면, 금붕어는 짧은 주둥이와 둥근 머리를 가지고있다. 금붕어의 IX와 X 뇌신경는 지느러미시에 깊은 거짓말다른 비행기를 차지하는 4 번째 아가미 아치 후 공동의 드. 이 배향은 신경의 접근 용이성을 제한하고 적절한 식별 및 신경 단절 더욱 신중한 접근법을 필요로한다. 탈 신경 절차의 목적은 각각과 아가미에서 원심성 및 구 심성 감각 입력을 제거하는 것이다. 아가미 아치 탈 신경은 방사성 동위 원소를 이용하여 이온 플럭스 실험 (예, 22 NA)과 연결될 수있다. 이러한 기술 아가미 상피 걸쳐 이온 이동에 신경 입력의 기여를 연구하는 직렬로 사용된다. 탈 신경 과정에 또 다른 제한은 신경을 절단하여 때, 감각과 운동 신경 세포 사이의 구별은 신경 분포의 두 가지 유형이 제거되는 것이 가능하다 번들 할 수 없다는 것입니다. 어떤 운동 신경을 절단하는 것은 물고기의 아가미와 아가미의 움직임에 영향을 미칠 수 있습니다. 탈 신경 아가미 실험을 수행 할 때 그러므로 그것은 또한 후에 환기를 모니터링하는 것이 중요물고기는 가스 및 이온 교환 모두를위한 충분한 아가미의 움직임이 있는지 확인하는 절차로부터 복구되었습니다.
어두운주기 및 공급 상용 식품 알약이 원고를 사용 성인 동물에 기술 된 프로토콜은 12시 12분 빛에 보관. 이러한 방법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 먼저, 미토콘드리아가 풍부한 염료 노광 후의 회복 기간은 연구자의 프로토콜 (예를 들면, 1, 3, 5, 또는 14 일간)의 요건을 조정할 수있다. 실험실에서 미토콘드리아 풍부한 염료 노출 후 회복의 최장 기간은 14 일 4,5하고있다. 복구 14 일 후 미토콘드리아 풍부한 염료의 형광의 강도에 유의 한 감소가 없었다. 둘째, α-5 차 항체의 사용은 NKA 과다 세포를 식별하고 아가미 IC를 다른 서브 타입을 구별하지 않고 한정된다. IC의 대부분은 모두 mitochondr이라는 것을 다행스럽게도, 금붕어에 설립되었다이온이 풍부한 (MitoTracker 레이블) 및 모든 물고기 종 4,27의 경우하지 않을 수 있습니다 세포 (α-5 레이블) NKA 풍부한. 미래의 실험은 채널, 펌프 및 교환기 (예를 들어, NHE, H + 펌프)의 다양한에 대해 구체적으로 지시 된 항체를 사용하여 특정 IC 서브 타입의 시간 재배포 다음에 집중할 수 있습니다. 이전의 연구는 발견 미토콘드리아 풍부한 염료 전시 NKA 면역 4로 염색 ionocytes의 대부분. IC는 신경 분포 지브라 피쉬 유래 신경 세포 특이 적 항원 (Zn으로-12)에 대한 일차 항체를 사용하여 검출 할 수있다. 본 연구에서는 5-α 및 ZN-12 차 항체 모두에 동일한 이차 항체 (알렉사 형석 488)를 사용하여 검출 하였다. 양쪽 차 항체 마우스 숙주에서 제기되고 및 NKA 과다 세포 및 뉴런들이 동색 형광에도 형태학 구별 될 수 있다는 사실에 의해 극복되는이 제한 때문이다. 연속 염색다른 이차 항체 (알렉사 488와 형석 예, 제 α-5 다음 형석 알렉사 594로 ZN-12)도 동일한 색상을 모두 형광을 갖는 마커의 문제를 제거하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 전체 양자 간 신경 절편 프로토콜은 특정 아가미 아치에 신경을 대상으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 선택적 신경 절편 부드럽게 아가미 바구니 (도 2B-E)의 등쪽 단부에서 제 아가미 아치으로 이어지는 신경을 노출하기 위해 상기 제 1 및 제 2 아가미 아치를 분리하여 제 아가미 아치 상에 수행 될 수있다. 타임 디퍼렌셜 기술은 또한 개발하고 아가미 피부에 이온 수송로 전환 지브라 피쉬 물고기 유충 ionocytes의 분포를 연구하기 위해 적용될 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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