Abstract
Brankiyal ionocytes (IC) balık iyonik düzenleme için işlevsel birimlerdir. Yetişkinlerde, onlar solungaç ve filamental ve katmanlı epitel bulunan nerede Na +, Cl gibi onlar ulaşım iyonları - iyon kanalları, pompa ve eşanjör çeşitli yoluyla ve Ca 2+. teleost solungaç dışsal glossofaringeal (IX) ve vagus (X) sinirler (VI) yüz tarafından innerve edilir. IX ve X sinirler de brankiyal IC innervasyon dışsal kaynağıdır. Burada, innervasyonu, çoğalmasını ve IC dağılımını incelemek için kullanılan iki teknik tarif edilmiştir: Bir zaman diferansiyel boyama tekniği ve tam ikili solungaç denervasyon tekniği. Kısaca, akvaryum balığı hayati mitokondri özel boya maruz (örn, MitoTracker Kırmızı) etiketler (kırmızı floresan) önceden varolan IC. Balık ya da 3 için eski hallerine gelmeye bırakılmıştır - 5 gün ya da hemen tam bir ikili solungaç denervasyon uygulandı. 3 Sonra - kurtarma 5 gün, gdertlerin hasat ve immünohistokimya için sabittir. Doku daha sonra, bir α-5 birincil antikor ile boyanmış olan (hedef hücreleri ihtiva eden + / K + ATPaz Na) Tüm (hem yeni hem de önceden var olan) IC yeşil etiket ikincil bir antikor ile birlikte kullanılabilir. Konfokal görüntüleme kullanarak, önceden varolan IC ve yeni ICS (bir canlı mitokondri özel boya ve α-5 hem de etiketli) sarı görünür (α-5 yalnızca etiketli) yeşil görünür olduğu gösterilmiştir. Tandem kullanılan iki teknik balık çevre sorunlarına maruz kaldığında solungaç filamanın üzerindeki IC innervasyonu, çoğalmasını ve dağıtım çalışma uygulanabilir.
Introduction
IC balık iyonik düzenleme için işlevsel birim ve solungaç filamentlerin epitel yüzeylerde bulunan ve 4,6-8,10 lamelleri. Alt tipler benzersiz özelliklere sahip olduğu tarif edilmesine rağmen, IC birçok mitokondri yüksek yoğunluklu (böylece aynı zamanda mitokondri zengin hücreler olarak da bilinir) ve / veya enzimin bolluğu ile karakterize edilen, Na + / K + ATPaz (NKA). Tipik olarak, bu IC ev iyon düzenleme (örneğin, Na + / H + değiştirici, Na / Cl - ko-transporter H + pompa) 'de yer alan diğer pompalar, iyon kanalları ve değiştiricilerin çeşitli 2,10,11. bir telafi mekanizması olarak IC dağıtılması ve yayılması özellikle iyonik stres (örneğin, iyon-fakir suya maruz kalma) 4,8,9 sırasında iyon dengesini sağlamaya yönelik merkezi.
Bu çalışma, bir zaman diferansiyel boyama Techni açıklarque 1 balık solungaçları yeni çoğaldı ionocytes (IC) tanımlamak için. Bu teknik, solungaç kemerler tam bir ikili denervasyon ile birleştirilmiştir. Balığı (Carassius auratus), bu çalışmalarda kullanılan türler, yapısal olarak kendi solungaçları 2 yeni model için önemli bir özelliğine sahiptir, çünkü solungaç epitel hücrelerin çoğalmasını çalışma için uygundur. Soğuk su (<15 ° C) ya da, oksijen azalması, sırasıyla 3 ortama alıştırılır - Gill yeniden modelleme (30 ° C, normal olarak 15 de muhafaza edilmiş) balık bir interlameller hücre kitlesinin büyümesine ve geri çekilmesi (ILCM) belirtir. Goldfish zamanı diferansiyel boyama tekniği kullanılarak Önceki çalışmalar 4,5 biçimlenme solungaç bağlamında solungaç üzerindeki IC dağıtılması, innervasyon ve çoğalması üzerine odaklanmıştır. Katoh ve Kaneko 1 killifish dönüşümü ve brankial IC değiştirilmesini incelemek için bu yeni tekniği geliştirdi (Fundulus heteroclitus) transfeTemiz su (FW) deniz suyu (SW) ile ilgili rred. Bu çalışmada, odak noktası 25 ° C alıştırıldı akvaryum balığı IC çoğalması ve innervasyonunu üzerindedir.
Gill yeniden bağlamında, bu gösterilen süre farkı boyama tekniği kullanılarak, akvaryum balığı hipoksik maruz kalma ve takip eden normoksik geri kazanımı sırasında ICs sabit sayıda muhafaza, bununla birlikte, inerve hücrelerin yüzdesi normoksik iyileşme dönemi 5 boyunca azalmıştır. Bu nöral kontrol altında 12 fazla 70 yıl önce balık iyonik alım mekanizmaları olduğu ileri sürülmüştür. teleost solungaç da "brankiyal sinirler" 13,14 olarak anılacaktır yüz (VII), dil ve yutak (IX) ve vagus (X) sinirler tarafından innerve edilir. Zebra balığı üzerine Jonz ve Hemşire (2003) tarafından yürütülen çalışmalar (Danio rerio) solungaç innervasyon innervasyon kökeni dışsal (hücre gövdesi (sinir lifi hücre gövdesi solungaç için dışsal olan) yanı sıra içsel olduğunu gösterdisinir lifi) solungaç özgüdür. Aynı yazarlar da brankiyal IC dışsal 7 innerve olduğunu göstermiştir.
Bu çalışmada, tam iki taraflı solungaç denervasyon ile birleştiğinde zaman diferansiyel boyama tekniği akvaryum balığı olarak dışsal innervasyon eksik IC çoğalmasını araştırmak için kullanıldı. Narin cerrahi prosedürler kolaylaştırır ve ionocytes kolayca standart immunohistokimyasal teknikler kullanılarak tanımlanır - Tam ikili solungaç denervasyon kranial sinirler IX ve X. nispeten büyük boy (200 gr 30), çünkü bu iki yaklaşım akvaryum balığı uygulanabilir olan kesilmesinin anlamına gelir. Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, University Mevcut çalışmada, IC (ör MitoTracker Kırmızı) önemli bir mitokondri özel bir boya ya da Na + / K + -ATPaz (α-5 α-alt birimlerine karşı birincil antikor kullanılarak görselleştirilmiştir Iowa, Iowa City IA). Bu protokol, basit bir yöntemii sağlargörselleştirme ve balık solungaç üzerindeki IC yeniden dağıtılmasını ve çoğalmasını analiz d.
Protocol
Her iki protokol Hayvan Bakımı (CCAC) Kanada Konseyi kurallarına uyduğu ve Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi (Protokol BL-226) onayı ile yapılmıştır.
1. Zaman Diferansiyel Boyama Tekniği: Mitokondri zengin Boya Banyosu
- Dimetil sülfoksit (% 100 DMSO) içinde 94.0 ul 50 ug çözülmesiyle, 1 mM MitoTracker Kırmızı stok çözelti hazırlayın. Kullanılmadığı zaman -20 ° C'de karanlıkta stok solüsyonu tutun. Donma / çözülme döngüleri kaçının.
- 600 ml'lik bir maksimum hacme sahip - (6 kutu 3) koyu kutuları hazırlayın. Sistem 400 ml su (su normalde tutulan balık) ile kutuları doldurun ve O 2 kaynağı sağlamak için her kutuda bir hava taşı yerleştirin. Goldfish elde (30-40 g) ve 400 ml su ve hava taşı ile kutulara koyun. 30 dakika sonra, 0.1 uM ve 0.01% DMSO nihai konsantrasyonlar elde etmek için uygun bir mitokondri zengin boya ekleyin. 4 saat için balık batırınr.
- Bu kontrol balık (yani, hiçbir denervasyon) ise, kutulara su akışı açmak boya dışarı floş ve protokolde ayrılan süre için balık kurtarmak için izin verir. 5 gün - Balık genellikle 3 kurtarıldı.
- Iyileşme süresinden sonra Bölüm 3 geçin: Zaman Diferansiyel Boyama Tekniği: İmünohistokimya. Bu balıklar sinirsiz için ise Bölüm 2 geçin: Tam İkili denervasyon Prosedürü.
2. Tam İkili denervasyon Prosedürü
- (Kavisli) Öğrenci Vannas yaylı makas, standart model forseps-düz 1 çift 1 çift elde, standart model forseps kavisli 1 çift, No. 5 forseps 2 çift, doku retraktörleri 1 çift, küçük pamuk topları (1 - 2 mm çapında), ve pamuklu (Q İpuçları veya eşdeğeri).
- Anestezik su banyosu hazırlayın. İlk olarak, 100 ml lik bir son hacme kadar benzokain, 10 g çözülmesi% 99 etanol içinde bir stok çözeltisi hazırlanır. , Anestezi su banyosu hazırlamak gerekli sıcaklıkta gazlı sistem su 30 L içine stok benzocaine solüsyonu 15 ml eritmek için. Bir hava pompası veya su deposu bir merkezi hava hattına bağlanmış bir hava taşı yerleştirerek su havalandırır.
- Anestezik su banyosunda (Şekil 1A) içine balık yerleştirin.
- Nefes bittikten sonra, bir ameliyat masaya balık yerleştirin ve Şekil 1B gösterildiği gibi entübe. Gazlı anestezik solüsyonu ile solungaçları sulamak için kendi ağız boşluğuna bir tüp takarak bunu yapın. Solungaçlar sulama balık denervasyon işlemi sırasında O 2 ve anestezi yeterli bir miktarı ile birlikte temin eder. Baş hafifçe aşağı doğru eğimli şekilde balık yerleştirin. Bu dördüncü solungaç kemer arkasındaki alanda daha iyi erişim sağlar.
- Yavaşça düz standart desen forseps ile kapakçık asansörve operculum'un ve kafa içi arasındaki doku Ekartörleri yerleştirin. Dikkatle kafayla uzaklaştırdı kapakçık tutmak ve maruz solungaçları tutmak için doku Ekartörleri açın.
- Anestezi çözüm Bu işlem sırasında solungaçları sulama emin olun. Retraktör dört solungaç kemer erişim sağlar baş yanında kolları dinlendirin.
- Kafasına dördüncü solungaç kemeri takılması ligaman gerginliği oluşturmak için bunları açmak yavaşça dördüncü solungaç kemer ve başın arkasında arasındaki kavisli standart model forseps yerleştirin ve. Operkuler boşluğuna solungaç kemer dorsal ucunu bağlayan epitel delerek - (3 mm 2) sayılı bir çift ile 5 forseps küçük bir açıklık oluşturmak. Büyük bir kan damarı hasar riski olduğundan çok derin gitmek için dikkatli olun.
- 5 forseps yavaş ve dikkatli bir şekilde sayılı ile yapılan küçük bir pamuk ile IX (glossofarengeal) ve X (vagus) sinirleri açığa kesi genişletin. ÜcretsizYine kan damarları zarar vermemeye özen, No. 5 forseps kullanarak herhangi bir bağ dokusu sinirler.
NOT: akvaryum balığı solungaç IX ve X sinirler dördüncü solungaç kemer arkasında derin dinlenme ve solungaç kemerler besleyen ana kan damarlarının yakınlık vardır. - Sinirler kullanımını tespit edildikten sonra kavisli standart şekil forseps ile açık kesi tutarak kavisli yay makas dikkatle sinirleri kesmek için. Sinirleri kesilmesinin ardından, yavaşça kavisli bir forseps geri. 48 saat - epitel çok ince ve kesi genellikle 24 içinde kendi kapatması nedeniyle dikişlerle kesi kapatmak için gerek yoktur. Doku ekartörünü çıkarın.
- Başın diğer tarafta aynı işlemi tekrarlayın.
- Anestezi balık kurtarmak taze havalandırılmış su anestezik gelen solungaçları sulanması geçin. Bir kez operkuler hareketler en az 24 saat iyileşmek için deneysel tanklara balık taşımak devam var.
3. Saat Diferansiyel Boyama Tekniği: İmmünhistokimya
- (, PBS içinde 96 ml 4 gr PFA PBS) İlk olarak, 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlanması. PFA oda sıcaklığında PBS içinde kolaylıkla çözülmez. Bir su banyosu içinde ısı çözeltisi PFA eritin. Bir çeker ocak içinde, bu gerçekleştirin. PFA çözelti içinde bir kez kullanmadan önce soğumaya bırakın. 2 hafta boyunca 4 ° C'de depolayın.
- 8 sintilasyon şişelerine (solungaç kemeri başına 1 tüp) toplam bir parıldama ampulüne konulması ile% 4 PFA 4 ml - solungaç doku balık ötenazi ve ekstre etmeden önce, 3 yerleştirin. Buna ek olarak, küçük 1x PBS ile tekne tartın ve dolgu almak. Bu kesilmiş sonra doku yıkamak için kullanılır. Buz üzerinde tüm çözümleri tutun.
- Canlı mitokondri zengin boya maruz kalınması sonrasındaDeney benzokain aşırı dozda bir su banyosunda koyarak goldfish euthanize, tamamladı.
- Brankiyal solungaç sepeti her ucunu sever bir baş tarafında ve kavisli makas üzerinde kapakçık kaldırmak için künt forseps kullanın. Dikkatle künt forseps kullanarak diken tarafından solungaçları pick up ve operkuler boşluğunun onları kaldırın. Hemen aşırı Benzocaine ve kan kaldırmak için PBS 1x buz soğuk solungaçları yıkayın.
- % 4 PFA ile doldurulmuş ayrı şişelerde kesilmiş solungaçları (her solungaç kemeri için bir şişe) yerleştirilir ve 4 ° C'de O / N düzeltin.
- Tespit edildikten sonra, 1X PBS içinde fazla PFA yıkama ve 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile bir çalkalama ile% 1 Triton-X 1.5 ml ile doldurulmuş bir 2 mi mermi tüpü içinde doku yerleştirin. Bu adım doku permeabilizes. Bütün solungaç 2 ml tüp içine yerleştirmek için çok büyük ise, filamentler zarar vermemeye tüp alarak dikkat sığacak kadar küçük bölümler halinde doku kesti.
- Mi birincil antikor dilüeXing 1x PBS 992 ul her bir birincil antikor (8 ul toplam) stok çözeltisi 4 ul. NKA (NKA-zengin hücreler etiketler) emin olun ve zn-12 (etiketler nöronlar) birincil antikorlar aynı konakta gündeme gelmiş. Araştırmacılar farklı bir konak türlerinde kaldırdı birincil ve ikincil antikorlar kullanmak zorunda olan aynı zamanda belirli IC alt tipi tanımlamak için karar verirseniz, bu önemlidir.
- Triton-X çözüm çıkarın ve doku eklemek için 1 yıkama olmadan: Bir NKA monoklonal antikor 250 seyreltme (1x PBS içinde sulandırmak) (α-5) NKA zengin hücreler ve Zebra balığı spesifik nöronal antikor tespit etmek için (zn-12) Sinir lifleri (birincil antikor) tespit etmek ve 4 ° C sıcaklıkta, oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile bir çalkalama ile inkübe edilmesi.
- 1x PBS kullanılarak 3 dakika her biri için birincil antikor 3 kez yıkayın. Bunu yapmak için, bir pipet kullanarak dışarı aspirasyon yoluyla tüpten birincil antikor çözüm kaldırmak.
- Bir ikincil antikor hazırlayın1: 1x PBS 995 ul içine stok ikincil antikor 5 ul karıştırarak 200 seyreltme. Ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) uygulanır ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile inkübe edilir.
NOT: MitoTracker Kırmızı bir ~ 594 nm dalga boyunda heyecanlı ve kırmızı floresan olacaktır. Bir ~ 488 nm dalga boyunda heyecan ve yeşil floresant olan bir ikinci antikor, NKA etiket ve zn-12 primer antikor için kullanılabilir olması gerekir. - (Adım 3.7'de tarif edildiği gibi), 5 dakika her biri için dokuya 3 kez yıkanarak fazla ikincil antikoru çıkarın.
4. Görüntüleme
- Yıkandıktan sonra, hücreler ve sinir liflerinin konfokal görüntüleme monte bütün bir içbükey slayt üzerinde doku monte edin. Doku monte etmek için, ilk olarak düz bir mikroskop lamı üzerine 1x PBS bir damla (200 ul) yerleştirin. Bu dokunun kurutulması etmez sağlar.
- Kavisli mikro-makas ile solungaç hemibranchs ayırın. 1x PBS bir damla ve bir konkav slayt içine montaj medya bir damla yerleştirin.
- Yukarı bakacak şekilde filamanın ön kenarı ile içbükey slayt ayrılmış hemibranchs yerleştirin ve bir kapak kayma ile kaplayın. Dolaşırım ve doku yerinden gelen kapak kayma önlemek için tırnak cilası ile kapak kayma kenarlarını hafifçe sürün. Görüntüleme önce 15 dakika - Doku 10 içbükey slayt altına yerleşmek için izin verin.
- Her solungaç kemer için, solungaç kemer başına altı görüntüler üreten, görüntüleme için rastgele altı solungaç filamentleri seçin. 3 mikron optik dilim - 1 alarak görüntüye doku geleneksel konfokal mikroskopi kullanın.
NOT: Herhangi bir önceden varolan hücrelerin MitoTracker Kırmızı ile işaretlenmiş olacak ve NKA için olumlu sadece sarı görünür. Sadece kırmızı görünen hücreler NKA içermeyen önceden varolan IC vardır. Herhangi bir yeni çoğaldı hücre yalnızca NKA için olumlu olacak ve sadece yeşil görünür. Sinir lifleri de yeşil görünecektir.
Ionocyte Niceleme 5. Görüntü Analizi
- EAC içingörüntülü olmuştur h solungaç Filament, Z yığının bölümleri ile kaydırma ve mevcut ve yeni ayırt olsun veya olmasın, önceden var olan ve / veya innerve katmanlı ve filamental IC sayarak IC'leri ve ilgili sinir donanımını ölçmek .
- Filamanın (mm 2) iplik başına veya alan başına IC'leri sayısal olmalıdır. IC ölçüldü hangi filamanın alanı kapsayan filamanın lamellerini anahat görüntüler elde için kullanılan yazılım ile ilişkili çizim araçlarını kullanarak yapın. Çoğu konfokal görüntüleme yazılım programları resmin üzerine özetlenen bölgenin alanını hesaplamak için seçeneğiniz vardır. Eğer bölgeyi kazanmak için bunu yapmak için izin verir görüntüleme yazılımı seçeneği kullanın.
- (Mm 2 başına, örneğin) birim alan başına IC bir ölçü elde etmek için yazılım tarafından hesaplanan alana göre sayılan IC bölün.
Representative Results
Şekil 1 kurmak cerrahi tablosu (Şekil 1A) göstermektedir, ameliyat sırasında balığın yerleştirme (Şekil 1B) ve zaman diferansiyel boyama tekniği (Şekil 1C) için en önemli üç adım. Aşama 1 'de, balık, karanlıkta 25 ° C'de iyi havalandırılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca muhafaza edilir. 30 dakikalık bir süre boyunca, bir araştırmacı Aşama 2 (Şekil 1C) sırasında suya ilave edilir, DMSO içinde mitokondri zengin boya kısım hazırlayabilir. Adım 2 kuluçka dönemi mitokondri zengin hücreler (yani, IC) içine su mitokondri zengin boya alımı için izin verir. Balık sonra ya tam ikili denervasyon yordamı veya balık anestezi olduğu sahte prosedürü ve manipüle opercula tabi ama sinirler sağlam kalır. Adım 3 kurmak ei olan bir balık akan su ile sağlanan bir kurtarma odasını temsilther tam ikili denervasyon veya "sahte" prosedürü geçirmiş.
Kurtarma döneminden sonra, balık ötenazi ve solungaçları kesilmiş ve immünohistokimya için tespit edildi. bir "sahte" prosedürü geçirmiş olan bir balık solungaç lifte IC genel dağılımı ve innervasyon Şekil 2'de tasvir edilmiştir. IC interlameller bölgeleri. Şekil 2A, Şekil tabanında olarak filamental epitel bulunurlar Mitokondri zengin boya ile etiketlenmiş önceden varolan IC (denervasyon / sahte işlemleri yapıldı önce, yani bu IC var). Şekil 2B sinir lifleri önceden varolan ve yeni oluşan IC (NKA immünoreaktivitesinde tarafından tanımlanan) filamental ve innerve gösterir katmanlı epithelia. Son olarak, iki görüntü birleştirme (Şekil 2C) açıkça önceden varolan IC (sarı görünür) ve yeni IC (yeşil görünür) ortaya koymaktadır.Şekil 2D, Şekil 2A-C'de gösterilen filament IC miktar temsil eden bir grafiktir. Bu özel filament üzerinde, önceden varolan IC mm'den 2 başına yeni çoğaldı IC büyük bir sayı olduğu görülmektedir (N = 1). Dışsal brankial innervasyon kaynağını kaldırmak için, IX ve X, kranial sinirler (dışsal innervasyon) kesildi. Şekil 3A solungaç filamentleri sonra operkuler boşluğunun dorsal bölgesini gösterir ve sinirleri kapsayan epithelia IX ve X maruz çıkarıldı iki büyük sinir gövdelerine gelen yayılan (Roma rakamları ile gösterilir) kranial sinirler dört kemerli (Şekil 3A) innerve; solungaç kemerler ilk solungaç kemer seçici denervasyon göstermektedir 4. Şekil 3B-E ile 1 numaralı edilir. İlk solungaç kemer geri kalanı için innervasyon o etkilemeden kaldırılabilir hem IX ve X, kranial sinirler (Şekil 3B) tarafından innerve edilirsolungaç kemerli (Şekil 3C-E) f. Solungaç filamanlara dış innervasyon kademeli kaybı (Şekil 4A-C) Tam karşılıklı denervasyon ile sonuçlanır. Kontrol balık filamanın (Şekil 4A), uzunluğu boyunca devam eden bir belirgin sinir demeti sergiler. Tam karşılıklı denervasyon iyileşme 2 gün (Şekil 4B) sonra dış innervasyon bir kayıp ile sonuçlanmıştır. Dışsal innervasyon daha fazla kaybolma denervasyon (Şekil 4C) kurtarma 5 gün sonra kaydedildi. Kurtarma 5 gün muhtemelen solungaç filamanın içinde hücre organları ile sinir elde sonra IC Herhangi kalan innervasyon (içsel inervasyon; Şekil 4C).
Şekil 1. Deneysel kullanılan adımların denervasyon prosedürü ve dizi için ayarlanmışZaman diferansiyel boyama tekniği. Anestezi ve iyileşme tankları gösteren denervasyon prosedürü için kurulmuş (A) Cerrahi tablo. Bir anestezi, entübe balık yerleştirme (B) Örnek. Zaman diferansiyel boyama tekniğinde kullanılan (C) Anahtar adımlar. Aşama 1 'de, balık, 30 dakika için bir ısı kontrol statik havalandırılmış su banyosu içine yerleştirilir. Mitokondri zengin boya 0.1 uM'lik bir son konsantrasyon elde edilmesi için Adım 2'de ilave edildi ve balık 4 saat en az çözelti içinde banyo bırakılır. Su akış Adım balık solungacında tam ikili denervasyon veya sahte ameliyat ya uğrar bu noktada 3 başlatılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/>
Şekil 2 gün tam ikili denervasyon sonra (25 ° C alıştırıldı) bir akvaryum balığı zaman diferansiyel boyama tekniği temsil 2. Işık mikrografları. (A), önceden var olan ionocytes (IC; oklar) dağılımı. Tek solungaç lifte mitokondri zengin boya boyama ile ortaya (B) IC dağılımı (yeni ve önceden var olan) ve brankiyal sinirlerin (kesikli oklar) sırasıyla, α-5 ve Zn-12 antikorları ile lekeleme ile ortaya çıkar. oklar IC göstermektedir (C) (A) ve (B) üst üste önceden mevcut IC ayırır.; (; oklarla gösterilen yeşil görünür) yeni çoğaldı IC (sarı görünen ok uçları ile gösterilir). Olarak kaydedin (C) innerve önceden var olan ionocyte bir büyütme. (D), panel (AC) 'de gösterilen filament IC kantifikasyon Örnek grafik. Panelinde, N = 1 ölçek çizgisi (C), 50 mm ve tüm paneller için geçerlidir./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Solungaç innervasyon çeşitli aşamalarını gösteren 3. Temsilcisi görüntüleri Şekil. IX ve X, kranial sinirler 4 solungaç kemeri innerve gösteren ağız boşluğuna (A) dorsal görünümü. Gill kemerler 1-4 numaralandırılır. solungaç filamentleri ve sinirler daha iyi innervasyon görselleştirmek için çıkarıldı kapsayan doku. (B) 1. ve 2. solungaç kemerler duyusal organı ortaya çıkarmak için ayrılır ve IX ve X, kranial sinirlerin dalları 1. solungaç innerve kemer. IX ve X, kranial sinirlerin dalları kesilmesinin 1. solungaç kemer seçici denervasyon gösteren görüntülerin (CE) Dizi. Şematik yeniden içinteleost balık solungaç innervasyonunu sunumu, Milsom vd Şekil 1'e bakınız 26 görüntülerde beyaz çizgiler mikroskop ışıkları su yansıması vardır.; herhangi bir morfolojik yapısını tanımlamak gerekmez. Panelinde Ölçek çubuğu (E) 4 mm ve tüm paneller için geçerlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
25 ° C Ionocytes (ok başları ile gösterilir) acclimated bir akvaryum balığı olan 1. solungaç kemer tek bir filamanın üzerinde ionocytes dağılımını ve innervasyonu gösteren Şekil 4. Işık mikrografları belirtilen α-5 antikoru ve sinirler (ile boyandı bY oklar). Zn-12 antikoru ile boyanmış muhtemelen geniş katmanlı dallanma ile IX ve X, sinirler (dıştan innervasyon) gelen, merkezi bir sinir kümesini gösteren bir kontrol balık (A) Gill filaman edildi. Belirtilen ionocytes bazıları da (insert). (B) solungaç filaman 2 gün tam ikili denervasyon sonra innerve edilir. Katmanlı innervasyon 5 gün dışsal innervasyon büyük ölçüde yok olduğunu gösteren tam ikili denervasyon sonrası. (C) solungaç Filament büyük ölçüde sağlam çıktı ise merkezi sinir demetinin bir azalma oldu. Nitel analiz tam ikili denervasyon solungaç filamanın içinde hücre gövdeleri (içsel innervasyon) filamanın boyunca ve lameller içine bir sinir ağı oluşturma ile sinirleri korurken dışsal solungaç innervasyon bozulmasını neden olduğunu göstermektedir. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Zaman diferansiyel boyama tekniği iyon alımı dinamik düzenleme anlamak ve solungaç epitel IC zamansal yeniden dağılımını incelemek için yararlı bir araç olabilir. Basit bir prosedür olmasına rağmen, zaman diferansiyel boyama tekniğinin başarısı için önemlidir kilit noktaları vardır. goldfish protokolünde ayrılan zaman için mitokondri zengin boya maruz gerekir. Daha kısa maruz mitokondri zengin hücreler (yani, ionocytes) ile boyanın zayıf emme ile sonuçlanacaktır. Tespit sırasında, solungaç dokusu hızla eksize edilmeli ve fotoğraf beyazlatma önlemek için karanlıkta tuttu. Doku tespitin 2 hafta içinde görüntüleme için işlenmiş olması gerekir. İkili sinir kesit işlemi sırasında balık iyi anestezi olduğundan emin; sinirler ve kan damarları açıkça belirlenmiştir; Bir kurtarma tankına taşınmadan önce ve balık dolu operkuler işlevini sürdürür.
"> FW ortamı. Pasif iyon kayıpları ve ozmotik su kazancı 14 dengeleme ikili mücadeleden ile balık sunan pasif iyon kayıplarının dengelenmesi filamental ve lameller epitel onlar lokalize olan IC genelinde tuz aktif alımı yoluyla gerçekleşir dış çevre 2,4,8,9,16 ile doğrudan temas. Ancak, solungaç üzerindeki IC yeri statik değildir. Son üç yılda bir dizi çalışma bu birkaç FW balık türleri göstermiştir, karşı karşıya Bir iyonik ve / veya ısı meydan, ince tabakanın 1,2,4,5,17-21 daha uzak bölgelere lamelinin filaman veya bazdan brankiyal ICs dağıtmak. Bu tür bir yeniden dağıtım lamellerinin kalınlığı artırabilen Gaz transferi bozabilir (O 2, CO 2) 22. Araştırmacılar bu yazıda anlatılan zaman diferansiyel boyama tekniği kullandık solungaç epitel boyunca tehcir ve emergenc izlemek içinBu farklı deneysel koşullar (Şekil 1C) 1,4,5 altında solungaç epitel yeni IC e.solungaçları ve muhtemelen brankial IC, IX ve X, kranial sinirler 7,23-25 tarafından innerve edilir. Bu sinirler, sırasıyla, ve solungaç gelen efferent ve afferent girdiler hem de taşırlar. Onlar 4. solungaç kemer arkasında ağız boşluğuna dorsal tarafında yer almaktadır. sinirler ve ikili denervasyon işlemi yapılabilir hangi ile kolaylığı erişilebilirlik türe özeldir. Sinir doku ince bir tabaka altında 4. solungaç kemeri arkasında, tek bir düzlem üzerinde uzanmamaktadır için alabalık, örneğin, kafa sivri ve düzleştirilmiş anatomi sağlar. Bu sinirler görünür ve denervasyon yordamı gerçekleştirmek için araştırmacı kolayca erişilebilir hale getirir. Buna karşılık, akvaryum balığı kısa burun ve yuvarlak kafa var. Japon balıklarının IX ve X kranial sinirler dorsal si derinliklerine yalanFarklı uçakları işgal 4. solungaç kemer sonra kavite de. Bu yönelim sinirlerin erişim kolaylığı sınırlar ve uygun sinirleri belirlemek ve sever bir daha dikkatli bir yaklaşım gerektirir. denervasyon prosedürünün amacı, sırasıyla, ve solungaç duyu afferent ve efferent giriş kaldırmaktır. Solungaç kemeri denervasyonu da radyoizotopların iyon akışı deneyleri (örneğin, 22 Na) ile akuple edilebilir. Bu teknikler solungaç epitel boyunca iyon hareketi sinir giriş katkısını incelemek için tandem kullanılabilir. Denervasyon prosedürü başka sınırlama sinir kesilmesinin böylece zaman, duyusal ve motor nöronlar arasında ayrım bu innervasyon iki tip kaldırılır ediliyor mümkündür paket yetersizlik. Herhangi bir motor nöronları tomar balık solungaç ve operkuler hareketini etkileyebilir. Solungaç denervasyon deneyler yaparken Böylece de sonra havalandırmayı izlemek için önemlidirBalık gazı ve iyon değişimi hem de yeterli solungaç hareketi var olduğundan emin olmak için prosedür kurtarıldı.
karanlık döngüsü ve beslenen ticari gıda pelet: Bu yazının kullanım yetişkin hayvanlarda açıklanan protokoller 12:12 ışık tuttu. Bu yöntemler, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. İlk olarak, mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme süresi, araştırmacının protokol (örneğin, 1, 3, 5, veya 14 gün) gereklerine göre ayarlanabilir. Laboratuvarda mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme uzun süre 14 gün 4,5 olmuştur. Iyileşme 14 gün sonra mitokondri zengin boyanın floresan yoğunluğunda önemli bir azalma oldu. İkincisi, α-5 birincil antikor kullanımı sadece NKA zengin hücrelerin belirlenmesi ve brankial IC farklı alt tipleri arasında ayrım yapmaz sınırlıdır. IC çoğunluğu her iki mitochondr olduğunu Neyse, akvaryum balığı o kurulduiyon zengin (Mitotracker etiket) ve tüm balık türlerinin 4,27 durumda olmayabilir hücreler (α-5 etiket) NKA zengin. Gelecek deneyler kanalları, pompa ve eşanjör (örneğin, NHE, H + pompa) çeşitli karşı özellikle yönlendirilmiş antikorlar kullanarak belirli IC alt tiplerinin zamansal yeniden dağıtılması aşağıdaki odaklanabilirsiniz. Önceki çalışmalar bulduğu mitokondri zengin boya sergi NKA immünoreaktivitesinde 4 ile boyanmış ionocytes çoğunluğu. IC İnnervasyonu zebra balığı türetilmiş nörona özgü antijen (Zn-12) karşı birincil antikor kullanılarak tespit edilebilir. Bu çalışmada,-5 α ve zn-12 birincil antikorlar için aynı ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) ile tespit edilmiştir. Her iki birincil antikorlar bir fare konakta gündeme getirilen ve NKA zengin hücreler ve nöronlar aynı renk floresan bile morfolojik ayırt edilebilir olması ile aşılır Bu sınırlama nedeniyle. Sıralı boyamaFarklı ikincil antikorlarla (Alexa Fluor 488 ile, örneğin, ilk α-5 Alexa Fluor 594 ile-12 zn) da aynı renk floresanlama iki belirteçleri olan sorununu ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Son olarak, tam iki taraflı sinir kesit protokole özgü solungaç kemerler sinirleri hedef modifiye edilebilir. Örneğin, seçici sinir kesit hafifçe solungaç sepeti (Şekil 2B-E) dorsal sonunda birinci solungaç kemer giden sinirleri açığa birinci ve ikinci solungaç kemeri ayırarak birinci solungaç kemer yapılabilir. Zaman diferansiyel tekniği aynı zamanda geliştirmek ve solungaç deriden iyon taşıma geçişler gibi larva Zebra balığı balık ionocytes dağılımını incelemek için uygulanabilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Katoh, F., Kaneko, T. Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique. J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).
- Perry, S. F. Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).
- Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus. J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).
- Mitrovic, D., Perry, S. F. The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus). J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).
- Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).
- Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish. J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).
- Laurent, P., Hebibi, N. Gill morphometry and fish osmoregulation. Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).
- Perry, S. F., Laurent, P. Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell. J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).
- Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).
- Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).
- Krogh, A. The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).
- Nilsson, G. E. Innervation and pharmacology of the gills. Fish Physiology. Randall, D. J., Hoar, W. S. , Academic Press. Orlando, FL. 185-272 (1984).
- Sundin, L., Nilsson, S.
- Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill). Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).
- Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).
- Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer. Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).
- Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus). J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).
- Chou, M. Y., et al. Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses. J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).
- Kaneko, T., Katoh, F. Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference. Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).
- Ouattara, N., et al. Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron. Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).
- Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss. J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).
- Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout. Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate. J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).
- Jonz, M. G., Zaccone, G.
- Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui). J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).
- Hwang, P., Lee, T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).
