This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Branchial ionocytes (IC's) zijn de functionele eenheden voor ionische regelgeving in vis. Bij volwassenen zijn zij op de filamental en lamellaire epitheel van de kieuw waar transport ionen zoals Na +, Cl – en Ca2 + via diverse ionenkanalen, pompen en uitwisselaars. De teleost kieuw wordt extrinsiek geïnnerveerd door de gezichtsuitdrukkingen (VI), glossofaryngeale (IX) en vagus (X) zenuwen. De IX en X zenuwen zijn ook de extrinsieke bron van branchial IC innervatie. Hier, twee technieken gebruikt om de innervatie, proliferatie en distributie van IC's te bestuderen worden beschreven: een tijdverschil kleuringstechniek en een volledige bilaterale kieuw denervatie techniek. Kort goudvis blootgesteld aan een vitale mitochondrion-specifieke kleurstof (bv Mitotracker rood) die etiketten (rode fluorescentie) bestaande IC. Vissen werden ofwel toegestaan om te herstellen voor 3-5 dagen of onmiddellijk onderging een volledige bilaterale kieuw denervatie. Na 3-5 dagen van herstel, de gkwalen worden geoogst en voor immunohistochemie vast. Het weefsel wordt vervolgens gekleurd met α-5 primaire antilichaam (doelwitten Na + / K + ATPase bevattende cellen) in combinatie met een secundair antilichaam dat alle (nieuwe en bestaande) IC groene etiketten. Met behulp van confocale beeldvorming werd aangetoond die bestaande IC's lijken geel (gemerkt met zowel een levensvatbare mitochondrion-specifieke kleurstof en α-5) en nieuwe ICs kleur groen (gelabeld met slechts α-5). Beide technieken gebruikt in combinatie kunnen worden toegepast op de innervatie, proliferatie en verspreiding van ICs bestuderen op kieuw filament bij vissen worden blootgesteld aan milieuproblemen.
IC's zijn de functionele eenheid voor ionische regelgeving in vis en zijn te vinden op de epitheliale oppervlakken van de kieuw filamenten en lamellen 4,6-8,10. Hoewel verschillende subtypen zijn beschreven die unieke eigenschappen bezitten veel van de IC worden gekenmerkt door een hoge dichtheid van mitochondria (dus ze zijn ook bekend als mitochondrion-rijke cellen) en / of overvloed van het enzym Na + / K + ATPase (NKA). Typisch deze IC huis diverse andere pompen, ionenkanalen en uitwisselaars betrokken ionenregulatie (bijvoorbeeld Na + / H + exchanger, Na + / Cl- – co-transporter, H + pomp) 2,10,11. De herverdeling en de proliferatie van IC's als een compensatiemechanisme is centraal voor het behoud ion homeostase in het bijzonder tijdens ionische stress (bv, blootstelling aan ion-arme water) 4,8,9.
Deze studie beschrijft een tijd differentiële kleuring Technique 1 tot nieuw proliferated ionocytes (IC's) in de kieuwen van vissen te identificeren. Deze techniek gaat gepaard met een volledige bilaterale denervatie van de kieuw bogen. Goldfish (Carassius auratus), de in deze studies gebruikte soorten is geschikt om proliferatie van gill epitheelcellen bestuderen omdat ze een opmerkelijk vermogen om structureel verbouwen hun kieuwen 2. Gill remodeling betrekking op de groei of terugtrekken van een interlamellaire celmassa (ILCM) wanneer de vis (gewoonlijk gehandhaafd op 15-30 ° C) worden geacclimatiseerd aan koud water (<15 ° C) of hypoxie, respectievelijk 3. Eerdere studies met het tijdsverschil stainstechniek op goudvis zijn gericht op de herverdeling innervatie en proliferatie van ICs op de kieuwen in de context van kieuw remodeling 4,5. Katoh en Kaneko 1 ontwikkelde deze nieuwe techniek om de transformatie en de vervanging van branchial IC's in killivissen studeren (Fundulus heteroclitus) transferred uit zeewater (SW) naar zoet water (FW). In dit onderzoek ligt de focus op de proliferatie en innervatie van IC's in goudvis gewend tot 25 ° C.
De tijdsverschil kleuring techniek werd aangetoond dat, in de context van kieuw remodeling, goudvis handhaven van een constant aantal ICs in hypoxische blootstelling en daaropvolgende normoxische herstel echter het percentage geïnnerveerde cellen daalde gedurende de normoxische herstelperiode 5. Het werd meer dan 70 jaar geleden dat de ionische opname mechanismen in vis zijn voorgesteld in het kader neurale controle 12. De teleost kieuw geïnnerveerd door het gezicht (VII), glossofarynx (IX) en vagus (X) zenuwen ook wel de "branchial zenuwen" 13,14. Studies door Jonz en Nurse (2003) over de zebravis (Danio rerio) Gill innervatie bleek dat de oorsprong van de innervatie is extrinsieke (cellichaam van zenuwvezel wordt extrinsieke aan de kieuw) als intrinsieke (cellichaam vanzenuwvezel is inherent aan de kieuw). Dezelfde auteurs toonden ook aan dat branchial ICs extrinsiek worden geïnnerveerd 7.
In deze studie, de tijd differentiële kleuring techniek in combinatie met volledige bilaterale kieuw denervatie werd gebruikt om de proliferatie van IC's ontbreekt extrinsieke innervatie bij goudvissen te onderzoeken. Volledige bilaterale gill denervatie betreft doorsnijden craniale zenuwen IX en X. Deze twee benaderingen zijn haalbaar goudvissen vanwege hun relatief grote afmetingen (30-200 g) vereenvoudigt het delicate chirurgische procedures en ionocytes worden gemakkelijk geïdentificeerd middels standaard immuno-histochemische technieken. In de onderhavige studie werden ICs gevisualiseerd met een vitale mitochondrion-specifieke kleurstof (bv Mitotracker rood) of een primair antilichaam tegen het α-subeenheid van de Na + / K + -ATPase (α-5; Developmental Studies Hybridoma Bank, University van Iowa, Iowa City IA). Dit protocol voorziet in een eenvoudige method van het visualiseren en analyseren van de herverdeling en de proliferatie van IC's op de kieuw.
De tijd differentiële kleuring techniek kan een nuttig instrument zijn om de dynamische regulering van ion opname te begrijpen en om de tijdelijke herverdeling van IC's te onderzoeken in de kieuw epitheel zijn. Hoewel een eenvoudige procedure, zijn er een aantal belangrijke punten die cruciaal voor het succes van het tijdsverschil stainstechniek zijn. De goudvis wordt blootgesteld aan de mitochondrion-rijke kleurstof voor de toegewezen tijd in het protocol. Kortere belichtingen leiden tot een slechte opname van de kleurstof door de mitochondrion-rijke cellen (dwz ionocytes). Tijdens fixatie, moet de kieuwweefsel snel worden uitgesneden en in het donker bewaard om foto bleken te voorkomen. Het weefsel moet binnen 2 weken na fixatie worden verwerkt voor beeldvorming. Tijdens de bilaterale zenuw snijden procedure ervoor te zorgen dat de vis is goed verdoofde; de zenuwen en bloedvaten zijn duidelijk herkenbaar; en de vis hervat volledige opercular functie voordat het naar een vuilwatertank wordt verplaatst.
"> De FW omgeving presenteert vis met de dubbele uitdaging van het balanceren van passieve ion verliezen en osmosewater winst 14. De afweging van passieve ion verliezen gebeurt via de actieve opname van zout aan de overkant van de IC's die zijn gelokaliseerd aan de filamental en gelamelleerde epitheel waar ze kunnen maakt direct contact met de externe omgeving 2,4,8,9,16. De locatie van de ICs op de kieuw is niet statisch. De laatste drie decennia een aantal studies hebben aangetoond dat verschillende FW vissoorten, wanneer geconfronteerd met een ionische en / of temperatuur uitdaging herverdelen branchial ICs uit de filament of onderkant van de lamel om de meer distale gebieden van de lamel 1,2,4,5,17-21. Deze verdeling kan de dikte van de lamellen verhogen die kan gasoverdracht compromitteren (O 2, CO 2) over de kieuw epitheel 22. Onderzoekers van de tijd differentiële kleuringstechniek in dit manuscript beschreven hebben gebruikt om de verhuizing en emergenc volgene van de nieuwe IC's op de kieuw epitheel onder deze verschillende experimentele omstandigheden (figuur 1C) 1,4,5.De kieuwen, en vermoedelijk de branchial IC's, worden geïnnerveerd door de IX en X hersenzenuwen 7,23-25. Deze zenuwen dragen zowel efferente en afferente input naar en van de kieuw, respectievelijk. Ze bevinden zich aan de dorsale zijde van de mondholte achter de 4 e kieuwboogslagader. De toegankelijkheid van de zenuwen en het gemak waarmee de bilaterale denervatie procedure kan worden uitgevoerd is soortspecifiek. In forel bijvoorbeeld de puntige afgevlakt anatomie van de kop maakt de zenuwen in een enkel vlak achter de 4e kieuwboogslagader liggen onder een dunne laag weefsel. Dit maakt de zenuwen zichtbaar en gemakkelijk toegankelijk is voor de onderzoeker aan de denervatie procedure uit te voeren. In tegenstelling, goudvis hebben een kortere snuit en een rondere kop. De IX en X hersenzenuwen van goudvissen liggen dieper in de dorsale side van de holte na de 4 e kieuwboogslagader bezetten verschillende vlakken. Deze oriëntatie beperkt de gemakkelijke toegang tot de zenuwen en vereist een meer zorgvuldige benadering van de juiste zenuwen te identificeren en te verbreken. Doel van de denervatie procedure sensorische afferente en efferente ingang verwijderen en naar de kieuw, respectievelijk. Denervatie van de kieuw bogen ook worden gekoppeld aan ion flux experimenten met radioactieve isotopen (bijvoorbeeld 22 Na). Deze technieken kunnen worden gebruikt in combinatie met de bijdrage van nerveuze ingang op ion-beweging over de kieuw epitheel bestuderen. Een andere beperking op de denervatie procedure is het onvermogen om onderscheid te maken tussen sensorische en motorische neuronen, waardoor bij het doorsnijden de zenuwbaan is het mogelijk dat beide soorten innervatie worden verwijderd. Doorsnijden van elke motorische neuronen kan de kieuw en opercular beweging van de vis beïnvloeden. Dus bij het uitvoeren gill denervatie experimenten is het belangrijk ook ventilatie na bewakenvis heeft zich hersteld van de procedure om ervoor te zorgen dat er voldoende kieuw beweging voor gas en ionenwisseling.
De in dit manuscript gebruik volwassen dieren beschreven protocollen gehouden op een 00:12 licht: donker cyclus en gevoed commerciële voedsel pellets. Deze methoden kunnen worden gemodificeerd op verschillende manieren. Ten eerste kan de herstelperiode na mitochondrion-rijke kleurstof blootstelling worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker protocol (bijvoorbeeld 1, 3, 5, of 14 dagen). De langste periode van herstel na mitochondrion-rijke kleurstof blootstelling in het lab heeft 14 dagen 4,5 geweest. Er was geen significante vermindering van de intensiteit van de fluorescentie van de mitochondrion-rijke kleurstof na 14 dagen van herstel. Ten tweede is het gebruik van de α-5 primaire antilichaam beperkt tot identificatie NKA-rijke cellen en maakt geen onderscheid tussen de verschillende subtypes van branchial ICs. Gelukkig is in goudvis werd vastgesteld dat de meerderheid van de IC's zijn zowel mitochondrion-rijk (label met Mitotracker) en NKA-rijk (label met α-5) cellen die niet het geval in alle vissoorten 4,27 zijn. Toekomstige experimenten kunnen richten op na de tijdelijke herverdeling specifieke IC subtypen met behulp van antilichamen specifiek tegen verschillende kanalen, pompen en uitwisselaars (bijv NHE, H + pomp) aangegeven. Eerdere studies bleek dat de meerderheid van de ionocytes gekleurd met mitochondrion-rijke kleurstof tentoonstelling NKA immunologische 4. Innervatie van de IC kan worden opgespoord door middel van een primair antilichaam tegen zebravis afgeleide neuron-specifiek antigeen (Zn-12). In deze studie, α-5 en zn-12 primaire antilichamen werden gedetecteerd met dezelfde secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488) voor beide. Deze beperking komt zowel primaire antilichamen worden opgewekt in een muis gastheer en wordt overwonnen door het feit dat de NKA-rijke cellen en neuronen morfologisch te onderscheiden hoewel ze fluoresceren dezelfde kleur. Sequentiële vlekkenmet verschillende secundaire antilichamen (bijv eerste α-5 met Alexa Fluor 488 dan zn-12 met Alexa Fluor 594) kan ook worden gebruikt om het probleem van beide markers fluorescerende dezelfde kleur elimineren. Ten slotte kan de volledige bilaterale zenuw snijden protocol worden aangepast aan de zenuwen aan specifieke kieuwbogen richten. Bijvoorbeeld, kan selectieve zenuw snijbeweging worden uitgevoerd op de eerste kieuwboogslagader door voorzichtig scheiden van de eerste en tweede kieuwbogen de zenuwen naar de eerste kieuwboogslagader aan de dorsale einde van de kieuw mand (Figuur 2B-E) blootstellen. Het tijdverschil techniek kan ook worden toegepast om de verdeling van ionocytes in larvale zebravis vis bestuderen in hun ontwikkeling en ionentransport overgangen van de huid naar de kieuw.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |