Una técnica de tinción diferencial Tiempo Junto con Full Bilateral Gill Desnervación para estudiar Ionocytes en Fish

Abstract

Ionocytes branquiales (CI) son las unidades funcionales para la regulación iónica en el pescado. En los adultos, se encuentran en la filamentoso y epitelios lamelar de las branquias donde ellos iones de transporte tales como Na ^+, Cl ^- y Ca ²⁺ a través de una variedad de canales de iones, bombas e intercambiadores. El Gill teleósteos se extrínsecamente inervado por el facial (VI), glosofaríngeo (IX) y vago (X) de los nervios. Los nervios IX y X son también la fuente extrínseca de branquial inervación IC. Aquí, dos técnicas utilizadas para el estudio de la inervación, la proliferación y la distribución de los circuitos integrados se describen: una técnica de tinción diferencial de tiempo y una técnica bilateral completa denervación Gill. En pocas palabras, peces de colores están expuestos a un colorante específico mitocondria vital (por ejemplo, MitoTracker rojo) que etiqueta (fluorescencia roja) ICs preexistentes. Los peces se les permite ya sea para recuperar a 3 - 5 días o inmediatamente se sometieron a una denervación enmalle bilateral completa. Después de 3 - 5 días de recuperación, el gmales se cosechan y se fijaron para inmunohistoquímica. El tejido se tiñe entonces con un anticuerpo primario α-5 (objetivos de Na ⁺ / K ⁺ ATPasa que contiene células) en conjunción con un anticuerpo secundario que las etiquetas de todos (tanto nuevos como pre-existente) ICs verde. Utilizando imágenes confocal, se demostró que los CI pre-existentes aparecen de color amarillo (marcado con tanto un colorante-mitocondria específica viable y α-5) y las nuevas ICs aparecen verde (marcada con α-5 solamente). Ambas técnicas utilizadas en tandem se pueden aplicar para estudiar la inervación, la proliferación y la distribución de circuitos integrados en el filamento branquial cuando los peces están expuestos a los retos medioambientales.

Introduction

ICs son la unidad funcional para la regulación iónica en el pescado y se encuentran en las superficies epiteliales de los filamentos branquiales y laminillas ^4,6-8,10. Aunque una variedad de subtipos se han descrito que poseen características únicas, muchos de los circuitos integrados se caracterizan por una alta densidad de mitocondrias (por lo tanto también se conocen como células mitocondria ricos) y / o una abundancia de la enzima Na ⁺ / K ⁺ ATPasa (NKA). Normalmente, estos ICs casa una variedad de otras bombas, canales de iones y los intercambiadores de iones implicados en la regulación (por ejemplo, Na ⁺ / H ⁺ intercambiador, Na ⁺ / Cl ^- co-transportador, H ⁺ bomba) ^2,10,11. La redistribución y la proliferación de los circuitos integrados como un mecanismo de compensación es fundamental para mantener la homeostasis de iones especialmente durante el estrés iónico (por ejemplo, la exposición al agua de iones de pobres) ^4,8,9.

Este estudio describe un tiempo técni tinción diferencialQue ¹ para identificar ionocytes recién proliferado (CI) en branquias de los peces. Esta técnica se acopla con una denervación bilateral completa de los arcos branquiales. Goldfish (Carassius auratus), las especies utilizadas en estos estudios, es muy adecuado para estudiar la proliferación de las células epiteliales de enmalle, ya que tienen una notable capacidad para remodelar estructuralmente sus branquias ^2. Gill remodelación se refiere al crecimiento o la retracción de una masa celular interlaminar (ILCM) cuando el pescado (normalmente mantenida a 15 - 30 ° C) se aclimataron a agua fría (<15 ° C) o hipoxia, respectivamente ^3. Estudios anteriores utilizando la técnica de tinción diferencial de tiempo en peces de colores se han centrado en la redistribución, inervación y la proliferación de ICS en las branquias en el contexto de Gill remodelación ^4,5. Katoh y Kaneko ¹ desarrollaron esta nueva técnica para estudiar la transformación y sustitución de ICs branquiales en killifish (heteroclitus Fundulus) transferred del agua de mar (SW) para agua dulce (FW). En este estudio, la atención se centra en la proliferación y la inervación de los circuitos integrados en peces de colores aclimatados a 25 ° C.

Usando la técnica de tinción diferencial de tiempo se demostró que, en el contexto de la remodelación Gill, goldfish mantener un número constante de ICs durante la exposición hipóxica y la recuperación posterior de normoxia, sin embargo, el porcentaje de células inervadas disminuyó durante todo el período de recuperación de normoxia ^5. Se propuso hace más de 70 años que los mecanismos de captación iónicos en los peces están bajo control neural ^12. La papada teleósteos está inervado por las facial (VII), glosofaríngeo (IX) y vago (X) nervios también conocidos como los "nervios" branquiales ^13,14. Los estudios realizados por Jonz y Nurse (2003) en el pez cebra (Danio rerio) inervación Gill mostraron que el origen de la inervación es extrínseca (cuerpo celular de la fibra nerviosa es extrínseca a las branquias), así como intrínseca (cuerpo celular defibra nerviosa es intrínseco a las branquias). Los mismos autores también demostraron que los CI branquiales son extrínsecamente inervados ^7.

En este estudio, se utilizó la técnica de tinción diferencial de tiempo junto con plena denervación bilateral Gill para investigar la proliferación de ICs que carecen de inervación extrínseca en peces de colores. Gill completa denervación bilateral se refiere a la ruptura de los nervios craneales IX y X. Estos dos enfoques son factibles en peces de colores debido a su tamaño relativamente grande (30 a 200 g) simplifica los procedimientos quirúrgicos delicados, y ionocytes se identifican fácilmente utilizando técnicas de inmuno-histoquímica estándar. En el presente estudio, los CI se visualizaron utilizando un colorante vital-mitocondria específico (por ejemplo, MitoTracker Roja) o un anticuerpo primario contra la α-subunidad de la Na ⁺ / K ⁺ -ATPasa (α-5; Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma, Universidad de Iowa, Iowa City IA). Este protocolo proporciona un metho directod de visualizar y analizar la redistribución y la proliferación de circuitos integrados en la papada pescados.

Protocol

Ambos protocolos se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCPA) y se llevaron a cabo con la aprobación de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Ottawa (Protocolo BL-226).

Técnica 1. Tiempo diferencial de tinción: Mitocondria rico tinte Bath

1. Preparar solución madre 1 mM MitoTracker Red disolviendo 50 g en 94,0 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO al 100%). Mantenga solución madre en la oscuridad a -20 ° C cuando no esté en uso. Evite los ciclos de congelación / descongelación.
2. Preparar cajas oscuras (3-6 cajas) con un volumen máximo de 600 ml. Llene las cajas con 400 ml de agua del sistema (agua el pescado normalmente se celebran en) y colocar un difusor de aire en cada caja para proporcionar una fuente de O _2. Obtener peces de colores (30 - 40 g) y colocarlos en las cajas con 400 ml de agua y un difusor de aire. Después de 30 min, añadir el colorante mitocondria ricos viable para producir concentraciones finales de 0,1 M y 0,01% de DMSO. Lavar el pescado durante 4 hr.
   1. Si estos son peces de control (es decir, sin denervación), encienda el flujo de agua a las cajas, permita que el medio de contraste para enjuagar ya recuperar los peces durante el periodo de tiempo establecido en el protocolo. Los peces son normalmente recuperados para 3-5 días.
3. Después de que el período de recuperación proceda a la Sección 3: Tiempo diferencial Técnica de maquillaje: La inmunohistoquímica. Si estos peces deben ser denervado proceda a la Sección 2: Completo Procedimiento denervación bilateral.

2. Procedimiento denervación bilateral completa

1. Obtener 1 par de tijeras de estudiantes Vannas primavera (curvas), 1 par de pinzas-rectas patrón estándar, 1 par de fórceps curvas patrón estándar, 2 pares de No. 5 fórceps, 1 par de retractores de tejidos, bolas pequeñas de algodón (1 - 2 mm de diámetro), y los hisopos de algodón (Q Consejos o equivalentes).
2. Preparar el baño de agua anestésico. En primer lugar, se disuelven 10 g de benzocaína a un volumen final de 100 mlde 99% de etanol para preparar una solución madre. Para preparar el baño de agua anestésico, se disuelven 15 ml de la solución madre benzocaína en 30 L de agua del sistema aireado a la temperatura requerida. Airear el agua mediante la colocación de una piedra de aire conectado a una bomba de aire o una línea central de aire en el tanque de agua.
   1. Coloque el pescado en el baño de agua anestésico (Figura 1).
   2. Una vez que ha cesado la respiración, coloque el pescado en una mesa de cirugía y intubar como se muestra en la Figura 1B. Para ello, la inserción de un tubo en su cavidad bucal para el riego de las branquias con solución anestésica aireado. El riego de las branquias asegura que el pescado se suministra con una cantidad suficiente de O ₂ y el anestésico durante el procedimiento de denervación. Coloque el pescado de modo que la cabeza se inclina ligeramente hacia abajo. Esto permite un mejor acceso a la zona detrás del cuarto arco branquial.
3. Levante con cuidado el opérculo con las pinzas de patrones estándar rectasy colocar los retractores de tejido entre el opérculo y el interior de la cabeza. Abra cuidadosamente los retractores de tejido para mantener el opérculo lejos de la cabeza y mantener las branquias expuestas.
4. Asegúrese de que la solución anestésica se regando las branquias durante este procedimiento. Descansa el retractor maneja al lado de la cabeza, que proporciona acceso a los cuatro arcos branquiales.
5. Colocar las pinzas curvas patrón estándar entre el cuarto arco branquial y la parte posterior de la cabeza y suavemente abrirlos para crear tensión en el ligamento de fijar el cuarto arco branquial a la cabeza. Con un par de fórceps No. 5 crean una pequeña abertura (2-3 mm) por la perforación del epitelio que conecta el extremo dorsal de los arcos branquiales a la cavidad opercular. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo, porque se corre el riesgo de dañar un vaso sanguíneo principal.
6. Con una pequeña bola de algodón celebrada con el número 5 fórceps lenta y cuidadosamente expandir la incisión para exponer el IX (glosofaríngeo) y X (vago) nervios. Libertad para losnervios de cualquier tejido conectivo mediante el No. 5 fórceps, de nuevo con cuidado de no dañar los vasos sanguíneos.
   NOTA: El IX y X branquial nervios de los peces de colores descanso profundo detrás del cuarto arco branquial y están en proximidad a los principales vasos sanguíneos que alimentan a los arcos branquiales.
7. Una vez que los nervios se han identificado el uso de las tijeras de primavera curvas para cortar cuidadosamente los nervios, mientras que la celebración de la incisión abierta con las pinzas de la forma estándar de curvas. Después de cortar los nervios, retraiga suavemente las pinzas curvas. No hay necesidad de cerrar la incisión con puntos de sutura debido a que el epitelio es muy delgada y la incisión se cierra generalmente en solitario dentro de 24 a 48 h. Eliminar retractor de tejido.
8. Repetir el mismo procedimiento en el otro lado de la cabeza.
9. Cambie el riego de las branquias de anestésico para agua gaseosa fresca para recuperar los peces de la anestesia. Una vez que los movimientos operculares han reanudado mover los peces en tanques experimentales de recuperar por lo menos durante 24 horas.

3. Tiempo diferencial Técnica de maquillaje: La inmunohistoquímica

1. En primer lugar, preparar 4% de paraformaldehído (PFA) en 1x tampón fosfato salino (PBS; 4 g PFA en 96 ml de PBS). PFA no se disuelve fácilmente en PBS a RT. Solución de calor en un baño de agua para disolver PFA. Realice esto en una campana de humos. Una vez PFA está en solución dejar enfriar antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
2. Antes de la eutanasia de los peces y la extracción del tejido branquial, coloque 3 - 4 ml de PFA al 4% en un vial de centelleo para un total de 8 viales de centelleo (1 vial por arco branquial). Además, tomar un pequeño barco pesa y lo rellenamos con 1x PBS. Esto se utiliza para lavar el tejido después de que ha sido extirpado. Mantenga todas las soluciones en hielo.
3. Después de la exposición viable colorante mitocondria ricosexperimento ha terminado, la eutanasia los peces de colores, colocándolo en un baño de agua con una sobredosis de la benzocaína.
4. El uso de fórceps romos para levantar el opérculo en un lado de la cabeza y tijeras curvas para cortar cada extremo de la cesta Gill branquial. Recoja cuidadosamente las branquias de los rastrillos utilizando fórceps romos y sacarlos de la cavidad opercular. Lave inmediatamente las branquias en el hielo frío 1x PBS para eliminar el exceso de benzocaína y la sangre.
5. Coloque las branquias extirpadas, en viales separados (un vial para cada arco branquial) llenos de PFA al 4% y fijar O / N a 4 ° C.
6. Después de la fijación, se lava el exceso de PFA en 1X PBS y colocar el tejido en un tubo bullet 2 ml lleno con 1,5 ml de 1% de Triton-X en un agitador durante 6 h a RT o O / N a 4 ° C. Este paso permeabiliza el tejido. Si toda la papada es demasiado grande como para colocar en un tubo de 2 ml a continuación, cortar el tejido en secciones lo suficientemente pequeños para encajar el tubo con cuidado de no dañar los filamentos.
   1. Preparar las diluciones de anticuerpos primarios por mixing 4 l de la solución madre de cada anticuerpo primario (un total de 8 l) en 992 l de PBS 1x. Asegúrese de que la NKA (etiquetas de células NKA-ricos) y Zn-12 (etiquetas neuronas) anticuerpos primarios se han planteado en el mismo host. Esto es importante si los investigadores deciden identificar subtipos específicos de CI al mismo tiempo por el que tendrán que utilizar anticuerpos primarios y secundarios se plantean en una especie huésped diferentes.
   2. Eliminar la solución de Triton-X y sin lavar el tejido poner una dilución 1: 250 (diluido en PBS 1x) de un anticuerpo monoclonal NKA (α-5) para detectar las células NKA-ricos y un anticuerpo específico neuronal pez cebra (Zn-12) para detectar las fibras nerviosas (anticuerpos primarios) y se incuba en un agitador durante 6 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
7. Lave el anticuerpo primario 3 veces durante 3 minutos cada uno utilizando 1x PBS. Para ello, retire la solución de anticuerpo primario del tubo de aspiración a cabo utilizando una pipeta.
8. Preparar el anticuerpo secundario a una1: 200 dilución mediante la mezcla de 5 l de anticuerpo secundario de stock en 995 l de PBS 1x. Aplicar el anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488) e incubar durante 6 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C en un agitador.
   NOTA: MitoTracker Roja se excita a un ~ 594 nm de longitud de onda y será fluorescente roja. Un anticuerpo secundario que se excita a una ~ 488 nm de longitud de onda y emite fluorescencia verde debe ser utilizada para etiquetar NKA y Zn-12 anticuerpos primarios.
9. Eliminar el exceso de anticuerpo secundario lavando el tejido 3 veces durante 5 minutos cada uno (como se describe en el paso 3.7).

4. Imaging

1. Después de los lavados, monte el tejido en un portaobjetos cóncavo para toda montar imagen confocal de células y fibras nerviosas. Para montar el tejido, primero colóquelo en una gota (200 l) de 1x PBS en un portaobjetos de microscopio plana. Esto asegura que el tejido no deseque.
2. Separe las hemibranquias enmalle con las curvas micro-tijeras. Colocar una gota de PBS 1x y una gota de medio de montaje en una diapositiva cóncava.
3. Coloca los hemibranquias separados en la diapositiva cóncava con el borde delantero del filamento hacia arriba y cubrir con un cubreobjetos. Dab los bordes de la hoja de la cubierta con esmalte de uñas con el fin de evitar que la hoja de la cubierta se mueva alrededor y desplazando el tejido. Permitir que el tejido se asiente a la parte inferior de la corredera cóncava para de 10 - 15 min antes de formación de imágenes.
4. Para cada arco branquial, seleccionar seis filamentos branquiales al azar para la imagen, produciendo seis imágenes por arco branquial. Uso de la microscopia confocal convencional a la imagen del tejido mediante la adopción de 1 - 3 micras rodajas ópticos.
   NOTA: Cualquier células preexistentes será etiquetado con MitoTracker Roja y positivo para NKA aparecerá amarilla solamente. Las células que aparecen de color rojo sólo son ICs preexistentes que no contienen NKA. Cualquier célula recién proliferado sólo será positivo para NKA y aparecerá verde solamente. Las fibras nerviosas también aparecerán de color verde.

5. Análisis de Imágenes para Ionocyte Cuantificación

1. Para each filamento branquial que ha sido fotografiado, cuantificar los circuitos integrados y la inervación asociado desplazándose a través de las secciones de la pila Z y contando el número de lamelares y filamentoso ICs presente y si son o no son de nueva diferenciados, preexistente y / o inervado .
2. Cuantificar los ICs por filamento o por zona (mm ²⁾ de filamento. Para ello debe utilizar las herramientas de dibujo asociados con el software utilizado para adquirir las imágenes para delinear las láminas del filamento que abarca la zona del filamento en la que se cuantificaron los ICs. La mayoría de los programas de software de imagen confocal tienen la opción de calcular el área de una región se indica en la imagen. Utilice la opción en el software de imágenes que te permite hacer esto para adquirir la zona.
3. Divida a los ICs contadas por el área calculada por el software para obtener una medida de ICs por unidad de área (por ejemplo, por ² mm).

Representative Results

La Figura 1 ilustra la mesa de cirugía configurar (Figura 1A), la colocación de los peces durante la cirugía (Figura 1B) y los tres pasos más importantes para la técnica de tinción diferencial de tiempo (Figura 1C). En el paso 1, el pescado se mantiene durante 30 min en un baño de agua bien aireado a 25 ° C en la oscuridad. Durante el período de 30 min, el investigador puede preparar el colorante alícuota mitocondria-rico en DMSO que se añade al agua durante el Paso 2 (Figura 1C). El período de incubación en el paso 2 permite la captación del colorante mitocondria ricos del agua en las células mitocondria rica (es decir, CI). El pescado puede entonces someterse al procedimiento completo bilateral denervación o un procedimiento simulado en el que se anestesió a los peces y los opérculos manipulado pero los nervios permanecer intacto. La configuración en el paso 3 representa una cámara de recuperación previsto con agua corriente durante un pez que tiene eiTher sido sometidos a denervación bilateral completo o un procedimiento de "farsa".

Después de que el período de recuperación, los peces se sacrificó y las branquias se escindieron y se fija para inmunohistoquímica. La distribución global y la inervación de los circuitos integrados en el filamento branquial de un pez que se habían sometido a un procedimiento de "falsa" se representa en la Figura 2. Los circuitos integrados están presentes en los epitelios filamentoso, así como en la base de las regiones interlaminares. Muestra la Figura 2A ICs preexistentes marcados con colorante mitocondria rica (es decir, estos circuitos integrados existían antes de que se realizaron los procedimientos de denervación / sham). La Figura 2B muestra fibras nerviosas que inervan los ICs pre-existentes y recién formados (identificado por NKA) inmunoreactividad de la filamentoso y epitelios lamelar. Por último, la fusión de las dos imágenes (Figura 2C) revela claramente los ICs preexistentes (aparecerá amarillo) y los nuevos circuitos integrados (aparece en verde).La Figura 2D es un gráfico representativo de IC cuantificación para el filamento se muestra en la Figura 2A-C. En este filamento específica, parece que hay un mayor número de ICs recién proliferado por mm ² de ICs preexistentes (N = 1). Para eliminar la fuente de la inervación extrínseca branquial, se cortaron los nervios craneales IX y X (inervación extrínseca). La Figura 3A muestra la región dorsal de la cavidad opercular después de los filamentos de las agallas y los epitelios que cubren los nervios fueron removidos para exponer la IX y X nervios craneales (indicados con números romanos) que se extienden a partir de dos grandes troncos nerviosos para inervar los cuatro arcos (figura 3A); los arcos branquiales están numeradas del 1 al 4. La figura 3B-E ilustrar denervación selectiva del primer arco branquial. El primer arco branquial está inervado por tanto los nervios craneales IX y X (Figura 3B) que se pueden eliminar sin afectar la inervación al resto of los arcos branquiales (Figura 3C-E). Los resultados completos de denervación bilaterales en la pérdida gradual de la inervación extrínseca a los filamentos branquiales (Figuras 4A-C). Peces de control presentan un conjunto de nervios obvio que se extiende por la longitud del filamento (Figura 4A). Denervación bilateral completa resultó en una pérdida de la inervación extrínseca después de 2 días de recuperación (Figura 4B). Además desaparición de la inervación extrínseca se observó después de 5 días de recuperación de la denervación (Figura 4C). Cualquier inervación restante para ICs después de 5 días de recuperación presumiblemente se deriva de los nervios con cuerpos celulares dentro del filamento branquial (inervación intrínseca; Figura 4C).

Figura 1. Experimental establecido para el procedimiento de denervación y secuencia de pasos utilizados en latécnica de tinción diferencial de tiempo. (A) Tabla de Cirugía establecido para el procedimiento de denervación mostrando los tanques de anestesia y recuperación. (B) Ejemplo de la colocación de un pescado intubado anestesiado. (C) Los pasos clave utilizados en la técnica de tinción diferencial de tiempo. En el paso 1, el pescado se coloca en un controlado, estática baño de agua aireado temperatura durante 30 min. El colorante mitocondria ricos se añade en el Paso 2 a una concentración final de 0,1 mM y se permite que el pescado para bañarse en la solución durante un mínimo de 4 horas. El flujo de agua se reinicia en el paso 3 en ese momento el pescado sufre ya sea una denervación bilateral completa de la papada o una cirugía simulada. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Micrografías de luz que representan la técnica de tiempo de tinción diferencial de un pez de colores (aclimatados a 25 ° C) 2 días después de la denervación bilateral completa. (A) La distribución de ionocytes preexistentes (ICs; flechas). En un solo filamento branquial es revelado por tinción tinte mitocondria ricos (B) La distribución de los circuitos integrados (nuevos y preexistentes) y branquiales nervios (flechas discontinuas) es revelado por tinción con los anticuerpos α-5 y Zn-12, respectivamente. Las flechas indican ICs (C) La superposición de (A) y (B) distingue ICs pre-existentes. (Aparecerá amarilla; indicadas por puntas de flecha) de la ICS recién proliferado (aparecen de color verde; indicadas por flechas). Insertar en (C) es una ampliación de un pre-existente ionocyte inervado. (D) gráfico representativo de la cuantificación IC para el filamento se muestra en los paneles (AC). N bar = 1. Escala en el panel (C) es de 50 micras y se aplica a todos los paneles./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Imágenes representativas que muestran diversas etapas de la inervación Gill. Vista (A) dorsal de la cavidad bucal que muestra los nervios craneales IX y X inervan los 4 enmalle arcos. Arcos branquiales están numerados 1-4. Los filamentos de las agallas y el tejido que cubre los nervios fueron removidos para visualizar mejor la inervación. (B) El 1 ° ^y 2 arcos branquiales ^nd se separan para revelar el órgano sensorial y las ramas de los nervios craneales IX y X inervan el 1 ^de enmalle arco. (CE) Secuencia de imágenes que muestran la denervación selectiva ^de la 1ª enmalle arco cortando las ramas de los nervios craneales IX y X. Para una re esquemáticapresentación de enmalle inervación de los peces teleósteos, consulte la Figura 1 en Milsom et al ²⁶ Las líneas blancas en las imágenes son la reflexión del agua de las luces de microscopio.; no definen ninguna estructura morfológica. La barra de escala en el panel (E) es de 4 mm y se aplica a todos los paneles. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. micrografías de luz que representan la distribución y la inervación de ionocytes en un solo filamento ^de la 1ª enmalle arco de un pez de colores aclimatados a 25 ° C. Ionocytes (indicado por las cabezas de flecha) se tiñeron con el anticuerpo y los nervios α-5 (que se indica bflechas y) se tiñeron con el anticuerpo zn-12. (A) Gill filamento de un pez de control que muestra un hatillo centro neurálgico presumiblemente procedentes de los nervios IX y X (inervación extrínseca) con amplia lamelar ramificación. Algunos de los ionocytes indicados también están inervadas (inserto). (B) Un filamento branquial 2 días después de la denervación bilateral completa. Hubo una reducción del haz nervioso central, mientras que la inervación lamelar apareció en gran parte intacto. (C) A Gill filamento 5 días después de la denervación bilateral completa demostrando que la inervación extrínseca era en gran parte ausente. El análisis cualitativo sugiere que la denervación bilateral completa causa la degradación de la inervación extrínseca Gill manteniendo al mismo tiempo los nervios con cuerpos celulares dentro del filamento branquial (inervación intrínseca) la creación de una red de nervios a través del filamento y en las laminillas. Por favorhaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La técnica de tinción diferencial de tiempo puede ser una herramienta útil para entender la regulación dinámica de la absorción de iones y examinar la redistribución temporal de los CI en el epitelio de la agalla. Aunque un procedimiento sencillo, hay una serie de puntos clave que son cruciales para el éxito de la técnica de tinción diferencial de tiempo. El pez de colores debe ser expuesto al colorante mitocondria-rico para el tiempo asignado en el protocolo. Exposiciones más cortas como resultado una mala absorción del colorante por las células mitocondria ricos (es decir, ionocytes). Durante la fijación, el tejido de las agallas debe ser extirpado rápidamente y se mantiene en la oscuridad para evitar la decoloración foto. El tejido debe ser procesada para obtener imágenes dentro de 2 semanas de la fijación. Durante el procedimiento de corte del nervio bilateral asegurar que el pescado está bien anestesiado; los nervios y los vasos sanguíneos están claramente identificados; y el pescado se reanuda la función opercular completo antes de que se trasladó a un depósito de recuperación.

"> El entorno FW presenta peces con el doble reto de equilibrar las pérdidas de iones pasivos y ganancia de agua osmótica ^14. El equilibrio de pérdidas pasivo de iones se produce a través de la captación activa de la sal a través de los circuitos integrados que se localizan a la filamentoso y el epitelio laminar donde pueden establecer un contacto directo con el ambiente externo ^2,4,8,9,16. Sin embargo, la ubicación de los circuitos integrados en la papada no es estática. En las últimas tres décadas, un número de estudios han demostrado que varias especies de peces de FW, cuando se enfrentan con un desafío iónica y / o temperatura, redistribuir ICs branquiales desde el filamento o la base de la lámina a las regiones más distales de la lamela ^{1,2,4,5,17-21.} Tal redistribución puede aumentar el espesor de las láminas que puede comprometer la transferencia de gas (O _2, CO ₂₎ a través del epitelio de la agalla ^22. Los investigadores han utilizado la técnica de tinción diferencial de tiempo descrito en este manuscrito para rastrear la reubicación y emergence de nuevos circuitos integrados en el epitelio de la agalla bajo estas diferentes condiciones experimentales (Figura 1C) ^1,4,5.

Las branquias, y presumiblemente los ICs branquiales, están inervados por los nervios craneales IX y X ^7,23-25. Estos nervios llevan tanto eferente y aferente insumos desde y hacia las branquias, respectivamente. Ellos se encuentran en la parte dorsal de la cavidad bucal detrás de la 4 ^ª agallas arco. La accesibilidad de los nervios y la facilidad con que el procedimiento de la denervación bilateral se puede realizar es específico de la especie. En la trucha, por ejemplo, la anatomía en punta y aplanada de la cabeza permite que los nervios se encuentran en un único plano detrás de la 4 ^ª agallas de arco bajo una capa delgada de tejido. Esto hace que los nervios visible y de fácil acceso para el investigador para llevar a cabo el procedimiento de denervación. En contraste, los peces de colores tienen un hocico más corto y una cabeza más redonda. Los IX y X pares craneales de peces de colores son más profundas en el si dorsalde la cavidad después de la 4 ^ª agallas arco ocupando diferentes planos. Esta orientación limita la facilidad de acceso a los nervios y requiere un enfoque más cuidadoso para identificar y cortar los nervios apropiados. El objetivo del procedimiento de la denervación es eliminar aferente y eferente de entrada sensorial hacia y desde el Gill, respectivamente. La denervación de los arcos branquiales también se puede acoplar con experimentos de flujo de iones utilizando radioisótopos (por ejemplo, ²² Na). Estas técnicas pueden ser usadas en tándem para estudiar la contribución de entrada nervioso en el movimiento de iones a través del epitelio de la agalla. Otra limitación del procedimiento de la denervación es la incapacidad para distinguir entre las neuronas sensoriales y motoras, por lo tanto cuando cortar el nervio bundle es posible que se están eliminando ambos tipos de inervación. La ruptura de las neuronas motoras puede afectar a las branquias y el movimiento opercular de los peces. Así, cuando la realización de experimentos de denervación de enmalle es importante controlar también la ventilación después de lapeces se ha recuperado de el procedimiento para asegurar que hay suficiente movimiento de Gill de gas y de intercambio iónico.

Los protocolos descritos en este uso de manuscritos animales adultos mantienen en un 12:12 luz: oscuridad ciclo y alimento comercial de alimentación. Estos métodos se pueden modificar de varias maneras. En primer lugar, el período de recuperación después de la exposición colorante mitocondria-rico puede ser ajustada a los requisitos de protocolo del investigador (por ejemplo, 1, 3, 5, o 14 días). El más largo período de recuperación después de la exposición al tinte mitocondria ricos en el laboratorio ha estado 14 días ^4,5. No hubo una disminución significativa en la intensidad de la fluorescencia del colorante mitocondria ricos después de 14 días de recuperación. En segundo lugar, el uso del anticuerpo primario α-5 se limita sólo a la identificación de las células de NKA-rico y no distingue entre los diferentes subtipos de ICs branquiales. Afortunadamente, en los peces de colores, se estableció que la mayoría de los circuitos integrados son ambos mitochondrrico en iones (etiqueta con MitoTracker) y NKA ricos (etiqueta con α-5) las células que pueden no ser el caso en todas las especies de peces de ^4,27. Los futuros experimentos pueden concentrarse en seguir la redistribución temporal de los subtipos específicos de CI mediante el uso de anticuerpos dirigidos específicamente contra una variedad de canales, bombas e intercambiadores (por ejemplo, NHE, H ⁺ bomba). Estudios previos han encontrado que la mayoría de ionocytes teñidas con colorante mitocondria ricos en exhibición NKA inmunorreactividad ^4. Inervación de los circuitos integrados se puede detectar mediante el uso de un anticuerpo primario contra el antígeno específico de neuronas derivadas de pez cebra (Zn-12). En este estudio, α-5 y Zn-12 anticuerpos primarios se detectaron usando el mismo anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488) para ambos. Esta limitación se debe a ambos anticuerpos primarios se plantean en un hospedador ratón y es superada por el hecho de que las células NKA-ricos y las neuronas se pueden distinguir morfológicamente a pesar de que emiten fluorescencia del mismo color. La tinción secuencialcon diferentes anticuerpos secundarios (por ejemplo, primera α-5 con Alexa Fluor 488 entonces Zn-12 con Alexa Fluor 594) también se puede utilizar para eliminar el problema de tener ambos marcadores fluorescentes del mismo color. Por último, el protocolo bilateral completa seccionamiento nervio puede ser modificado para atacar los nervios a los arcos branquiales específicos. Por ejemplo, el seccionamiento del nervio selectiva se puede realizar en el primer arco branquial separando suavemente los primero y segundo arcos branquiales para exponer los nervios que conducen a la primera arco branquial en el extremo dorsal de la cesta Gill (Figura 2B-E). La técnica de diferencia de tiempo también se puede aplicar para estudiar la distribución de ionocytes en los peces larvas de pez cebra a medida que desarrollan y las transiciones de transporte de iones desde la piel hasta el gill.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primary antibody	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti mouse)	Life Technologies	A-11001
Benzocaine	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	straight
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11001-12	curved
Dumont No. 5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
Tissue retractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200