Abstract
Kiemen ionocytes (ICs) sind die Funktionseinheiten zur Ionenregulierung in Fisch. Bei Erwachsenen sind, werden sie auf dem filamentösen und Lamellen Epithelien der Kiemen gefunden, wo sie Transport Ionen wie Na +, Cl - und Ca 2+ über eine Vielzahl von Ionenkanälen, Pumpen und Wärmetauscher. Die Knochenfische Kiemen ist extrinsisch durch die Gesichts (VI), glossopharyngeus (IX) und vagus (X) innerviert. Die IX und X Nerven sind auch die äußeren Quelle von Kiemen IC Innervation. Hierbei werden zwei Techniken verwendet, um die Innervation, Proliferation und Verbreitung von ICs studieren beschrieben: ein Zeitdifferenzialfärbungsverfahren und ein voller bilateralen Kiemen Denervierung Technik. Kurz gesagt, werden Goldfisch in eine lebenswichtige Mitochondrien-spezifischen Farbstoff ausgesetzt (zB MitoTracker Rot), die Etiketten (rote Fluoreszenz) vorbestehende ICs. Die Fische wurden entweder läßt 3 erholen - 5 Tagen oder sofort unterzog sich einer vollständigen bilateralen Kiemen Denervierung. Nach 3 - 5 Tage der Erholung, die gKrankheiten werden geerntet und für die Immunhistochemie fixiert. Das Gewebe wird dann mit einem α-5 primären Antikörper gefärbt (Targets Na + / K + ATPase enthaltende Zellen) in Verbindung mit einem sekundären Antikörper, der alle (sowohl neue als auch bereits vorhandene) ICs grün markiert. Mit konfokaler Bildgebung, wurde gezeigt, dass bereits bestehende ICs erscheinen gelb und neuen ICs (sowohl mit einem lebensfähigen Mitochondrium spezifischen Farbstoff und α-5 bezeichnet) erscheinen grün (mit α-5 nur beschriftet). Beide Techniken im Tandem verwendet werden, können angewendet werden, um die Innervation, Proliferation und Verbreitung von ICs auf dem Kiemen Filament zu studieren, wenn der Fisch an Umweltproblemen ausgesetzt.
Introduction
ICs sind die Funktionseinheit für ionische Regelung auf Fisch und basieren auf den epithelialen Oberflächen der Kiemenblättchen gefunden und Lamellen 4,6-8,10. Obwohl eine Vielfalt von Subtypen beschrieben, die einzigartige Eigenschaften besitzen, sind viele der ICs durch eine hohe Dichte der Mitochondrien (wodurch sie auch als Mitochondrien-reichen Zellen bekannt) und / oder einer Häufigkeit des Enzyms dadurch Na + / K + ATPase (NKA). Typischerweise sind diese ICs Haus eine Vielzahl von anderen Pumpen, Ionenkanäle und Ionenaustauscher Regulierung (zB Na + / H + Austauscher, Na + / Cl - -Co-Transporters, H + Pumpe) beteiligt 2,10,11. Die Umverteilung und Proliferation von ICs als Kompensationsmechanismus ist von zentraler Bedeutung für die Aufrechterhaltung Ionenhomöostase insbesondere bei ionischen Stress (zB Exposition gegenüber Ionen schlechte Wasser) 4,8,9.
Diese Studie beschreibt eine Zeitdifferenz Färbung technique 1 neu vermehrt ionocytes (ICs) in Fischkiemen zu identifizieren. Diese Technik wird mit einem vollständigen bilateralen Denervierung der Kiemenbögen verbunden. Goldfisch (Carassius auratus), die in diesen Studien verwendeten Arten ist gut geeignet, um die Proliferation von Kiemen Epithelzellen zu untersuchen, weil sie eine bemerkenswerte Fähigkeit, baulich umgestalten ihre Kiemen 2 haben. Gill Remodeling bezeichnet, um das Wachstum oder die Zurücknahme eines interlamellaren Zellmasse (ILCM), wenn der Fisch (in der Regel bei 15 gehalten - 30 ° C) werden in kaltem Wasser (<15 ° C) oder Hypoxie bzw. 3 akklimatisiert. Frühere Studien unter Verwendung des Zeitdifferenz-Färbetechnik auf Goldfische auf der Umverteilung, Innervation und Proliferation von ICs auf dem Kiemen im Rahmen der Kieme Umbau 4,5 konzentriert. Katoh und Kaneko 1 entwickelte diese neue Technik, die Umwandlung und den Austausch von Kiemen ICs in killifish studieren (Fundulus heteroclitus) transferot-gefrostet aus Meerwasser (SW), um Frischwasser (FW). In dieser Studie, ist der Fokus auf die Proliferation und Innervation des ICs in Goldfische bis 25 ° C akklimatisiert.
Mit der Zeitdifferenz Färbetechnik wurde gezeigt, dass im Rahmen der Kiemen Umbau, Goldfisch eine konstante Anzahl von ICs bei hypoxischen Belichtung und anschließender normoxischen Erholung jedoch der Anteil der innervierten Zellen sank in der gesamten normoxischen Erholungsphase 5. Es wurde vor mehr als 70 Jahren, dass ionische Aufnahmemechanismen in Fische sind unter neuronalen Steuerung 12 vorgeschlagen. Die Knochenfische Kiemen wird durch die Gesichts (VII), glossopharyngeus (IX) und vagus (X) Nerven auch als "Kiemennerven" bezeichnet 13,14 innerviert. Studien Jonz und Nurse (2003) auf Zebrafisch (Danio rerio) Kiemen Innervation zeigte, dass der Ursprung der Innervation extrinsischen (Zellkörper der Nervenfaser extrinsischen zur Kiemen) sowie inneren (ZellkörperNervenfaser ist untrennbar mit dem Kiemen). Die gleichen Autoren zeigten auch, dass Kiemen ICs extrinsisch innerviert 7.
In dieser Studie wurde die Zeitdifferenz Färbetechnik gekoppelt mit voller bilateralen Kiemen Denervierung verwendet werden, um die Verbreitung von ICs fehlt extrinsische Innervation in Goldfisch zu untersuchen. Voll bilateralen Kiemen Denervierung bezieht sich auf Durchtrennen Hirnnerven IX und X. Diese beiden Ansätze sind denkbar in Goldfisch, weil ihre relativ groß (30 bis 200 g) vereinfacht die empfindlichen chirurgischen Verfahren und ionocytes leicht mit Standard-immunhistochemischen Techniken identifiziert. Developmental Studies Hybridoma Bank University; In der vorliegenden Studie wurden die ICs unter Verwendung eines Vital Mitochondrien-spezifischen Farbstoff (zB MitoTracker Rot) oder einen primären Antikörper gegen die α-Untereinheit der Na + / K + -ATPase (α-5 visualisiert of Iowa, Iowa City IA). Dieses Protokoll bietet eine einfache method der Visualisierung und Analyse der Umverteilung und der Proliferation von ICs auf den Fisch Kiemen.
Protocol
Beide Protokolle entsprach den Richtlinien des Canadian Council von Animal Care (CCAC) und wurden mit der Zustimmung der Universität von Ottawa Animal Care Committee (Protokoll BL-226) durchgeführt.
1. Zeitdifferenz Maltechnik: Mitochondrium reiche Dye Bath
- Bereiten 1 mM MitoTracker Red Stammlösung hergestellt, indem 50 & mgr; g in 94,0 ul Dimethylsulfoxid (100% DMSO). Halten Stammlösung im Dunkeln bei -20 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch ist. Vermeiden Einfrieren / Auftauen.
- Bereiten dunkle Boxen (3-6 Kästchen) mit einem maximalen Volumen von 600 ml. Füllen Sie die Felder mit 400 ml Wasser-System (Wasser die Fische werden in der Regel gehalten) und legen einen Luftstein in jedem Feld, um eine Quelle von O 2 zu schaffen. Erhalten Goldfisch (30 - 40 g) und legen Sie sie in den Kästen mit 400 ml Wasser und einem Luftstein. Nach 30 Minuten, fügen Sie die lebensfähige Mitochondrien-reichen Farbstoff, um Endkonzentrationen von 0,1 uM und 0,01% DMSO erhalten. Baden Sie den Fisch für 4 hr.
- Wenn diese Kontrollfische (dh keine Denervierung), schalten Sie Wasserfluss zu den Boxen, damit der Farbstoff zu spülen, und erholen sich die Fische für den Zeitraum, in dem Protokoll zugeordnet. 5 Tage - Fische werden in der Regel für 3 gewonnen.
- Nach der Erholungsphase nach Abschnitt 3 fortfahren: Zeitdifferenz Maltechnik: Immunhistochemie. Wenn diese Fische zu denerviert werden fahren Sie mit Abschnitt 2: Voll Bilaterale Denervation Verfahren.
2. Volle Bilaterale Denervation Vorgehens
- Erhalten 1 Paar Studenten Vannas Frühjahr Schere (gebogen), 1 Paar Standardmuster zangen gerade, 1 Paar Standardmuster zangen gebogen, 2 Paar No. 5 Zangen, 1 Paar Gewebewundhaken, kleine Wattebäusche (1 - 2 mm im Durchmesser), und Wattestäbchen (Q Tipps oder gleichwertig).
- Bereiten Sie die Betäubung Wasserbad. Erstens lösen 10g Benzocain auf ein Endvolumen von 100 mlvon 99% Ethanol, um eine Stammlösung herzustellen. Um die Betäubung Wasserbad vorbereiten, lösen sich 15 ml der Benzocain Lösung in 30 L aus dem Schaumsystem Wasser in der gewünschten Temperatur. Belüften des Wassers, indem man einen Luftstein mit einer Luftpumpe oder einem zentralen Luftlinie in den Wassertank verbunden ist.
- Zeigen Fisch in der Narkose Wasserbad (1A).
- Sobald Atemstillstand, den Fisch auf einem OP-Tisch und intubieren sie, wie in 1B gezeigt. Tun Sie dies, indem Sie einen Schlauch in seiner Mundhöhle, um die Kiemen mit belüfteten Anästhesielösung zu bewässern. Irrigation der Kiemen ist sichergestellt, dass der Fisch mit einer ausreichenden Menge von O 2 und Narkose während der Denervation Verfahren versorgt. Positionieren Sie den Fisch, so dass der Kopf leicht nach unten geneigt. Dies ermöglicht einen besseren Zugang zu den Bereich hinter der vierten Kiemenbogen.
- Heben Sie die Deckel mit den geraden Standardmuster Zangeund legen Sie die Gewebespreizer zwischen dem Kiemendeckel und dem Inneren des Kopfes. Die Gewebewundhaken vorsichtig öffnen, um den Kiemendeckel vom Kopf zu halten und die Kiemen ausgesetzt.
- Stellen Sie sicher, dass die Anästhesielösung ist die Bewässerung der Kiemen während dieses Verfahrens. Seien Sie der Aufroller übernimmt neben dem Kopf, der Zugang zu allen vier Kiemenbögen bietet.
- Legen Sie die Standardmuster gebogenen Pinzette zwischen dem vierten Kiemenbogen und der Rückseite des Kopfes und vorsichtig öffnen, um die Spannung in der Band Anbringen der vierten Kiemenbogen an die Spitze zu schaffen. Mit einem Paar von Zangen No. 5 schaffen eine kleine Öffnung (2 - 3 mm), die durch Durchbohren des Epithels Verbinden des dorsalen Ende der Kiemenbögen zum opercularen Höhle. Achten Sie darauf, zu tief zu gehen, denn es gibt die Gefahr einer Beschädigung ein wichtiges Blutgefäß.
- Mit einem kleinen Wattebausch 5 Pinzette langsam und vorsichtig mit Nr gehalten erweitern den Einschnitt, den IX (glossopharyngeus) und X (Vagus) Nerven aus. KostenlosNerven aus jeder Bindegewebe, indem die Nummer 5 der Pinzette wieder kümmert sich nicht um die Blutgefäße schädigen.
HINWEIS: Die Kiemen IX und X Nerven des Goldfisch ruhen tief hinter der vierten Kiemenbogen und in Nähe zu den Hauptblutgefäße Fütterung in die Kiemenbögen. - Sobald die Nerven identifiziert Verwendung die gebogenen Feder Schere sorgfältig schneiden die Nerven, während der Schnitt mit den geschwungenen Standardform Zange offen halten. Nach Abtrennen der Nerven vorsichtig einfahren gebogenen Pinzette. Es besteht keine Notwendigkeit, um den Einschnitt mit Nähten zu schließen, weil das Epithel ist sehr dünn und der Einschnitt geschlossen wird gewöhnlich auf eigene innerhalb 24 - 48 Std. Entfernen Geweberetraktor.
- Wiederholen des gleichen Verfahrens auf der anderen Seite des Kopfes.
- Schalten Sie die Bewässerung der Kiemen von Betäubung an die frische Luft durchsetzte Wasser, um die Fische aus der Narkose zu erholen. Sobald Kiemendeckel Bewegungen wieder bewegen Sie die Fische in experimentellen Tanks für mindestens 24 Stunden zu erholen.
3. Zeitdifferenz Maltechnik: Immunhistochemie
- Zuerst bereiten 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 4 g PFA in 96 ml PBS). PFA nicht leicht zu lösen in PBS bei RT. Wärme Lösung in einem Wasserbad auf PFA aufzulösen. Führen Sie diese in einem Abzug. Sobald PFA in Lösung abkühlen lassen vor dem Gebrauch. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
- Vor euthanizing die Fische und das Extrahieren des Lamellengewebe, legen Sie 3-4 ml von 4% PFA in eine Szintillationsfläschchen für insgesamt 8 Szintillationsgefäße (1 Fläschchen pro Kiemenbogen). Außerdem nehmen eine kleine wiegen Boot und füllen es mit 1x PBS. Dies wird verwendet, um das Gewebe zu waschen, nachdem sie herausgeschnitten wurde. Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis.
- Nach der lebensfähige Mitochondrien-reichen FarbstoffexpositionExperiment beendet, einschläfern die Goldfische, indem Sie es in einem Wasserbad mit einer Überdosis Benzocain.
- Verwenden stumpfen Pinzette, um die Kiemendeckel auf einer Seite des Kopfes und gebogene Scherenhebebühne, um jedes Ende der Kiemenkiemenkorb durchtrennen. Vorsichtig holen die Kiemen von den Reusen mit stumpfen Pinzette und heben Sie sie aus dem Kiemendeckel Höhle. Sofort und die Kiemen in eiskaltem 1x PBS, um überschüssige Benzocain und Blut zu entfernen.
- Legen Sie die herausgeschnitten Kiemen in separaten Fläschchen (ein Fläschchen pro Kiemenbogen) mit 4% PFA gefüllt und fixieren Sie O / N bei 4 ° C.
- Nach der Fixierung, Waschen des überschüssigen PFA in 1X PBS und platzieren des Gewebes in einem 2 ml Kugel Rohr mit 1,5 ml 1% Triton-X auf einem Schüttler 6 h bei RT gefüllt oder O / N bei 4 ° C. Dieser Schritt permeabilisiert das Gewebe. Wenn die ganze Kieme ist zu groß, um in ein 2-ml-Tube setzen dann schneiden das Gewebe in Abschnitte klein genug, um den Schlauch kümmert passen nicht, um die Filamente zu beschädigen.
- Bereiten Sie die primären Antikörper-Verdünnungen von miXING 4 ul der Vorratslösung jeder primären Antikörper (insgesamt 8 ul) in 992 ul 1x PBS. Stellen Sie sicher, dass die NKA (Etiketten NKA reichen Zellen) und Zn-12 (Etiketten Neuronen) primären Antikörper wurden in dem gleichen Host angehoben. Dies ist wichtig, wenn die Forscher sich entscheiden, bestimmte IC-Subtypen in der gleichen Zeit, in der sie müssen Primär- und Sekundärantikörper in einer anderen Wirtsspezies erhöht verwenden zu identifizieren.
- Entfernen Sie das Triton-X-Lösung und ohne Waschen des Gewebes fügen Sie eine 1: 250-Verdünnung (in 1 × PBS verdünnt) einer NKA monoklonalen Antikörper (α-5) zu NKA reichen Zellen und ein Zebrafisch spezifische neuronale Antikörper nachzuweisen (zn-12) Nervenfasern (primäre Antikörper) erkennen und Inkubieren auf einem Schüttler für 6 h bei RT und O / N bei 4 ° C.
- 3 min jeweils mit 1x PBS waschen primären Antikörpers 3 mal. Um dies zu tun, entfernen Sie den primären Antikörperlösung aus dem Röhrchen durch Absaugen es aus mit einer Pipette.
- Vorbereiten des sekundären Antikörpers an ein1: 200-Verdünnung hergestellt, indem 5 ul von Aktien sekundären Antikörpers in 995 ul 1x PBS. Bewerben Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488) und Inkubation für 6 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C auf einem Schüttler.
HINWEIS: MitoTracker Red auf einem ~ 594 nm Wellenlänge angeregt und fluoreszieren rot. Ein sekundärer Antikörper, der an einer ~ 488 nm Wellenlänge angeregt wird und fluoresziert grün muss verwendet werden, um NKA beschriften und Zn-12 primären Antikörper werden. - Überschüssiges sekundäre Antikörper durch Waschen des Gewebes 3 mal für je 5 min (wie in Schritt 3.7 beschrieben).
4. Imaging
- Nach dem Waschen, montieren Sie die Gewebe auf einer konkaven Rutsche für whole mount konfokale Bildgebung von Zellen und Nervenfasern. Um das Gewebe zu befestigen, legen Sie sie zuerst in einem Tropfen (200 ul) von 1 × PBS auf einer flachen Objektträger. Dies stellt sicher, dass das Gewebe nicht austrocknen.
- Trennen Sie die Kiemen hemibranchs mit den gekrümmten Mikro-Schere. Geben Sie einen Tropfen 1x PBS und einen Tropfen Eindeckmittel in eine konkave Schiebe.
- Zeigen die getrennten hemibranchs in den konkaven Schieber mit der Vorderkante des Fadens nach oben und mit einem Deckglas. Tupfen Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack, um das Deckglas aus, um sich und Verschieben des Gewebes zu verhindern. Lassen Sie das Gewebe an der Unterseite des konkaven Rutsche 10 zu regeln - 15 Minuten vor der Belichtung.
- Für jede Kiemenbogen, wählen Sie sechs Kiemenblättchen nach dem Zufallsprinzip für die Bildverarbeitung, Herstellung von sechs Bildern pro Kiemenbogen. Verwenden Sie konventionelle konfokale Mikroskopie für Bild in das Gewebe, indem sie 1-3 um optische Schnitte.
HINWEIS: Alle bereits bestehenden Zellen mit MitoTracker Rot gekennzeichnet werden und positiv für NKA nur gelb angezeigt. Zellen, die nur rot dargestellt sind bereits vorhandenen ICs, die nicht NKA enthalten. Jedes neu vermehrt Zell nur positiv für NKA und wird nur grün angezeigt. Nervenfasern werden auch als grüne.
5. Bildanalyse zur Quantifizierung Ionocyte
- Für each Kiemen Filament, das abgebildet worden ist, zu quantifizieren, die ICs und der zugehörigen Innervation durch Scrollen durch die Abschnitte der Z-Stapel und Zählen der Anzahl von lamellaren und filamentösen ICs vorhanden ist und ob sie neu sind, differenzierten, vorbestehende und / oder innervierten .
- Quantifizierung der ICs pro Filament oder pro Fläche (mm 2) des Filaments. Tun Sie dies, indem Sie die Zeichenwerkzeuge mit der verwendet werden, um die Bilder zu erwerben, um die Lamellen des Filaments umfasst den Bereich des Filaments in dem die ICs wurden quantifiziert skizzieren Software verbunden sind. Meist konfokale Bildgebung Softwareprogrammen die Möglichkeit, die Fläche eines skizzierten Bereich auf dem Bild zu berechnen. Verwenden Sie die Option in der Bildbearbeitungssoftware, die Sie, dies zu tun, um die Gegend zu erwerben können.
- Dividieren der gezählten ICs durch die von der Software berechnet, um ein Maß für ICs pro Flächeneinheit zu erzielen (zB pro mm 2) Fläche.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt den OP-Tisch einzurichten (Abbildung 1A), die Platzierung der Fische während der Operation (1B) und die drei wichtigsten Schritte für die Zeitdifferenz Färbetechnik (1C). In Schritt 1 wird der Fisch für 30 Minuten in einem gut belüfteten Wasserbad bei 25 ° C im Dunkeln gehalten. Während der Dauer von 30 Minuten kann der Forscher die Mitochondrien-reichen Farbstoff aliquoten in DMSO, die bei Schritt 2 (Abbildung 1 C) dem Wasser zugesetzt wird, vorzubereiten. Die Inkubationszeit in Schritt 2 ermöglicht die Aufnahme des Mitochondriums reichen Farbstoff aus dem Wasser in den Mitochondrien-reichen Zellen (dh, ICs). Die Fische können dann entweder unterziehen die gesamte bilaterale Denervierung Verfahren oder eine Schein-Verfahren, bei dem der Fisch betäubt und die Kiemendeckel manipuliert, sondern die Nerven intakt bleiben. Die in Schritt 3 festgelegt ist ein mit fließendem Wasser für einen Fisch, der ei aufweist Gewinnungskammerther zogen Voll bilateralen Denervierung oder eine "Schein" Verfahren.
Nach der Erholungsperiode wurden die Fische getötet und die Kiemen wurden herausgeschnitten und für die Immunhistochemie fixiert. Die Gesamtverteilung und Innervation ICs auf dem Kiemen Filament aus einem Fisch, der eine "Schein" -Verfahren unterzogen hatten ist in Abbildung 2 dargestellt. Die ICs auf dem filamentösen Epithelien anwesend sind, sowie an der Basis des den interlamellaren Bereichen. 2A zeigt vorbestehenden ICs mit Mitochondrien-reichen Farbstoff markiert (dh existiert diese ICs, bevor die Denervierung / Schein-Verfahren wurden durchgeführt). 2B zeigt Nervenfasern innervieren die bereits bestehenden und neu gegründeten ICs (von NKA Immunreaktivität identifiziert) der filamentösen und Lamellen Epithelien. Schließlich Zusammenführung der beiden Bilder (2C) zeigt deutlich die bereits vorhandenen ICs (erscheint gelb) und die neuen ICs (erscheint grün).Figur 2D ist eine repräsentative graphische Darstellung der IC Quantifizierung der in Figur 2A-C dargestellt Filaments. Auf diesem speziellen Filamenten, scheint es eine größere Anzahl von neu proliferierten ICs pro mm 2 als vorbestehenden ICs sein (N = 1). Um die Quelle der extrinsische Innervation Kiemen entfernen, wurden die IX und X Hirnnerven (extrinsische Innervation) durchtrennt. 3A zeigt die Rückenregion des Kiemendeckel Hohlraum nach den Kiemenblättchen und die Epithelien bedeckt die Nerven wurden entfernt, um die IX und X aussetzen Hirnnerven (mit römischen Ziffern gekennzeichnet), die aus zwei Hauptnervenstränge erstrecken, um alle vier Bögen (3A) innervieren; die Kiemenbögen sind bis 4. 3B-E mit den Nummern 1 veranschau selektive Denervierung des ersten Kiemenbogens. Die erste Kiemenbogen wird sowohl durch die IX und X Schädelnerven (3B), das ohne Beeinträchtigung der Innervation des Rest o entfernt werden kann innerviertf den Kiemenbögen (3C-E). Voll bilateralen Denervierung ergibt allmählichen Verlust der extrinsische Innervation des Kiemen (4A-C). Steuer Fische zeigen eine offensichtliche Nervenbündels, die die Länge des Fadens (4A) überspannt. Voll bilateralen Denervierung führte zu einem gewissen Verlust von extrinsischen Innervation nach 2 Tagen der Erholung (4B). Ferner Verschwinden extrinsische Innervation wurde nach 5 Tagen der Erholung von Denervation (4C). Ein verbleibender Innervation ICs nach 5 Tagen der Erholung vermutlich wurde von Nerven mit Zellkörper in der Kiemenfaden abgeleitet (intrinsische Innervation; 4C).
Abbildung 1: Versuchsaufbau für die Denervierung Verfahren und Reihenfolge der Schritte in das verwendeteZeitdifferenz Färbetechnik. (A) Chirurgie Tabelle für Denervierung Verfahren, die die Narkose und Schmutzwassertank setzen. (B) Beispiel für die Platzierung eines narkotisiert, intubiert Fisch. (C) Die wichtigsten Schritte in der Zeitdifferenz Färbetechnik verwendet. In Schritt 1 wird der Fisch in einem temperaturgesteuerten, statischen belüfteten Wasserbad für 30 min plaziert. Die Mitochondrien-reiche Farbstoff wird in Schritt 2 in einer Endkonzentration von 0,1 & mgr; M zugegeben, und der Fisch können in der Lösung für mindestens 4 Stunden zu baden. Wasserdurchfluss wird in Schritt 3, an welcher Stelle der Fisch unterzogen, entweder eine vollständige bilateralen Denervation des Kiemen oder eine Scheinoperation neu gestartet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 2. Lichtmikroskopische Aufnahmen, die die Zeitdifferenz Färbetechnik in einem Goldfisch (bis 25 ° C akklimatisiert) 2 Tage nach der vollständigen bilateralen Denervierung. (A) Die Verteilung der bereits bestehenden ionocytes (ICs; Pfeile). Auf einem Kiemenfaden wird von Mitochondrien-reichen Farbstoff Färbung ergab (B) Die Verteilung der ICs (neuen und bereits bestehenden) und Kiemennerven (gestrichelte Pfeile) wird durch Färbung mit dem α-5 und Zn-12-Antikörpern offenbart. Die Pfeile zeigen ICs (C) Die Überlappung von (A) und (B) unterscheidet vorbestehenden ICs. (Gelb erscheinen, durch Pfeile angedeutet) aus neu proliferierten ICs (grün erscheinen, durch Pfeile angedeutet). Legen in (C) ist eine Vergrößerung eines innervierten vorbestehenden ionocyte. (D) repräsentativer Graph der IC Quantifizierung der in Platten (AC) gezeigten Filaments. N = 1. Maßstabsbalken in Platte (C) beträgt 50 & mgr; m und gilt für alle Panels./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative Bilder, die verschiedene Stufen der Kiemen Innervation. (A) Dorsale Ansicht der Mundhöhle, die die IX und X Hirnnerven innerviert alle 4 Kiemenbögen. Kiemenbögen sind nummeriert 1-4. Die Kiemenblättchen und die Abdeckung die Nerven wurden entfernt, um die Innervation besser zu visualisieren Gewebe. (B) Die 1. und 2. Kiemenbögen getrennt werden, um die Sinnesorgan zu offenbaren und die Zweige der IX und X Hirnnerven innervieren den 1. Kiemen arch. (CE) Sequenz von Bildern, die die selektive Denervierung des 1. Kiemenbogens durch Abtrennen der Äste der IX und X Hirnnerven. Eine schematische WiederPräsentation der Kiemen Innervation der Knochenfische finden Sie in Milsom et al Abbildung 1 26 Die weißen Linien in den Bildern sind Wasser Reflexion aus der Mikroskopbeleuchtung. sie jede morphologische Struktur nicht definieren. Maßstabsbalken in Tafel (E) beträgt 4 mm und für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4: Lichtmikroskopische Aufnahmen der Darstellung der Verteilung und Innervation ionocytes auf einem einzigen Faden des 1. Kiemenbogens eines Goldfisches auf 25 ° C Ionocytes (durch Pfeilspitzen angezeigt) akklimatisiert wurden mit dem α-5-Antikörper und Nerven (angegeben gebeizt by Pfeile) wurden mit der Zn-12-Antikörper gefärbt. (A) Gill Wendel einer Kontrollfische, die ein Zentralnervenbündels vermutlich aus dem IX und X Nerven (extrinsische Innervation) mit umfassenden Lamellenverzweigungs Ursprung. Einige der angegebenen ionocytes auch innerviert (Einsatz). (B) ein Kiemen Filament 2 Tage nach der vollständigen bilateralen Denervierung. Es war eine Senkung des zentralen Nervenbündels, während die Lamellen Innervation erschien 5 Tage nach der vollständigen bilateralen Denervierung zeigen, dass extrinsische Innervation war weitgehend fehlen weitgehend intakt. (C) ein Kiemenfaden. Qualitative Analyse deutet darauf hin, dass die vollständige bilateralen Denervierung verursacht eine Verschlechterung der äußeren Kiemen Innervation unter Beibehaltung Nerven mit Zellkörper in der Kiemenfaden (intrinsische Innervation) ein Netzwerk von Nerven durch das Filament und in den Lamellen. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Der Zeitunterschied Färbetechnik kann ein nützliches Werkzeug, um die dynamische Regelung der Ionenaufnahme zu verstehen und die zeitliche Verteilung der ICs in der Kiemen Epithelien zu untersuchen. Obwohl ein einfaches Verfahren, gibt es eine Anzahl von Kernpunkten, die entscheidend für den Erfolg des Zeitdifferential Färbetechnik sind. Der Goldfisch muss dem Mitochondrium reichen Farbstoff für die Zeit in der Protokoll zugeteilt ausgesetzt werden. Kürzere Expositionen zu einer schlechten Aufnahme des Farbstoffs durch die Mitochondrien-reichen Zellen (dh ionocytes) führen. Während der Befestigung muss der Lamellengewebe schnell herausgeschnitten werden und im Dunkeln gehalten auf ein Foto, Bleich vermeiden. Das Gewebe muss für die Abbildung innerhalb von 2 Wochen Fixierung verarbeitet werden. Während der bilateralen Nervenschneideverfahren zu gewährleisten, dass der Fisch auch narkotisierten; die Nerven und Blutgefäße sind deutlich gekennzeichnet; und die Fische wieder voll Kiemendeckel Funktion, bevor es zu einer Schmutzwassertank bewegt wird.
"> Der FW-Umgebung präsentiert Fisch mit der doppelten Herausforderung von Ausgleichs passive Ionenverluste und Osmosewasser Gewinn 14. Über die aktive Aufnahme von Salz über die ICs, die dem filamentösen und Lamellen Epithelien, wo sie können lokalisiert werden Der Ausgleich der passiven Ionenverluste auftritt in direkten Kontakt mit der äußeren Umgebung 2,4,8,9,16. Jedoch ist die Position der ICs auf dem Kiemen nicht statisch. In den vergangenen drei Jahrzehnten eine Reihe von Studien haben gezeigt, dass mehrere FW Fischart, wenn konfrontiert mit einem ionischen und / oder Temperatur Herausforderung umverteilen Kiemen ICs von dem Faden oder der Basis der Lamelle zu den entfernteren Bereichen des Lamellen 1,2,4,5,17-21. Solche Umverteilung kann die Dicke der Lamellen erhöht die können Gasübertragung beeinträchtigen (O 2, CO 2) über die Kiemen Epithelien 22. Die Forscher haben die in diesem Manuskript beschriebenen Zeitdifferenz Färbetechnik verwendet, um die Verlagerung und EmergenC verfolgenE von neuen ICs auf dem Kiemen Epithelien unter diesen verschiedenen experimentellen Bedingungen (1C) 1,4,5.Die Kiemen und vermutlich die Kiemen ICs, werden von den IX und X Hirnnerven 7,23-25 innerviert. Diese Nerven führen sowohl efferenten und afferenten Inputs zu und von der Kiemen sind. Sie sind an der dorsalen Seite der Mundhöhle hinter dem 4. Kiemenbogen befindet. Die Zugänglichkeit der Nerven und der Leichtigkeit, mit der die bilaterale Denervierung Verfahren kann durchgeführt werden, ist artspezifisch. Forellen, beispielsweise der spitze und abgeflacht Anatomie des Kopfes ermöglicht die Nerven in einer Ebene hinter der 4. Kiemenbogen unter einer dünnen Gewebeschicht liegen. Dies macht die Nerven sichtbar und leicht zugänglich für den Forscher, die Denervierung Verfahren ausführen. Im Gegensatz dazu Goldfische haben eine kürzere Schnauze und einen runderen Kopf. Die IX und X Hirnnerven von Goldfischen liegen tiefer in die dorsale side der Kavität, nachdem die 4. Kiemenbogen Besatzungs verschiedenen Ebenen. Diese Ausrichtung begrenzt die Erleichterung des Zugangs zu den Nerven und benötigt eine sorgfältige Ansatz zur Ermittlung und trennen Sie die entsprechenden Nerven. Ziel des Verfahrens ist es, Denervierung sensorischen afferenten und efferenten eingegeben und von der Kiemen entfernen sind. Denervation der Kiemenbögen kann auch mit Ionenfluß Experimenten unter Verwendung von Radioisotopen (z, 22 Na) gekoppelt werden. Diese Techniken können in Tandem verwendet, um den Beitrag des Nerven Eingang Ionenbewegung durch die Kiemen Epithelien untersuchen. Eine weitere Einschränkung für die Denervierung Verfahren ist die Unfähigkeit, zwischen sensorischen und motorischen Neuronen zu unterscheiden, wodurch bei der Durchtrennen des Nervenbündels ist es möglich, dass beide Arten der Innervation werden entfernt. Trennen Sie alle motorischen Neuronen kann die Kiemen und Kiemendeckel Bewegung der Fische beeinflussen. So beim Ausführen Kiemen Denervierung Experimente ist es wichtig, auch Lüftungs nachdem der MonitorFische aus dem Verfahren zurückgewonnen, um sicherzustellen, daß genügend Kiemen Bewegung mit Gas und Ionenaustausch.
Die in dieser Handschrift Verwendung adulter Tiere beschriebenen Protokolle gehalten auf einem 12:12 Hell: Dunkel-Zyklus und gefüttert kommerziellen Futterpellets. Diese Verfahren können auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Erstens kann die Erholungszeit nach Mitochondrium reichen Farbstoff Exposition gegenüber den Anforderungen der Forscher Protokoll (zB 1, 3, 5 oder 14 Tage) eingestellt werden. Die längste Zeit der Erholung nach der Mitochondrien-reichen Farbstoff Exposition im Labor hat 14 Tage 4,5. Es war keine signifikante Abnahme der Intensität der Fluoreszenz der Mitochondrien-reichen Farbstoff nach 14 Tagen der Erholung. Zweitens wird die Verwendung des α-5 primäre Antikörper nur Identifizieren NKA reichen Zellen und nicht zwischen den verschiedenen Subtypen von Kiemen ICs unterscheiden beschränkt. Zum Glück, in Goldfisch wurde festgestellt, dass die Mehrheit der ICs sind beide mitochondrIonen-reich (Etikett mit MitoTracker) und NKA-rich (Etikett mit α-5) Zellen, die nicht in allen Fischarten 4,27 der Fall sein kann. Zukünftigen Experimenten kann nach der zeitlichen Verteilung der spezifischen IC-Subtypen unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch gegen eine Vielzahl von Kanälen, Pumpen und Wärmetauscher (zB NHE, H + Pumpe) gerichtet konzentrieren. Vorherige Studien zeigten, dass die Mehrzahl der ionocytes mit Mitochondrien-reichen Farbstoffausstellungs NKA Immunreaktivität 4 gefärbt. Innervation der ICs können mit einem primären Antikörper gegen Zebrabärbling-abgeleiteten Neuron-spezifische Antigen (zn-12) festgestellt werden. In dieser Studie, α-5 und Zn-12 primären Antikörper wurden unter Verwendung des gleichen sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488) sowohl detektiert. Diese Beschränkung ist auf beide primäre Antikörper in einem Mäusewirt erhöht und wird durch die Tatsache, dass die NKA reichen Zellen und Neuronen morphologisch unterschieden werden, obwohl sie die gleiche Farbe fluoreszieren überwinden. Sequential Färbungunterschiedliche Sekundärantikörper (beispielsweise erste α-5 mit Alexa Fluor 488 dann ZN-12 mit Alexa Fluor 594) kann auch verwendet werden, um das Problem, dass die beiden Markierungen fluoreszierende die gleiche Farbe zu beseitigen. Schließlich kann die volle bilateralen Nervenschneide Protokoll modifiziert werden, um Nerven zu bestimmten Kiemenbögen zielen. Beispielsweise können selektive Nerven Schnitte auf der ersten Kiemenbogen durch leichtes Trennen der ersten und zweiten Kiemenbögen, die Nerven, die zu dem ersten Kiemenbogen an der dorsalen Ende der Kiemenkorb (2B-E) ausgesetzt werden durchgeführt werden. Die Zeitdifferenz-Technik kann auch angewendet werden, um die Verteilung der ionocytes Larven Zebrabärbling Fische zu untersuchen, wie sie sich entwickeln und Ionentransportgänge von der Haut an die Kiemen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Katoh, F., Kaneko, T. Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique. J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).
- Perry, S. F. Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).
- Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus. J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).
- Mitrovic, D., Perry, S. F. The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus). J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).
- Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).
- Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish. J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).
- Laurent, P., Hebibi, N. Gill morphometry and fish osmoregulation. Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).
- Perry, S. F., Laurent, P. Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell. J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).
- Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).
- Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).
- Krogh, A. The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).
- Nilsson, G. E. Innervation and pharmacology of the gills. Fish Physiology. Randall, D. J., Hoar, W. S. , Academic Press. Orlando, FL. 185-272 (1984).
- Sundin, L., Nilsson, S.
- Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill). Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).
- Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).
- Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer. Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).
- Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus). J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).
- Chou, M. Y., et al. Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses. J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).
- Kaneko, T., Katoh, F. Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference. Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).
- Ouattara, N., et al. Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron. Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).
- Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss. J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).
- Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout. Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate. J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).
- Jonz, M. G., Zaccone, G.
- Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui). J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).
- Hwang, P., Lee, T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).
