Abstract
ionocytes branchial (ICs) הם היחידות פונקציונליות לרגולציה יונית בדגים. אצל מבוגרים, הם נמצאים בfilamental וepithelia שבשבת של הזימים שבו הם יוני תחבורה כגון Na +, Cl - וCa 2 + באמצעות מגוון רחב של תעלות יונים, משאבות ומחליפות. הזימים החוליות הוא innervated extrinsically על ידי, לשון או לוע (IX) ותועים עצבים (X) פנים (VI). עצבי IX ו- X הם גם המקור החיצוני של עצבוב IC branchial. הנה, שתי טכניקות משמשות ללמוד עצבוב, התפשטות והפצה של מעגלים משולבים מתוארות: טכניקת צביעת ההפרש זמן וטכניקת denervation זימים דו-צדדית מלאה. בקצרה, דג זהב חשוף לצבע mitochondrion הספציפי חיוני (למשל, MitoTracker אדום) אשר תוויות (הקרינה אדומה) שבבים קיימים מראש. דגים הורשו גם להתאושש במשך 3-5 ימים או עברו denervation זימים דו-צדדי מלא באופן מיידי. לאחר 3-5 ימים של התאוששות, gחוליים נקצרים וקבועים אימונוהיסטוכימיה. הרקמה אז מוכתם בα-5 נוגדן ראשוני (יעדים Na + / K + ATPase המכיל תאים) בשיתוף עם נוגדנים משני שמתייג את כל (שניהם קיימים מראש החדש ו) הירוקים השבבים. השימוש בהדמית confocal, שהוכיח כי שבבים קיימים מראש מופיעים צהובים (שכותרתו עם שני לצבוע mitochondrion ספציפי קיימא וα-5) ושבבים חדשים מופיעים ירוק (שכותרתו עם α-5 בלבד). יכולות להיות מיושמות גם טכניקות המשמשות במקביל ללימודי עצבוב, הפצה והפצה של מעגלים משולבים בנימת הזימים דגים כאשר נחשפים לאתגרים סביבתיים.
Introduction
מעגלים משולבים הם היחידה הפונקציונלית לרגולציה יונית בדגים ובנמצאים על משטחי אפיתל של חוטי הזימים וlamellae 4,6-8,10. למרות מגוון רחב של תת תוארו שיש תכונות ייחודיות, רב של השבבים מאופיינים בצפיפות גבוהה של מיטוכונדריה (ובכך הם ידועים גם בשם תאי mitochondrion העשיר) ו / או שפע של האנזים Na + / K + ATPase (NKA). בדרך כלל, בית שבבים אלה מגוון של משאבות אחרות, תעלות יונים ומחליפים מעורבות בויסות יון (למשל, Na + / H + מחליף, Na + / Cl - שיתוף טרנספורטר, H + משאבה) 2,10,11. חלוקה מחדש ושגשוגם של מעגלים משולבים כמנגנון פיצוי הוא מרכזיים לשמירה על הומאוסטזיס יון במיוחד בלחץ יוני (לדוגמא, חשיפה למים יון-עני) 4,8,9.
מחקר זה מתאר techni צביעת ההפרש זמןque 1 לזהות ionocytes התרבו לאחרונה (ICs) בזימי דגים. טכניקה זו בשילוב עם denervation דו-צדדי מוחלט של קשתות זימים. דג זהב (Carassius auratus), המינים המשמשים במחקרים אלה, הוא גם מתאים ללמוד התפשטות של תאי אפיתל זימים כי יש להם יכולת מופלאה לשפץ מבני הזימים 2. שיפוץ גיל מתייחס לצמיחה או ההכחשה של מסת תאי interlamellar (ILCM) כאשר הדגים (בדרך כלל נשמרים ב15-30 מעלות צלזיוס) הם הסתגלו למים קרים (<15 ° C) או היפוקסיה, בהתאמה 3. מחקרים קודמים תוך שימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן על דג זהב התמקדו בחלוקה מחדש, העצבוב ושגשוגם של מעגלים משולבים בזימים בהקשר של זימים שיפוץ 4,5. transfe קאטו ו1 Kaneko פיתחו שיטה חדשנית זו כדי לחקור את השינוי והחלפה של שבבי branchial בנאוויות (Fundulus heteroclitus)rred מים מן הים (SW) למים מתוקים (FW). במחקר זה, הדגש הוא על ההתפשטות והעצבוב של שבבים בדג הזהב התאקלמו עד 25 ° C.
שימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן זה היה מראה כי, בהקשר של שיפוץ זימים, דג זהב לשמור על מספר קבוע של שבבים במהלך חשיפת חוסר חמצן והתאוששות normoxic שלאחר מכן, עם זאת, אחוז תאי innervated ירד במהלך תקופת התאוששות normoxic 5. הוצע לפני יותר מ -70 שנים שמנגנוני קליטה יוניות בדגים נמצאים בשליטה עצבית 12. הזימים החוליות הוא innervated על ידי עצבי פנים (VII), לשון או לוע (IX) ותועה (X) המכונים גם "עצבי branchial" 13,14. מחקרים על ידי Jonz ואחות (2003) בדג הזברה (Danio rerio) עצבוב זימים הראו כי מקורו של העצבוב הוא חיצוני (גוף תא של סיבי עצב הוא חיצוני לזימים), כמו גם פנימי (גוף תא שלסיבי עצב הוא מהותיים לזימים). אותם החוקרים הראו גם כי שבבי branchial מעוצבבים 7 extrinsically.
במחקר זה, טכניקת צביעת ההפרש הזמן בשילוב עם denervation זימים דו-צדדי מלא הייתה בשימוש כדי לחקור את ההתפשטות של שבבים חסרי עצבוב חיצוני בדג זהב. denervation זימים דו-צדדי מלא מתייחס לניתוק IX עצבי גולגולת וX. שתי גישות אלה הן אפשריים בדג זהב בגלל הגודל שלהם גדול יחסית (30-200 ז) מפשט את ההליכים כירורגיים העדינים, וionocytes קלות מזוהות באמצעות טכניקות חיסוני histochemical סטנדרטיים. במחקר הנוכחי, שבבים היו דמיינו באמצעות צבע חיוני mitochondrion הספציפי (למשל, MitoTracker אדום) או נוגדן ראשוני נגד α-המקטע של Na + / K + -ATPase (α-5; התפתחותית מחקרי Hybridoma הבנק, אוניברסיטה איווה, Iowa City IA). פרוטוקול זה מספק metho פשוטד של הדמיה וניתוח חלוקה מחדש ושגשוגם של מעגלים משולבים בזימי הדגים.
Protocol
שני הפרוטוקולים תאמו את ההנחיות של המועצה הקנדית של טיפול בבעלי חיים (CCAC) ובוצעו באישור אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים אוטווה (פרוטוקול BL-226).
1. זמן דיפרנציאלי מכתים טכניקה: mitochondrion עשיר Dye אמבט
- הכן 1 פתרון מניות מ"מ MitoTracker אדום על ידי המסת 50 מיקרוגרם ב94.0 μl של sulfoxide דימתיל (100% DMSO). שמור פתרון מניות בחושך ב -20 ° C כאשר אינו בשימוש. הימנע מהקפאה / הפשרה מחזורים.
- הכן קופסות שחורות (3-6 תיבות) עם נפח מרבי של 600 מיליליטר. מלא את התיבות עם 400 מיליליטר מים מערכת (מים הדגים בדרך כלל נערכו ב) ולמקם את אבן אוויר בכל תיבה כדי לספק מקור של O 2. להשיג דג זהב (30 - 40 גרם) ולמקם אותם בקופסות עם 400 מיליליטר של מים ואבן אוויר. לאחר 30 דקות, להוסיף צבע mitochondrion עשיר קיימא להניב ריכוזים סופיים של 0.1 מיקרומטר ו0.01% DMSO. לרחוץ את הדגים של 4 שעותr.
- אם אלה הם דגי שליטה (כלומר, אין denervation), להפעיל את זרימת מים לתיבות, לאפשר לצבע כדי לשטוף את ולשחזר את הדגים לתקופה של הזמן המוקצב בפרוטוקול. דגים הם התאוששו בדרך כלל עבור 3-5 ימים.
- לאחר תקופת ההחלמה להמשיך לסעיף 3: טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים: אימונוהיסטוכימיה. אם דגים אלה יש denervated להמשיך לסעיף 2: נוהל denervation דו-צדדי מלא.
2. denervation נוהל דו-צדדי מלא
- השג 1 זוג מספריים תלמיד אביב Vannas (מעוגלים), 1 זוג מלקחיים-ישר דפוס סטנדרטיים, 1 זוג מלקחיים מעוקלים דפוס סטנדרטיים, 2 זוגות של מס '5 מלקחיים, 1 זוג מפשקי רקמה, כדורי צמר גפן קטן (1 - 2 מ"מ קוטר), וצמר גפן (Q טיפים או שווה ערך).
- הכן את אמבט מים ההרדמה. ראשית, לפזר 10 גרם של benzocaine לנפח סופי של 100 מיליליטרשל 99% אתנול להכין פתרון מניות. כדי להכין את אמבט מים הרדמה, לפזר 15 מיליליטר של פתרון benzocaine המניה ל -30 ליטר של מים במערכת סודה בטמפרטורה הנדרשת. לאוורר את המים על ידי הנחת אבן-אוויר מחוברת למשאבת אוויר או אוויר-קו מרכזי למכל המים.
- הנח דגים לאמבטיה ההרדמה המים (איור 1 א).
- ברגע שהנשימה פסקה, למקם את הדגים על שולחן ניתוחים וצנרר זה כפי שמוצג באיור 1. עושה זאת על ידי החדרת צינור בחלל הלחי שלה להשקות את הזימים עם הרדמה סודה. השקיה של הזימים מבטיחה כי הדגים מסופקים עם כמות מספקת של O 2 והרדמה במהלך הליך denervation. מקם את הדגים כך שהראש מוטה מעט כלפי מטה. זה מאפשר לגישה טובה יותר לאזור שמאחורי קשת הזימים הרביעית.
- רם בעדינות את operculum עם המלקחיים דפוס סטנדרטיים ישרולמקם את מפשקי הרקמה בין operculum ואת החלק הפנימי של הראש. לפתוח בזהירות את מפשקי הרקמה לשמור operculum מהראש ולשמור על הזימים חשופים.
- ודא שחומר הרדמת השקיית הזימים במהלך הליך זה. לנוח מפשק מטפל בסמוך לראש אשר מספק גישה לכל ארבעת קשתות הזימים.
- מניחים את תבנית המלקחיים המעוקלים סטנדרטיים בין קשת הזימים הרביעית והחלק האחורי של הראש ולפתוח אותם בעדינות כדי ליצור מתח ברצועת חיבור לקשת הזימים הרביעית לראש. עם זוג מס '5 מלקחיים ליצור פתח קטן (2 - 3 מ"מ) על ידי פירסינג אפיתל חיבור סוף הגב של קשתות הזימים לחלל opercular. היזהר שלא ללכת עמוק מדי, כי יש את הסיכון של פגיעה בכלי דם גדול.
- עם כדור צמר גפן קטן שנערך עם מס '5 מלקחיים לאט ובזהירות להרחיב את החתך על מנת לחשוף את IX (לשון או לוע) וX עצבים (התועה). חינםעצבים מכל רקמת חיבור באמצעות מס '5 מלקחיים, לוקח שוב להיזהר שלא לפגוע בכלי דם.
הערה: IX branchial וX עצבים של דג הזהב לנוח עמוק מאחורי קשת הזימים הרביעית ונמצאים בסמיכות לכלי דם גדולים האכלה לקשתות זימים. - ברגע שעצבים זוהו שימוש במספריים באביב המעוקלים לחתוך בזהירות את העצבים תוך כדי לחיצה על החתך פתוח עם המלקחיים צורה סטנדרטיים המעוקלים. אחרי ששרפתי את העצבים, בעדינות לחזור בו מהמלקחיים המעוקלים. אין צורך לסגור את החתך עם תפרים כי האפיתל הוא דק מאוד והחתך בדרך כלל סוגר בפני עצמו בתוך 24 - 48 שעות. הסר מפשק רקמה.
- חזור על אותו ההליך בצד השני של הראש האחר.
- לעבור ההשקיה של הזימים מהרדמה למים סודה טריים להתאושש מהרדמה הדגים. ברגע שתנועות opercular חודש להעביר את הדגים למכלי ניסיון להתאושש במשך לפחות 24 שעות.
3. טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים: אימונוהיסטוכימיה
- ראשית, להכין paraformaldehyde 4% (PFA) במלוח 1x פוספט (PBS; 4 g PFA ב 96 מיליליטר של PBS). PFA אינו מתמוסס בקלות בPBS ב RT. פתרון חום באמבט מים כדי לפזר PFA. לבצע את זה במנדף. ברגע שPFA הוא בפתרון לתת מגניב לפני השימוש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
- לפני הרדמת חסד הדגים וחילוץ רקמת הזימים, מקום 3 - 4 מיליליטר של 4% PFA לתוך בקבוקון נצנץ עבור הסכום כולל של 8 בקבוקוני נצנץ (1 בקבוקון לקשת זימים). בנוסף, תיקח קטן לשקול סירה ולמלא אותו עם 1x PBS. זה ישמש כדי לשטוף את הרקמה לאחר שנכרת. שמור את כל הפתרונות על קרח.
- לאחר חשיפת צבע mitochondrion עשיר קיימאניסוי סיים, להרדים את דג הזהב על ידי הצבתו באמבט מים עם מנת יתר של benzocaine.
- שימוש במלקחיים בוטים להרים operculum בצד אחד של הראש ומספריים מעוקלים לנתק את כל קצה של סל הזימים branchial. בזהירות להרים את הזימים על ידי rakers באמצעות מלקחיים בוטים ולהרים אותם אל מחוץ לחלל opercular. מייד לשטוף את הזימים בקרח קר 1x PBS להסיר benzocaine ודם עודפים.
- הנח את הזימים נכרת בבקבוקונים נפרדים (בקבוקון לכל קשת זימים) מלאים עם 4% PFA ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר קיבוע, לשטוף את PFA העודף ב1X PBS ולמקם את הרקמה בצינור כדור 2 מיליליטר מלא 1.5 מיליליטר של 1% Triton-X על שייקר במשך 6 שעות בRT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה permeabilizes הרקמה. אם כל הזימים הוא גדולים מדי למקום לתוך צינור 2 מ"ל ואז לחתוך את הרקמה לחלקים קטנים מספיק כדי להתאים את טיפול לקיחת צינור שלא לפגוע בחוטים.
- הכן את דילולים נוגדן הראשוניים על ידי miXing 4 μl של פתרון המניות של כל נוגדן ראשוני (כוללת של 8 μl) לμl 992 של 1x PBS. ודא שNKA (תוויות בתאי NKA עשירים) וZn-12 (נוירונים תוויות) נוגדנים ראשוניים הועלו באותו המארח. זה חשוב אם החוקרים להחליט לזהות תת IC ספציפי באותו הזמן שבו הם יצטרכו להשתמש בנוגדנים ראשוניים ומשניים גדלו במינים שונים מארח.
- הסר את פתרון Triton-X וללא שטיפת הרקמות להוסיף 1: 250 דילול (לדלל ב1x PBS) של נוגדן חד שבטי NKA (α-5) כדי לזהות תאי NKA עשירים ונוגדן עצבי ספציפי דג הזברה (Zn-12) כדי לזהות סיבי עצב (נוגדנים ראשוניים) ודגירה על שייקר במשך 6 שעות בRT או O / N ב 4 ° C.
- לשטוף את הנוגדן הראשוני 3 פעמים במשך 3 דקות כל אחד באמצעות 1x PBS. כדי לעשות זאת, להסיר את פתרון הנוגדן הראשוני מהצינור על ידי שאיבתו החוצה בעזרת פיפטה.
- הכן את הנוגדן משני ב1: 200 דילול על ידי ערבוב 5 μl של נוגדנים משני המניה לμl 995 של 1x PBS. החל נוגדנים משני (Alexa פלואוריד 488) ודגירה של 6 שעות בRT או O / N ב 4 ° C על שייקר.
הערה: MitoTracker האדום הוא נרגש ב~ 594 ננומטר אורך גל ויהיה לזרוח אדום. נוגדנים משני שמתרגשים ב~ 488 ננומטר אורך גל והמאיר ירוק יש להשתמש כדי לתייג NKA וZn-12 נוגדנים ראשוניים. - הסר נוגדנים משני עודפים על ידי שטיפת הרקמות 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד (כמתואר בשלב 3.7).
4. הדמיה
- לאחר שטיפה, הר הרקמה בשקופית קעורה להר שלם ההדמיה confocal של תאים וסיבי עצב. לעלות על הרקמה, ראשון למקם אותו בירידה (200 μl) של 1x PBS בשקופית מיקרוסקופ שטוחה. הדבר מבטיח כי הרקמות לא לייבש.
- הפרד את hemibranchs הזימים עם מיקרו-מספריים המעוגלים. מניחים ירידה של 1x PBS וירידה של תקשורת הרכבה לשקופית קעורה.
- הנח את hemibranchs המופרד לשקופית הקעורה עם הקצה המוביל של חוט הלהט פונה כלפי מעלה ומכסה בתלוש לכסות. מורח את הקצוות של להחליק לכסות עם לק על מנת למנוע להחליק את המכסה מההסתובבות ועקירת הרקמה. לאפשר לרקמות ליישב לתחתית של השקופית הקעורה במשך 10 - 15 דקות לפני ההדמיה.
- עבור כל קשת זימים, בחר שישה חוטי זימים באופן אקראי להדמיה, הפקת שש תמונות לקשת זימים. השתמש במיקרוסקופ confocal הקונבנציונלי לתמונת הרקמה על ידי לקיחת 1-3 מיקרומטר פרוסות אופטיות.
הערה: כל תאים קיימים מראש תהיה שכותרתו עם MitoTracker האדום וחיובית לNKA יופיע צהוב בלבד. תאים שיופיעו אדום רק שבבים קיימים מראש שאינו מכילים NKA. כל תא התרבו חדש יהיה רק חיובי לNKA ויופיע ירוק בלבד. סיבי עצב יופיעו ירוקים גם.
ניתוח תמונה 5. לכימות Ionocyte
- לEACנימה הזימים h כי כבר צילמה, לכמת את השבבים והעצבוב הקשורים ידי גלילה בסעיפים של ערימת Z ולספור את מספר שבבי שבשבת וfilamental הנוכחי או לא והאם הם נבדלים זה עתה, קיים מראש, ו / או innervated .
- לכמת את השבבים לחוט להט או לכל אזור (2 מ"מ) של חוט להט. עושה זאת על ידי שימוש בכלי הציור הקשורים לתוכנה ששמשה לרכישת התמונות להתוות lamellae של חוט הלהט המקיף את האזור של חוט הלהט שבו השבבים היו לכמת. רוב תוכנות הדמיה confocal האפשרות לחשב את השטח של אזור שהותווה על התמונה. השתמש באפשרות בתוכנת ההדמיה שמאפשרת לך לעשות את זה כדי לרכוש את השטח.
- מחלקים את השבבים נספרו על ידי האזור מחושב על ידי התוכנה להשיג מידה של שבבים ליחידת שטח (למשל, למ"מ 2).
Representative Results
איור 1 מדגים את שולחן הניתוחים להגדיר (איור 1 א), את המיקום של הדגים במהלך הניתוח (איור 1) ושלושת הצעדים החשובים ביותר לטכניקת צביעת ההפרש הזמן (איור 1 ג). בשלב 1, הדגים נשמרים למשך 30 דקות באמבט מים וסודה של 25 מעלות צלזיוס בחושך. במהלך תקופת 30 דקות, החוקר יכול להכין aliquot צבע mitochondrion העשיר בDMSO אשר מתווסף למים במהלך שלב 2 (איור 1 ג). תקופת הדגירה בשלב 2 מאפשרת ספיגה של הצבע mitochondrion עשיר מהמים לתוך תאי mitochondrion עשיר (כלומר, מעגלים משולבים). הדגים אז יכולים גם לעבור את ההליך מלא בין שתי המדינות denervation או הליך דמה שבו הדגים מורדמים וopercula מניפולציות אבל העצבים יישארו ללא שינוי. הוקם בשלב 3 מייצג חדר התאוששות מסופק עם מים זורמים לדגים שיש eiיס עבר denervation דו-צדדי מלא או הליך "אחיזת עיניים".
לאחר תקופת ההתאוששות, הדגים היו מורדמים והזימים היו נכרת וקבועים אימונוהיסטוכימיה. ההפצה הכוללת והעצבוב של שבבים בנימת הזימים של דגים שעברו הליך "אחיזת עיניים" מתוארת באיור 2. השבבים נמצאים בepithelia filamental כמו גם בבסיס אזורי interlamellar. מופעי איור 2 א שבבים קודם שכותרתו עם צבע mitochondrion העשיר (כלומר, שבבים אלה היו קיימים לפני נהלי denervation / הזיוף בוצעו). איור 2 מציג את סיבי עצב innervating שבבים קיימים מראש ושהוקמו זה עתה (מזוהה על ידי immunoreactivity NKA) של filamental ו epithelia שבשבת. לבסוף, מיזוג של שני התמונות (איור 2 ג) מגלה בבירור שבבים קיימים מראש (מופיע צהוב) ושבבים החדשים (מופיע בירוק).איור 2 ד הוא גרף נציג כימות IC לחוט הלהט המתואר באיור 2 א-ג. בנימה הספציפית הזה, נראה שיש מספר גדול יותר של שבבים התרבו לאחרונה למ"מ 2 מ שבבים קיימים מראש (N = 1). כדי להסיר את המקור של עצבוב branchial חיצוני, עצבי IX ו- X גולגולת (עצבוב חיצוני) נותקו. איור 3 א מציג את אזור הגב של חלל opercular לאחר חוטי הזימים וepithelia מכסה את העצבים הוסרו כדי לחשוף את IX ו- X עצבי גולגולת (מסומנים בספרות רומית) שמשתרעים על פני משני גזעי עצב גדולים למעצבבים את כל ארבע קשתות (איור 3 א); קשתות זימים ממוספרות 1 עד 4. איור 3 ב-E להמחיש denervation סלקטיבית של קשת הזימים הראשונה. קשת הזימים הראשונה innervated על ידי שני עצבי גולגולת IX ו- X (איור 3) אשר ניתן להסירו מבלי להשפיע על העצבוב לשאר of קשתות זימים (איור 3 ג-ה). תוצאות מלאה בין שתי המדינות denervation באובדן הדרגתי של עצבוב חיצוני לחוטי זימים (איורים 4 א-ג). דגי בקרת תערוכת צרור עצבים ברורים אשר משתרע על פני האורך של חוט הלהט (איור 4 א). denervation דו-צדדי מלא הביא כמה אובדן העצבוב חיצוני אחרי 2 ימים של התאוששות (איור 4). היעלמות נוספת של עצבוב חיצוני צוינה לאחר 5 ימים של התאוששות מdenervation (איור 4C). כל עצבוב שנותר לשבבים לאחר 5 ימים של התאוששות כנראה נגזר מעצבים בגוף תא בתוך נימה הזימים (עצבוב פנימי; איור 4C).
איור 1. ניסיוני להגדיר עבור הליך denervation והרצף של צעדים המשמשים בטכניקת צביעת ההפרש זמן. () שולחן ניתוחים שהוקם להליך denervation מראה טנקי הרדמה והתאוששות. (ב) דוגמא של המיקום של דגים מורדמים, מונשמים. (ג) שלבי מפתח בשימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן. בשלב 1, הדגים ממוקם במבוקר טמפרטורת אמבטיה, סטטי סודה מים למשך 30 דקות. צבע mitochondrion העשיר מתווסף בשלב 2 לריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר והדגים מותר לרחוץ בפתרון למינימום של 4 שעות. זרימת מים תופעל מחדש בשלב 3 ובשלב הדגים עוברים גם denervation מלא בין שתי המדינות של הזימים או ניתוח דמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
/>
איור 2. micrographs האור מייצג את טכניקת זמן צביעת ההפרש בדג זהב (התאקלמה עד 25 ° C) 2 ימים לאחר denervation דו-צדדי מלא. (א) חלוקת ionocytes קיים מראש (מעגלים משולבים; חיצים). בנימת זימים אחת מתגלה על ידי צביעת צבע mitochondrion העשיר (B) ההפצה של שבבי עצבים (חדשים וקיימים מראש) וbranchial (חיצים מקווקווים) מתגלה על ידי צביעה עם α-5 וZn-12 נוגדנים, בהתאמה. החיצים מצביעים על שבבים (C) החפיפה של (A) ו- (ב) מבחין שבבים קיימים מראש. (מופיע צהוב; שצוינו על ידי ראשי חץ) משבבים התרבו חדש (מופיע ירוק; מסומנים על ידי חצים). הכנס ב( C) הוא הגדלה של ionocyte קיים מראש innervated. גרף נציג של כימות IC לחוט הלהט מוצג בלוחות (AC) (D). בר N = 1. Scale בלוח (C) הוא 50 מיקרומטר וחל על כל הלוחות."Target =" /ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. נציגי תמונות המתארות את השלבים שונים של עצבוב הזימים. תצוגה הגבי () של חלל buccal מראה את עצבי גולגולת IX ו- X innervating כל 4 זימים הקשתות. קשתות זימים ממוספרות 1-4. חוטי הזימים והרקמה המכסה את העצבים הוסרו כדי להמחיש את העצבוב טוב יותר. (B) רח '1 ו -2 קשתות הזימים nd מופרדים לחשוף את איבר החישה והסניפים של עצבי גולגולת IX ו- X innervating הזימים st 1 קשת. רצף (CE) של תמונות המציגות את denervation סלקטיבית של קשת הזימים st 1 על ידי ניתוק הסניפים של עצבי גולגולת IX ו- X. למחדש סכמטימצגת של עצבוב זימים של דגי חוליות, מתייחס לאיור 1 בMilsom et al 26 קווים הלבנים בתמונות הם השתקפות מים מאורות מיקרוסקופ.; הם לא מגדירים את כל מבנה המורפולוגי. בר סולם בפנל (E) הוא 4 מ"מ והוא חל על כל הפנלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. micrographs אור המתאר את החלוקה ועצבוב של ionocytes בנימה אחת של קשת הזימים -1 בדג זהב התאקלם עד 25 ° C. Ionocytes (מסומן בראשי חץ) הוכתמו נוגדן α-5 ועצבים (מצויינים בחיצי y) הוכתמו נוגדן Zn-12. (חוט להט) גיל של דגי שליטה מראים צרור עצבים מרכזי יש להניח שמקורו בעצבי IX ו- X (העצבוב חיצוני) עם שבשבת נרחבת הסתעפות. חלק מionocytes הצביע גם innervated (להוסיף) חוט להט. (B) זימים 2 ימים לאחר denervation דו-צדדי מלא. חל קיטון של צרור העצבים המרכזי תוך עצבוב שבשבת הופיע שלם ברובו. (C) זימים נימה 5 ימים לאחר denervation דו-צדדי מלא הוכחה כי עצבוב חיצוני היה במידה רבה נעדרים. ניתוח איכותי עולה כי denervation דו-צדדי מלא גורם להשפלה של עצבוב הזימים החיצוניים, תוך שמירה על עצבים עם גופי תא בנימת הזימים (עצבוב פנימי) יצירת רשת של עצבים באמצעות חוט הלהט ולlamellae. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
טכניקת צביעת ההפרש הזמן יכולה להיות כלי שימושי כדי להבין את הרגולציה הדינמית של ספיגת יון ולבחון חלוקה מחדש הזמנית של מעגלים משולבים בepithelia הזימים. למרות שהליך פשוט, יש מספר נקודות מפתח שהם חיוניים להצלחה של טכניקת צביעת ההפרש הזמן. דג הזהב צריך להיות חשוף לצבע mitochondrion העשיר לזמן המוקצב בפרוטוקול. חשיפות קצרות יותר יגרמו לספיגה ירודה של הצבע על ידי תאי mitochondrion עשיר (כלומר, ionocytes). במהלך קיבעון, רקמת הזימים יש להוציא במהירות והמשיכה בחושך כדי למנוע הלבנת תמונה. הרקמה חייבת להיות מעובד להדמיה בתוך 2 שבועות של קיבעון. במהלך הליך חתך עצב דו-צדדי להבטיח כי הדגים הוא גם מורדמים; העצבים וכלי דם מזוהים בבירור; והדגים יתחדש פונקצית opercular מלאה לפני שהוא עבר לטנק התאוששות.
"> סביבת FW מציגה דגים עם האתגר הכפול של איזון הפסדי יון פסיביים ורווח מים האוסמוטי 14. איזון הפסדי יון פסיביים מתרחש באמצעות הספיגה הפעילה של מלח על פני המעגלים המשולבים המקומיים לfilamental וepithelia שבשבת שבו הם יכולים ליצור קשר ישיר עם הסביבה החיצונית 2,4,8,9,16. עם זאת, המיקום של המעגלים המשולבים בזימים אינו סטטי. בשלושת העשורים האחרונים מספר מחקרים הראו כי מספר מיני דגי FW, כאשר הוא מתמודד עם אתגר יוני ו / או טמפרטורה, להפיץ מחדש שבבי branchial מחוט הלהט או הבסיס של lamella לאזורי דיסטלי יותר של lamella 1,2,4,5,17-21. חלוקה מחדש כזה עשוי להגדיל את העובי של lamellae ש יכול להתפשר העברת גז (O 2, CO 2) על פני epithelia הזימים 22. חוקרים השתמשו בטכניקת צביעת ההפרש הזמן המתוארת בכתב היד הזה כדי לעקוב אחר רילוקיישן וemergencדואר של שבבים חדשים על epithelia הזימים בתנאים אלה שונים ניסיוניים (איור 1 ג) 1,4,5.הזימים, ומן הסתם שבבי branchial, מעוצבבים על ידי עצבי גולגולת IX ו- X 7,23-25. עצבים אלה לשאת שני efferent ותשומות מביא ומהזימים, בהתאמה. הם ממוקמים בצד הגב של החלל buccal מאחורי קשת הזימים 4 th. הנגישות של עצבים ואת הקלות שבה ניתן לבצע את הליך denervation הדו-צדדי היא מינים ספציפי. בפורל, למשל, את האנטומיה המחודדת והשטוחה של הראש מאפשרת לעצבים לשכב במישור אחד מאחורי קשת הזימים 4 th מתחת לשכבה דקה של רקמה. זה הופך את העצבים גלויים ונגישים לחוקר לבצע את הליך denervation. בניגוד לכך, יש לי דג זהב חוטם קצר וראש עגול. עצבי גולגולת IX ו- X של דג זהב לשקר עמוקים יותר לתוך si הגבדה של החלל לאחר קשת הזימים 4 th הכובש מישורים שונים. נטייה זו מגבילה את הנגישות לעצבים ודורשת גישה זהירה יותר לזהות ולנתק את העצבים המתאימים. מטרתו של נוהל denervation היא להסיר קלט מביא וefferent חושי ומהזימים, בהתאמה. Denervation של קשתות זימים גם יכול להיות בשילוב עם ניסויי שטף יונים באמצעות רדיואיזוטופים (למשל, 22 Na). טכניקות אלה יכולים לשמש במקביל ללמוד את תרומתם של קלט עצבים על תנועת יונים על פני epithelia הזימים. מגבלה נוספת להליך denervation היא חוסר היכולת להבחין בין נוירונים חושיים ומוטוריים, ובכך, כאשר ניתוק העצב צרור זה אפשרי ששני הסוגים של עצבוב מתבצעים הוסרו. ניתוק כל הנוירונים מוטוריים עשויה להשפיע על הזימים ותנועת opercular של הדגים. כך בעת ביצוע ניסויי denervation זימים חשוב גם כדי לפקח על אוורור לאחרדגים התאוששו מההליך כדי להבטיח שיש תנועת זימים מספיקה לשני גז וחילוף יונים.
הפרוטוקולים שתוארו בבעלי החיים המבוגרים כתב היד הזה שימוש המשיכו אור 00:12: מחזור כהה וכדורי מזון המסחריים fed. ניתן לשנות שיטות אלה בכמה דרכים. ראשית, תקופת ההחלמה לאחר חשיפת צבע mitochondrion העשיר יכולה להיות מותאמת לדרישות של הפרוטוקול של החוקר (לדוגמא, 1, 3, 5, או 14 ימים). התקופה הארוכה ביותר של התאוששות לאחר חשיפת צבע mitochondrion העשיר במעבדה כבר 14 ימים 4,5. לא הייתה ירידה משמעותית בעוצמת הקרינה של הצבע mitochondrion העשיר אחרי 14 ימים של התאוששות. שנית, השימוש בα-5 הנוגדן הראשוני מוגבל לזיהוי רק תאי NKA העשיר ואינו מבחינים בין תת-הסוגים השונים של שבבי branchial. למרבה המזל, בדג זהב נקבע כי רוב השבבים שניהם mitochondrיון-עשיר (תווית עם MitoTracker) וNKA עשיר (תווית עם α-5) תאים אשר לא יכול להיות מקרה בכל מיני הדגים 4,27. ניסויים עתידיים יכולים להתמקד בבעקבות חלוקה מחדש הזמנית של תת IC הספציפי באמצעות נוגדנים מכוונים במיוחד נגד מגוון רחב של ערוצים, משאבות ומחליפות (לדוגמא, nhe, H + משאבה). מחקרים קודמים מצאו כי הרוב המכריע של ionocytes מוכתם בתערוכת צבע mitochondrion העשיר immunoreactivity NKA 4. עצבוב של המעגלים המשולבים יכול להיות מזוהה על ידי שימוש בנוגדן ראשוני נגד אנטיגן נגזר דג הזברה נוירון הספציפי (Zn-12). במחקר זה, α-5 ו- Zn 12 נוגדנים ראשוניים התגלו על ידי שימוש באותו נוגדנים משני (Alexa פלואוריד 488) לשניהם. הגבלה זו נובעת משני הנוגדנים העיקריים שהועלו במארח עכבר ולהתגבר על ידי העובדה שתאי NKA עשיר ונוירונים ניתן להבחין מורפולוגית למרות שהם לזרוח באותו צבע. צביעה רציפהעם נוגדנים שונים משני (למשל, α-5 הראשון עם אלקסה פלואוריד 488 אז Zn-12 עם אלקסה פלואוריד 594) יכול לשמש גם כדי למנוע את הבעיה של שיש שני סמני fluorescing באותו הצבע. לבסוף, פרוטוקול חתך עצב דו-צדדי המלא יכול להיות שונה כדי למקד את העצבים לקשתות זימים ספציפיים. לדוגמא, חתך עצב סלקטיבית יכול להתבצע על קשת הזימים הראשונה בעדינות על ידי הפרדת קשתות הזימים הראשונות ושנייה כדי לחשוף את העצבים שמוביל לקשת הזימים הראשונה בסוף הגב של סל הזימים (איור 2 ב-E). טכניקת ההפרש הזמן יכולה להיות מיושמת גם כדי ללמוד את חלוקת ionocytes בדגי דג הזברה זחל כפי שהם מפתחים ומעברי תחבורת יון מהעור לזימים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Katoh, F., Kaneko, T. Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique. J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).
- Perry, S. F. Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).
- Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus. J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).
- Mitrovic, D., Perry, S. F. The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus). J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).
- Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus. J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).
- Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish. J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).
- Laurent, P., Hebibi, N. Gill morphometry and fish osmoregulation. Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).
- Perry, S. F., Laurent, P. Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell. J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).
- Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste. Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).
- Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).
- Krogh, A. The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).
- Nilsson, G. E. Innervation and pharmacology of the gills. Fish Physiology. Randall, D. J., Hoar, W. S. , Academic Press. Orlando, FL. 185-272 (1984).
- Sundin, L., Nilsson, S. Branchial innervation. J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).
- Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill). Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).
- Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).
- Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer. Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).
- Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus). J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).
- Chou, M. Y., et al. Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses. J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).
- Kaneko, T., Katoh, F. Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference. Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).
- Ouattara, N., et al. Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron. Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).
- Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss. J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).
- Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout. Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).
- Jonz, M. G., Nurse, C. A. New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate. J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).
- Jonz, M. G., Zaccone, G. Nervous control of the gills. Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).
- Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui). J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).
- Hwang, P., Lee, T. New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).
