This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.
Branchial ionocytes (IC) är de funktionella enheter för jonisk reglering i fisk. Hos vuxna, de finns på filamental och lamellär epitel av gill där de transport joner såsom Na +, Cl – och Ca2 + via en mängd olika jonkanaler, pumpar och värmeväxlare. Den teleost gill är extrinsically innerveras av den ansikts (VI), glossofaryngeal (IX) och vagus (X) nerver. De IX och X nerver är också den yttre källan branchial IC innervation. Här används två tekniker som används för att studera innervation, proliferation och distribution av IC beskrivna: ett tidsdifferentialfärgningsteknik och en fullständig bilateral gill denervering teknik. I korthet är guldfisk utsätts för en vital mitokondrien specifik färgämne (t.ex. MitoTracker Röd) vilka etiketter (röd fluorescens) pre-existerande IC. Fisk antingen fick återhämta i 3 – 5 dagar eller omedelbart genomgick en fullständig bilateral gill denervering. Efter 3 – 5 dagars återhämtning, gills skördas och fastställts för immunohistokemi. Vävnaden färgades sedan med ett α-5 primär antikropp (mål Na + / K + ATPas innehållande celler) i samverkan med en sekundär antikropp som märker alla (både nya och existerande) IC grönt. Använda konfokal avbildning, visades att befintliga IC verkar gula (märkt med både en livskraftig mitokondrien specifik färgämne och α-5) och nya IC verkar grönt (märkt med α-5 endast). Båda teknikerna som används i tandem kan tillämpas för att studera innervation, spridning och fördelning av IC på gill glöd när fisken exponeras för miljöutmaningar.
IC är den funktionella enheten för jonisk reglering i fisk och finns på epitelytor hos gälar trådar och lameller 4,6-8,10. Även om en mångfald undertyper har beskrivits som besitter unika egenskaper, många av de IC kännetecknas av en hög täthet av mitokondrier (alltså de är också kända som Mitochondrion rika celler) och / eller ett överflöd av enzymet Na + / K + ATPas (NKA). Typiskt är dessa IC hus en mängd andra pumpar, jonkanaler och växlarna involverade i jon reglering (t.ex. Na + / H + växlare, Na + / Cl – sam-transportör, H + pump) 2,10,11. Den omfördelning och spridning av IC som en kompensationsmekanism är central för att upprätthålla jon homeostas särskilt under jonisk stress (t.ex. exponering för jon fattiga vatten) 4,8,9.
Denna studie beskriver en tidsskillnad färgning tekque 1 identifiera nya förökade ionocytes (IC) i fisk gälar. Denna teknik är kopplad till en fullständig bilateral denervering av gill bågar. Goldfish (Carassius auratus), de arter som används i dessa studier, är väl lämpad för att studera spridningen av bottengarn epitelceller eftersom de har en märklig förmåga att strukturellt omforma sina gälar 2. Gill remodeling hänvisar till tillväxt eller tillbakadragning av en interlamellär cellmassa (ILCM) när fisken (normalt hålles vid 15-30 ° C) är acklimatiserade till kallt vatten (<15 ° C) eller hypoxi, respektive 3. Tidigare studier med hjälp av tidsskillnaden färgningsteknik på guldfisk har fokuserat på omfördelning, innervation och spridning av IC på gill i samband med gill remodeling 4,5. Katoh och Kaneko 1 utvecklat denna nya teknik för att studera omvandlingen och ersättning av branchial IC i killifish (Fundulus heteroclitus) överfrred från havsvatten (SW) till färskvatten (FW). I denna studie ligger fokus på spridningen och innervation av IC i guldfisk acklimatiserad till 25 ° C.
Använda tidsskillnaden färgningsteknik visades att, inom ramen för gäl ombyggnad, guldfisk upprätthålla ett konstant antal IC under hypoxisk exponering och efterföljande normoxisk återhämtning, dock andelen innerverade celler minskade under normoxisk återhämtningsperioden 5. Det föreslogs mer än 70 år sedan som joniska upptagsmekanismer i fisk är under neural styrning 12. Den teleost gill innerveras av de ansiktsbehandling (VII), glossofaryngeal (IX) och vagus (X) nerver också kallas de "branchial nerverna" 13,14. Studier av Jonz och sjuksköterska (2003) på sebrafisk (Danio rerio) gill innervation visade att ursprunget till innervation är yttre (cellkroppen av nervfibrer är yttre till gill) samt inneboende (cellkroppnervfibrer är inneboende i gill). Samma författare visade också att branchial IC är extrinsically innervated 7.
I denna studie var tiden differentialfärgningsteknik i kombination med full bilaterala gill denervering används för att undersöka spridningen av IC som saknar yttre innervation i guldfisk. Full bilaterala gill denervering avser avskilja kranialnerver IX och X. Dessa två tillvägagångssätt är möjliga i guldfisk eftersom deras relativt stora storlek (30-200 g) förenklar den känsliga kirurgiska ingrepp, och ionocytes lätt genom användning av normala immun histokemisk tekniker. I föreliggande studie var IC visualiserades med användning av en vital mitokondrien specifikt färgämne (t.ex., MitoTracker Red) eller en primär antikropp mot α-subenheten av Na + / K + -ATPas (α-5; Develop Studies Hybridoma Bank, University Iowa, Iowa City IA). Protokollet ger en enkel metod för att visualisera och analysera omfördelning och spridning av IC på fisken gill.
Tiden differentialfärgningsteknik kan vara ett användbart verktyg för att förstå den dynamiska reglering av jon upptag och undersöka den tidsmässiga omfördelning av IC i gill epitel. Även en enkel procedur, det finns ett antal viktiga punkter som är avgörande för framgången för tidsskillnaden färgningsteknik. Guldfisk måste utsättas för mitokondrien rika färgämne för den tid som avsatts i protokollet. Kortare exponeringar kommer att resultera i dålig upptag av färgämnet från mitokondrien rika celler (dvs ionocytes). Under fixeringen måste gäl vävnad excideras snabbt och hållas i mörker för att undvika fotoblekning. Vävnaden måste bearbetas för avbildning inom 2 veckor fixering. Under det bilaterala nervsektioneförfarandet se till att fisken är väl bedövad; nerver och blodkärl är tydligt identifierade; och fisken återupptar fullt opercular funktionen innan den flyttas till en återvinningstank.
"> Den FW miljö presen fisk med den dubbla utmaningen att balansera passiva jon förluster och osmotisk vatten vinna 14. Avvägningen av passiva jon förluster sker via aktiva upptaget av salt över IC som är lokaliserade till filamental och lamellär epitel där de kan ta direkt kontakt med den yttre miljön 2,4,8,9,16. Dock är inte statisk placeringen av IC på gill. Under de senaste tre decennierna ett antal studier har visat att flera FW fiskarter, när man står inför med en jonisk och / eller temperatur utmaning, omfördela branchial IC från filamentet eller basen av lamell till de mer distala regionerna av lamellen 1,2,4,5,17-21. Sådan omfördelning kan öka tjockleken på lamellerna som kan äventyra gas överföring (O 2, CO 2) över gill epitel 22. Forskare har använt tiden differentialfärgningsteknik som beskrivs i detta manuskript för att spåra flytten och emergence av nya IC på gill epitel under dessa olika experimentella förhållanden (Figur 1C) 1,4,5.Gälarna, och förmodligen de branchial IC, är innerveras av IX och X kranialnerver 7,23-25. Dessa nerver bära både efferent och afferenta ingångar till och från Gill, respektive. De ligger på ryggsidan av munhålan bakom 4: e gill båge. Tillgängligheten av nerver och den lätthet med vilken kan utföras den bilaterala denervering förfarandet är artspecifik. I öring, till exempel, den spetsiga och tillplattas anatomi av huvudet tillåter för nerverna att ligga i ett enda plan bakom 4: e gäl båge under ett tunt lager av vävnad. Detta gör nerverna synliga och lättillgängliga för forskaren att utföra denervering förfarandet. Däremot guldfisk ha en kortare nos och en rundare huvud. De IX och X kranialnerver av guldfisk ligga djupare in i rygg side av hålrummet efter den 4: e gill arch ockuperar olika plan. Denna orientering begränsar lättillgänglighet på nerverna och kräver en mer noggrann metod för att identifiera och avskilja lämpliga nerverna. Syftet med denervering förfarandet är att avlägsna sensorisk afferent och efferent ingång till och från Gill, respektive. Denervation av gäl bågarna kan även kopplas med jonflöde experiment med användning av radioisotoper (t.ex. 22 Na). Dessa tekniker kan användas i tandem för att studera bidraget av nervös ingång på jon rörelse över gäl epitel. En annan begränsning till denervering förfarandet är oförmågan att skilja mellan sensoriska och motoriska nervceller, alltså när bryta nerven bunta det är möjligt att båda typerna av innervation tas bort. Avskilja eventuella motoriska nervceller kan påverka gill och opercular rörelse fisken. Således när du utför bottengarn denervering experiment är det viktigt att även övervaka ventilation efterfisk har återhämtat sig från det förfarande för att se till att det finns tillräckligt med gill rörlighet för både gas och jonbyte.
Protokollen i detta manuskript bruk vuxna djur som hålls på en 00:12 ljus: mörker-cykel och utfodrade kommersiella livsmedel pellets. Dessa metoder kan modifieras på flera sätt. Först kan återhämtningsperioden efter mitokondrien rika färgexponering anpassas till de krav som forskarens protokoll (t.ex. 1, 3, 5, eller 14 dagar). Den längsta period av återhämtning efter mitokondrien rika färgexponering i labbet har varit 14 dagar 4,5. Det var inte en signifikant minskning i intensiteten av fluorescens av mitokondrien rika färgämne efter 14 dagars återhämtning. För det andra, är användningen av α-5 primär antikropp begränsad till endast identifiera NKA-rika celler och skiljer inte mellan de olika subtyper av branchial IC. Lyckligtvis i guldfisk konstaterades att majoriteten av IC är båda mitochondrjon-rika (etikett med MitoTracker) och NKA-rika (etikett med α-5) celler som kanske inte fallet i alla fiskarter 4,27. Framtida experiment kan fokusera på att följa tids omfördelning av specifika IC subtyper med hjälp av antikroppar riktade specifikt mot en mängd olika kanaler, pumpar och värmeväxlare (t.ex. NHE, H + pump). Tidigare studier fann att majoriteten av ionocytes färgade med mitokondrien rika färgämne uppvisar NKA immunoreaktivitet 4. Innervation av IC kan detekteras med hjälp av en primär antikropp mot zebrafisk-härledda neuron-specifikt antigen (zn-12). I denna studie, α-5 och Zn-12 primära antikroppar detekterades genom användning av samma sekundär antikropp (Alexa Fluor 488) för båda. Denna begränsning beror på både primära antikroppar höjs i en musvärd och övervinns av det faktum att NKA-rika celler och nervceller kan särskiljas morfologiskt trots att de fluorescerar i samma färg. Sekventiell färgningmed olika sekundära antikroppar (t.ex., första α-5 med Alexa Fluor 488 sedan zn-12 med Alexa Fluor 594) kan också användas för att eliminera problemet med att ha båda markörerna fluorescerande samma färg. Slutligen kan det fullständiga bilaterala nervsektioneprotokoll modifieras för att rikta nerver till specifika gäl valv. Till exempel kan selektiv nervsektione utföras på det första gill bågen genom att försiktigt separera det första och andra gäl valv att exponera nerver som leder till den första gill bågen på den dorsala änden av glll korgen (Figur 2B-E). Tidsdifferential Tekniken kan också användas för att studera fördelningen av ionocytes i larvzebrafisk fisk som de utvecklas och jon transport övergångar från huden till gill.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |