Abstract
Många progressiva neurologiska sjukdomar hos människor, såsom epilepsi, kräver prekliniska djurmodeller som långsamt utvecklar sjukdomen för att testa interventioner i olika skeden av sjukdomsprocessen. Dessa djurmodeller är särskilt svåra att genomföra i omogna gnagare, en klassisk modellorganism för laboratoriestudie av dessa sjukdomar. Inspelning kontinuerlig EEG i unga djurmodeller av anfall och andra neurologiska sjukdomar utgör en teknisk utmaning på grund av den lilla fysiska storleken av unga gnagare och deras beroende av dammen före avvänjning. Därför finns det inte bara ett tydligt behov av att förbättra preklinisk forskning som bättre kommer att identifiera de behandlingar som lämpar sig för översättning till kliniken, men också ett behov av nya apparater som kan spela in kontinuerligt EEG i omogna gnagare. Här beskriver vi tekniken bakom och demonstrera användningen av en ny miniatyr telemetrisystem, speciellt konstruerad för användning i omogna råttor or möss, som också är effektiva för användning hos vuxna djur.
Introduction
Den äldsta - och fortfarande den mest använda - teknik för inspelning av biopotentialer i hjärnan är ett elektroencefalogram (EEG). Det används kliniskt för neurologiska abnormiteter, inklusive beslag detektering 1, lokalisering av anfalls foci två, och diagnos av hjärnskakning 3,4. Denna teknik används också ofta för att ge grundläggande information om mekanismerna för sömn och för att diagnostisera sömnstörningar 5,6.
Liksom i den kliniska diagnosen av epilepsier har EEG blivit en nödvändighet för translationell forskning i djurmodeller av både genetiska och förvärvade epilepsi. I nuvarande forskningsansökningar, "fast" eller "bundna" inspelningar är standard, och är rutinmässigt hos vuxna gnagare i flera veckor i taget 7. Men elektriskt brus, rörelse artefakter, och risken för att bundna djur ska skada sig genom att dra i kabeln har långa compromised dessa experiment. Således, för att förbättra experimentella betingelser och träffsäkerhet, måste vi utveckla ny teknik som gör det möjligt för eliminering av kabelgränssnitt mellan djuret och instrumentering. Den mest uppenbara utvecklingsområde är utformningen och genomförandet av telemetrisystem som möjliggör högkvalitativa inspelningar, samtidigt som en lång livslängd och minimera obehag för djur. Att minska den fysiska storleken på dessa enheter kommer att göra det möjligt för translationell forskning i neonatala och juvenila gnagarmodeller av neurologiska sjukdomar.
Låg kanal-count EEG inspelningar i råttor används i stor utsträckning för att utveckla nya behandlingar för att undertrycka epileptiska anfall kan översättningen till människor. Inspelningar från en eller flera platser för en längre period öppna många möjligheter för användning av gnagarmodeller av epilepsi i translationell forskning. Mycket av den samtida forskningen på detta område som mål att blockera uppkomsten av kronisk Seizgärder eller utveckling av epilepsi (dvs epileptogenes), och sådana forskningsinsatser kräver omfattande om inte kontinuerlig EEG-övervakning för att analysera effekten av den föreslagna terapin 8; en liten, enkel, telemetrisystem med en, två eller fyra kanaler som är verksamma mellan 0,1-100 Hz per kanal kommer starkt att främja denna typ av translationell forskning. Elektro anfall inträffar ofta med minimala beteenden (förvisso utan konvulsioner), vilket begränsar nyttan av analyser baserade på beteende anfall. Strategin att kombinera EEG inspelning och samtidig videoövervakning tillåter en möjlighet att fånga varje beslag; och dessutom kan dessa analytiska metoder kan kvantitativ bedömning av Interiktal spikar som förekommer i epileptisk hjärn mellan "ictal" (eller beslag) händelser 9. Dessutom, som den trådlösa tekniken är förmågan att få fortsatt hög kvalitet till låg artefakt EEG inspelningar i allmänhetöverlägsen, kommer att möjliggöra utveckling av användning av datorbaserade algoritmer för att studera specifika EEG-vågformer (t.ex. theta, gamma), samt automatisk detektering av anfall, vilket avsevärt minskar arbetsbördan för försöks.
Det primära preklinisk modell för att studera kronisk epilepsi efter hjärnskada är vuxen råtta eller mus, antingen genom en kemo-konvulsiv (dvs kaininsyra eller pilokarpin) eller elektriskt inducerad status epilepticus (SE), som följs av kronisk epilepsi. Under dessa förhållanden kan de svåra kramper i samband med SE eller senare anfall i epileptiska djur leda till skador från djur sönder eller dra tjudret och lossa skruvarna som håller fäst av headcap. I slutändan är det detta problem som oftast avslutar dessa experiment, och ändå behovet av att få långsiktiga högupplösta EEG poster för experiment som syftar till att utveckla nya behandlingar för kroniskepilepsi är av största vikt. Dessutom, bostäder, övervakning och analys av data från långtids implanterade djur är en stor investering i både direkta kostnader och utredare tid; Därför kan förtida uppsägning av experimentet leda till betydande kostnader för forskarna. Eftersom dessa modeller av epilepsi framsteg, anfallen blir oftast vanligare och allvarligare 10-12, vilket ökar sannolikheten för att djuren skadas, liksom deras användbarhet för att utveckla nya behandlingar blir störst. Dessa djur kan rutinmässigt utveckla dussintals krampanfall per dag, ofta förekommer i kluster 13.
Förmodligen en av de viktigaste utvecklingen inom biomedicinsk vetenskap har varit användningen av genmålsökning i musmodeller. Detta tillvägagångssätt har gjort det möjligt, och kommer att fortsätta att tillåta, utveckling av djurmodeller av genetisk epilepsi som återger verkliga mänskliga syndrom 14-16. Genetiska manipulationer kan utföras somproof-of-principen behandlingar för att undertrycka epileptiska anfall eller till och med blockera utvecklingen av epilepsi efter hjärnskada 17-20. Denna typ av forskning skulle gynnas dramatiskt från förmågan att utföra hög genomströmning kontinuerlig registrering av EEG. För närvarande är det möjligt att spela in från möss med antingen bundna eller telemetrisystem; Men utmaningarna att få hög kvalitet, artefakt fria inspelningar är betydligt svårare än råttor, och ofta detta kräver olika former av ryggsäckar att möss försöker ständigt att ta bort. Stress kan öka anfallen blir allvarligare, frekvens och / eller längd, och därmed skulle i slutändan ändra epilepsi av försöksdjuren, vilket confounding studien. En liten, lätt, låg profil miniatyr telemetrisystem kommer att underlätta inspelning av långsiktiga EEG från genetiska musmodeller av mänskliga sjukdomar.
Förutom de ovan beskrivna problemen, inspelning EEG i omogna gnagarmodells sjukdoms har sin egen unika uppsättning av utmaningar. Omogna djur kan väga så lite som 6 g (P8 mus) till 17 g (P6 råtta). Det är nästan omöjligt att göra serieflerdagars bundna EEG inspelningar på grund av ökad stress från tjuder och oförmåga att tillåta naturlig uppfödning av valpen av dammen. Tills djur är avvanda, måste de stanna kvar i vården av dammen. Dammen är benägna att förstöra alla externalisekopplingsanordningen på valpen, avsluta valpen, och i vissa fall avsluta hela kullen. Dessutom gör omogna gnagare skallen det svårt att montera någon elektrod piedestal till skallen med mekanisk integritet. Dessa utmaningar, som är unika för omogna gnagare, kräver en ny lösning för att göra robust, långsiktiga elektrografiska inspelningar. Här fokuserar vi på att visa implantation och registrering av EEG med hjälp av en ny miniatyr trådlös sändare och presentera tre proof-of-principen experiment som exempel för användning av miniatyr trådlösa telemetrisystem: 1) immogna råttungar modell av hypoxi-ischemi, 2) vuxna möss som behandlats med DFP för att inducera status epilepticus och efterföljande spontana anfall, och 3) genetisk modell av vaskulära cavernous missbildningar som resulterar i kramper och död hos vuxna möss.
Den miniatyr trådlösa telemetrisystem har utformats för att uppfylla fyra huvudkrav: (1) minimalinvasiv kirurgisk implantation; (2) kompatibilitet för bostäder av gnagare valpar med dammen och syskon; (3) låg strömförbrukning enhet, vilket möjliggör månader av kontinuerlig övervakning utan kirurgisk re-implantation; och (4) möjlighet att spela in högkvalitativa EEG-vågformer med minimala rörelseartefakter. Den trådlösa sändaren väger <0,6, 2,3 och 4 g och är <0,3, 0,8 och 1,4 cm 3 beroende på batteriet med ett fotavtryck av 5 x 7, 7 x 9, eller 7 x 12 mm som lätt monteras till skallen av djuret med cyanoakrylat gel. Inga ben skruv ankare behövs för att säkert fästa enheten tillskallen, att minska antalet hål som måste borras i skallen och operationstid. Enheten är kapabel att förstärka två kanaler EEG eller lokala fält potentialer från djupa hjärnstrukturer, såsom hippocampus, för över 2 veckor, 2 månader eller 6 månader i denna konfiguration. Den lilla storleken på den trådlösa sändaren minskar infektionsrisken ökar djurens rörlighet, och i slutändan minskar sjuklighet och dödlighet som annars ökar tid, pengar, och antalet djur som behövs för ett experiment. Samtliga elektroniken och batteriet är ingjuten i medicinsk kvalitet epoxi som gör enheten vattentät och tuff, förhindra dammen från att tugga på sändaren som annars skulle kunna göra enheten obrukbar. Radiofrekvenssändare Till skillnad, använder telemetrisystemet kapacitiv koppling mellan sändare och en mottagarantenn som sitter nedanför djurbur, så att användaren kan hålla djuren i standard gnagare huset. Flera kanaler för recording medger registrering av multimodala biopotentialer, såsom elektrokardiogram och elektroencefalogram. Djurmodeller av komorbiditeter kommer att gynnas av möjligheten att spela in biopotentialer under uppförande 21-23. Kombinera beteende med EEG-övervakning kommer att ge forskare med ett bättre verktyg för forskning och prekliniska studier.
Protocol
Följ institutionella riktlinjer för djuromsorg för kirurgisk verktygs sterilisering, och ändra protokollet som behövs för att följa de riktlinjer och få godkännande av institutionens Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Kirurgisk förberedelse
- Rengör och förbereda sändaren för att säkerställa en säker och steril kirurgi. Ta bort sändaren från sin antistatiska förpackning och antingen spray eller blöt i 70% etanol. Skölj sändare med steril saltlösning och plats mellan sterila bomullssvamp indränkt i steril koksaltlösning eller hålla nedsänkt i steril saltlösning.
- Samla och sterilisera de verktyg som krävs för kirurgi; ångautoklav för sterilisering. Se tabell över material och reagens för listan över kirurgiska verktyg.
2. Kirurgisk implantation
- Söva djur och upprätthålla anestesi enligt lACUC-godkänt protokoll. Vid initiering och under surgery kontrollera toe-nypa reflex varje 15 min. Bristen på svar visar tillräcklig nivå av anestesi.
- För valpar, använder anestesi med isofluran (4%) med O 2 (100%). För vuxna, använder ketamin (100 mg / kg) med xylazin (10 mg / kg).
- Fix position i stereotaktisk ram. Placera öron bar tips i hörselgången. Inte alltför strama örat barer skallen är mycket mjuk i unga råttungar. Säkra anestesi noskon.
- Håll djuret varmt under operation genom att placera den på värmedyna inställd på 37 ° C. Hos vuxna djur, gäller smörj salva för ögonen på djuret.
- Sterilisera snitt webbplats och bibehålla sterila operationsområdet.
- Tvätta hårbotten med alternerande applikationer av 70% etanol och Betadine. Börja i mitten av hårbotten och göra allt större koncentriska cirklar.
- Täck djuret med drapering och genomföra operationen över draperad djur. Behåll Sterile kirurgiska området genom att rikta den kirurgiska set-up med sterila dukar, sprututrustning med 70% etanol.
- Använd sterila kirurghandskar och klänning (eller som krävs av institutionen). För att bidra till att upprätthålla sterila området, använda en kirurgisk assistent.
- Gör ett snitt i hårbotten av djuret strax bakom ögonen längs mittlinjen, ca 2 cm. Var försiktig när du sätter skalpell som skallen är fortfarande mycket mjuk i unga råttungar. Gör ett enda snitt så snittet blöder mindre, och läker snabbare.
- Exponera skallen. Förbered en ren och torr plats för att maximera bindningen mellan sändaren och skallben. Använd aneurism klipp att förstå hårbotten.
- Dra försiktigt hårbotten bort från mittlinjen på fyra hörn. Leta efter anatomiska landmärken som bregma och lambda i skallen. Kom ihåg skallben inte smält i djur i denna ålder. Använd Paxinos atlas över stereotaktiska koordinater för att hitta rätt plats för borrhålet.
- Använd en Dremel-typ verktyg med en Burr-typ borr. Skapa två burr hål i inspelnings önskade lägen med hålen är större än 300 mikrometer i diameter. Placera borrhålet för referenselektroden över cerebellum bakom lambda av skallen.
- Se till att kablarna på sändaren är i linje med Burr hål. Om elektrodtrådarna inte är i linje, är lim kontaminering av elektroderna sannolikt och kommer att resultera i dålig signal. Rikta in kablarna, kontrollera passform sändaren och böjer försiktigt elektroderna att rada upp de avsedda platser för grad hål.
- Trim elektrod leder. Använd kirurgiska sax för att trimma elektroderna till önskad längd. Elektroddjup är viktigt för den typ av registrering krävs för experimentet (dvs, placera elektroderna över dura för EEG inspelningar eller använda stereotaktiska koordinater för definierade hjärnstrukturer).
- Frikostigt applicera cyanoakrylat på basen av sändaren To täcka området och se till att undvika att belägga elektroderna. Cyanoakrylatlim är en elektrisk isolator, kontaminerande elektroder med lim kommer att resultera i ingen signal.
- Om du spelar in från djupa hjärnstrukturer, montera sändaren på kanylhållaren och placera den i stereotaxic armen för z-axelkontrollen. Sänk sändaren med hjälp av stereotaktisk arm lämpligt djup och placera cyanoakrylat gel runt sändaren.
- Helt torr skalle innan du placerar sändaren att säkerställa en stark limfogen. Applicera sändare belagd med cyanoakrylat till skallen. Var noga med att rikta in elektroder med motsvarande burr hål.
- Försök att undvika skadliga stora kärlstrukturer. Håll sändaren på plats med lätt tryck under en minut. Använd lätt tryck för bildning av en stark bindning mellan sändaren och skallen.
- Applicera ytterligare cyanoakrylat, tillräckligt för att helt täta sändare / skull gränssnitt. För att säkerställa agood passform och stark bindning, maximera ytarean hos det lim som kommer i kontakt med skallen. Applicera cyanoakrylatlim i en cirkel runt sändaren, vilket gör att både skalle och vägg sändaren omfattas.
- Applicera kemisk accelerator (0,1 ml) genom en spruta runt cyanoakrylat vid basen av den implanterade sändaren. Använd accelerator sparsamt, noga med att inte tillämpas på intilliggande vävnad.
Anm: Kemisk acceleration av cyanoakrylat härdning säkerställer att den starka bindningen mellan sändaren och skallen bildas snabbt. Cyanoakrylat accelerator är användbar för hastighets härdning av adhesiv, men är inte nödvändigt. - Ta bort accelerator genom att tvätta området noggrant med steril koksaltlösning. Cyanoakrylat accelerator kan orsaka vävnadsirritation om inte tvättas bort från området för snittet. Att tvätta området, fylla en 1,0 ml spruta med steril saltlösning och bevattna området genom en sprutnål. Generellt 0,5 ml koksaltlösning är tillräckligt för att tvätta bortgaspedalen.
- Sutur huden runt basen av sändaren, men täcker inte sändaren. Överst på sändaren måste vara över huden för att effektivt överföra neurala signaler. Huden ska vara någorlunda tätt runt sändaren och lim runt enheten. Använd Vicryl eller silkessutur (mjuk tråd); huden omogna djur är mjuk och lätt skadas om mjuka suturer inte används. För vuxna djur, använda suturmaterialet.
- Ta bort djuret från stereotaktisk ram och placera på uppvärmd filt för återvinning.
- Se till djur är varma (37 ° C) och öppenvård (dvs helt återställd) innan han återvände till dammen. Se till att djuret är hydrerad genom att nypa huden på djurets rygg (om djuret är uttorkad, kommer huden att förbli deformerade). Om djuret är uttorkad, administrera subkutan injektion av Ringerlaktat buffert. Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthållasternala VILA.
- Administrera buprenorfin (0,05 mg / kg) till djur för postkirurgisk smärtbehandling och en subkutan injektion av 0,1 ml bupivakain runt injektionsstället.
Obs! Från början till slut hela förfarandet skall slutföras under 5-10 minuter för djur i denna ålder (postnatal dag 6). Kirurgisk tid kan ta längre tid för äldre djur.
- Administrera buprenorfin (0,05 mg / kg) till djur för postkirurgisk smärtbehandling och en subkutan injektion av 0,1 ml bupivakain runt injektionsstället.
3. Skötsel och bostadsfrågor
Obs! Vissa dammar kan inte tolerera valpar implanterade med enheten. Dammar kan behöva väljas som är toleranta. Det är acceptabelt att dammen för att flytta valpar runt buren genom att plocka upp dem från sändaren.
- När djuren är avvanda, var för sig, hysa dem att undvika avlägsnandet av enheter från sin bur mate.
- Euthanize djur genom letal dos av pentobarbital (25 mg / kg) eller isofluran (i en glaskupa) när tecken på stress är närvarande.
- Observera, vissa djurhållning burar med trådinlägg kan blandFere med de implanterade sändarna. Var noga med att kontrollera höjden på trådinsatsen för att säkerställa att djuren inte kan få sändaren fångad mellan de "barer" hos trådinsatsen. Rådgör med din veterinär för att få hjälp.
4. Inspelnings EEG
- Placera djuret i en bur av sig själv eller tillsammans inrymt med kullsyskon och dammen. Men bara ett ställe implanterade djur i en enda bur. Lämna inte valpar ensam i inspelningen kammare för mer än 2 timmar. Övervaka djur för tecken på stress och uttorkning.
- Anslut den medföljande strömförsörjningen till mottagaren basen och kontrollera att strömindikatorn lyser. Anslut mottagaren basen till ett datainsamlingssystem med hjälp av (Bayonet Neil-Concelman) BNC-kablar.
- Placera djurbur ovanpå mottagarens bas (Figur 2). Den "signal" ljus ska lysa indikerar en sändare har upptäckts. Data kan nu spelas in.
- To registrera data, anslut mottagaren basen till en analog-till-digitalomvandlare och anslut konverteraren till en dator (Figur 1).
- Ställ in samplingshastigheten för inspelningen. Se till att uppgifterna samplas korrekt. Välj minst 250 Hz samplingsfrekvens (500 Hz rekommenderas) för inspelning (bandbredd sändaren är 0,1-100 Hz).
- Spara digitaliserade data och analysera med hjälp av signalbehandlingsprogramvarupaket som Matlab.
5. EEG Analys - Allmänt
- Utför FFT (Fast Fourier transformer) för att transformera tids EEG data till frekvensdomänen från 0-100 Hz.
- Gör en uppskattning av makt spektraltätheter (PSD) från FFT med 256 Hann-fönstersegment baserat på Welch metod och normaliserat med 10 x log 10 (PSD). Kraft spektra visar de specifika frekvenser som dominerar EEG-signalen över den önskade tidsperioden.
- Grupp data över djur genom att ta medelvärdet av PSD från varje djuröver tidsmatchade behandlingar. Skapa 95% konfidensintervall av 1,96 x medelvärdet (PSD) / kvadratroten (n) där n är antalet djur (PSD spår). Rita medelvärdet och 95% konfidensintervall av data för att generera en kvantitativ rapport av hela frekvensinnehåll EEG över kohorter av djur såsom jämföra behandlade grupperna jämfört med kontrollgrupper.
6. perinatal hypoxi-ischemi (HI) Modell protokoll
- Söva P6 - 7 hos råttungar med hjälp isoflurananestesi (4% med 100% O 2) genom att placera djuret i en anestesi (fält med input från anestesi förångare). Vid initiering och under operation kontrollera toe-nypa reflex varje 15 min. Bristen på svar visar tillräcklig nivå av anestesi.
- Placera valp på rygg, exponera hals och skrubba med alternerande applikationer av 70% etanol och 10% Betadine. Upprepa etanol / Betadine skrubba tre gånger.
- Gör en 1 cm snitt i huden på nacken med scissors vid mittlinjen av halsen. Lyft huden med pincett och gör snittet med en sax. Var noga med att inte skära muskelvävnad när du gör snittet.
- Använd trubbig dissektion teknik för att exponera karotidartären. För att utföra dissektion använder två par trubbig näsa tång. Sätt i tips i vävnaden och låt fjäderverkan av det kirurgiska instrumentet sprida vävnaden. Upprepa tills halspulsådern exponeras. Identifiera halspulsådern genom en klarröd färg och närvaron av synliga puls.
- Separat halspulsådern från vagusnerven med trubbiga pincett. Sätt i trubbig spets pincett mellan artären och nerven. Släpp tången och låt fjäderverkan hos verktyget separera carotis från vagusnerven.
- Placera aneurysm klämmor 4-5 mm från varandra på karotidartären. Var noga med att inte skada artären med klämmorna genom att undvika snabba rörelser.
- Bränna halspulsådern mellan klämmorna aneurism. Att kauterisera artärenTryck på artären mellan klämmorna med en varm cauterizer spets. Efter artären skärs se båda ändar är korrekt flamberats att undvika blödning.
- Ta bort klämmorna stänger halsen snitt med 3 suturer. Endast sutur huden, se till att inte sy muskelvävnad.
- Låt djuret att återhämta sig i 1 h. Övervaka djurets andning och blödande från halsen. Om blödningen är närvarande, inte utsätta djuret för HI (steg 6.10).
- Placera djuret i en temperaturreglerad kammare vid 37 ° C och kontinuerligt införa 8% O2 / 92% N 2 blandning in i kammaren för 2 timmar.
Representative Results
Vi utvecklat och genomfört begreppet inspelning EEG från en enda vuxen gnagare, schematiserad i figur 1 För godkännandeprocessen IACUC måste designen integreras väl i befintliga institutionella djuranläggningar. Därför var systemet utformad för att enkelt installeras i en vanlig djuranläggning utan användning av extra utrymme: djuret är inrymt i en vanlig "djuranläggning-fråga" bostäder bur som är placerad inne i en mottagare med en integrerad Faradays bur för att minska elektriskt brus. Signalen från varje mottagare bas genomföres med trådar till en digitaliserare som är ansluten till en dator (figur 1). Det behövs en enda dator för att samla in data från upp till 32 djur som registrerats samtidigt, beroende på förmågan att användarens datainsamlingssystem. Denna typ av installation förbrukar lite ström och producerar lite värme, en funktion är kompatibel med klimatstyrd djuranläggningar. Data kan varavisas i realtid på skärmen, vilket gör experimentell övervakning, och lagras på lång sikt på externa hårddiskar (10 TB lagringsenheten).
För att minimera skador av skräp-kompisar och pup cannibalization av dammen, testade vi olika form sändare faktorer. Den slutliga utformningen var en välvd cylinder; en form svårt för råttor att bita och skada. En enskild sändare på skallen av en vuxen råtta visas i figur 2A och en tidig version av hög densitet (32 djur) mottagaren baser och inspelnings riggar i vilken standard gnagare skalet placeras visas i figur 2B. Strömeffektiviteten var en oerhört viktig faktor; vi valde kapacitiv koppling som ett dataöverföringsprotokoll. Följande designen möjliggör inspelning kontinuerlig EEG för över 6 månader, beroende på batterikapacitet (Figur 2A). Möss så unga som postnatal dag 12 (P12, figur 3A) och råttor så unga som P6 (Figure 3B) tolererar sändaren ganska bra. Håll sändaren till skallen med cyanoakrylat gör djur att växa med sändaren i vuxen ålder (Figur 3C), samtidigt som kontinuerligt förvärv av EEG-data.
Den unika miniatyriserade formfaktor gränssnitt sändaren och trådlösa lämpar sig för arbete med djurmodeller av neo- och perinatalperiod. Data i Figur 4 visar två-kanaler av EEG-registrering av subakut anfallsaktivitet som följer hypoxisk-ischemisk (HI) infarkt (halspulsådern ligering följt av 2 timmar efter hypoxi med 8% O2 blandning) i en P7 Sprague-Dawley råttungar 13. HI behandlingen orsakar en stor skada i halvklotet ipsilateralt det ligerade halspulsådern. Här inspelningarna visar ett kluster av två anfall gener över båda halvkloten av den skadade hjärnan. Den svarta kurvan visar EEG-aktivitet i halvklotet kontra till skadan, denblå spår visar EEG i ipsilaterala halvkloten (dvs. inom området för skadan). Medan kramper förekommer i båda hjärnhalvorna, visar ispilateral halvklotet EEG bakgrundsbortbländning, vilket är ett tecken på pågående hjärnskador 21.
Status epilepticus kan induceras i vuxna råttor genom att injicera djuren med organofosfatet DFP 22,23. Data i figur 5 visar repetitiva EEG utsläpp, som är indikativ för status epilepticus (se tidsmässiga expansioner Figur 5A, B). Nedanför prov spår har tidsförloppet av status epilepticus över 12 timmar analyserats med en icke-linjär blandade effekter modell som anger intensiteten av anfall över tiden. Svårighetsgraden av status epilepticus definieras av EEG makten i gamma-bandet (20-60 Hz). Här var det ovan beskrivna effekt i genomsnitt över 12 djur och ritas över 12 timmar med 95% konfidensintervall. Th e data visar en markant ökning av gamma makt inom den första timmen av DFP behandling, som varar mer än 12 timmar under vilken djuren kontinuerligt övervakas. Följande analysmetod tillåter ett kvantitativt mått på svårighetsgraden av akut status epilepticus, ett fenomen som tidigare analyserats främst med beteende åtgärder. Vi inkludera denna analysteknik som ett exempel, eftersom den använder ström beräkning i klassiska EEG band och har i stor utsträckning använts i prekliniska studier för att testa effekten av kramplösande läkemedel i vårt laboratorium 24-26. Kanske den mest värdefulla aspekten av att oavbrutet trådlösa inspelningar med den trådlösa telemetri är möjligheten att spela in onormala spontana händelser som inträffar med låg förekomst. Dessa typer av data visar den breda användbarheten av systemet den trådlösa sändaren.
554fig1.jpg "/>
Figur 1:. Skiss över Epoch registreringssystemet Det trådlösa registreringssystem består av två delar: 1) en trådlös skalle monterad sändare som förstärker Biosignal och 2) en mottagare platta placerad under standard gnagare bostäder. Utsignalen från mottagaren basen är en analog signal som består av den demodulerade Biosignal förstärks till ett maximum av 4 V topp-till-topp. Denna signal kan sedan matas in i ett datainsamlingssystem för inspelning.
Figur 2:. Sändaren och mottagaren Denna särskilda trådlösa sändaren (A) väger 4 g och förskjuter <1,4 cm 3 av volym och med ett fotavtryck av 7 x 12 mm monteras enkelt till skallen av råttor och möss. Sändaren kan förstärka 2 kanaler biopotentialer för upp till 6 månader, varefter batteriet är drainred. Större batterier kan användas för längre inspelningstid. Djuren placeras i standard gnagare placering i bur ovanpå Epok mottagaren (B). Visas till höger är ett tidigt exempel på två separata inspelnings riggar varje kan registrera från 16 djur samtidigt visar den relativt lilla fotavtryck (2 "x 4", ca 60 cm x 120 cm) för varje inspelningsriggar.
Figur 3:. Implantation den trådlösa sändaren i råttor och möss Sändaren gör kontinuerliga EEG inspelningar för upp till 6 månader hos möss så unga som postnatal dag 12 (P12, överst). Den mellersta fotografiet är en P7 hos råttungar implanteras med miniatyr sändare. Sändaren förblir fast förbunden med skallen som djuret mognar. Djuret nedtill är P280 och implanterades med en bluff sändare i åldern P7. Systemet möjliggör Simultagena och kontinuerliga EEG inspelningar från flera djur som är äldre P7 genom avvänjning, minska antalet kullar som behövs för preklinisk, långsiktig, EEG övervakningsstudier.
Figur 4: Tvåkanalig inspelning hypoxi-ischemi inducerade anfall med telemetrisystemet Dual-kanaliga inspelningar av onormalt EEG med trådlös telemetri i ett P7 hos råttungar efter halspulsådern ligation (ischemi) under 8% O 2 behandling (hypoxi).. (A) och (B), expanderade vyer av vågformerna. Beslag aktivitet förekommer i båda halvkloten (svart, blå) med betydande EEG förtryck förekommer i halvklotet med ischemisk infarkt (blå).
Figur 5: Inspelningsstatus epileptiCUS hos vuxna råttor. Surface EEG inspelningar (dvs dural) med miniatyr trådlösa telemetrisystem som svar på diisopropylfluorfosfat (DFP) behandling i en vuxen råtta. De skuggade perioder i övre spåret (A och B) expanderas utsikt över vågformer i spåren nedan. Data som spelats in med den trådlösa sändaren kan sedan analyseras i frekvensdomänen tillåter statistiska jämförelser i en kohort av djur. (C) Uppgifterna är genomsnittliga och 95% konfidensintervall av gamma band effekt (20-60 Hz) Följande DFP-inducerad status epilepticus (N = 12) under 12 timmar efter administrering av DFP.
Figur 6:. Registrering av kramper och förändringar i EEG i en transgen musmodell av vaskulära mullrande missbildningar Här vi spela in från en transgen mus (A) evid genomgår anfallsaktivitet. Till en början är normalt EEG-mönstret närvarande (1); omedelbart före beslag det finns en period av pre-ictal fördjupning (2), som följs av ett kluster av fem kramper (3). Efter beslag, onormala ictal urladdningar finns i signalen (4). Kontroll djur har inga beslag och inga onormala EEG egenskaper (B).
Discussion
Det kan vara mycket dyrt att göra långsiktiga elektrografiska inspelningar i små djurmodeller av sjukdomen. Genom att förlita sig på enkla elektriska kretsar och betonar låg strömförbrukning, har vi kunnat skapa ett sändarsystem (figur 1 och 2) som minskar kostnaderna för långsiktiga övervakningsexperiment. Den totala kostnaden för en 6 månaders övervakningsexperiment kan vara så lågt som $ 470, plus kostnaden för djuret (~ $ 1,5 djur per diem, $ 200 sändare). Den lilla storleken på sändaren medger kontinuerlig oavbruten elektrografiska inspelningar i små djur, prekliniska modeller av mänsklig sjukdom, vilket är mycket svårt att få med bunden eller radiofrekvensbaserade trådlösa registreringssystem (Figur 4). Slutligen minskar operationstiden och stress på djuret som annars kan äventyra ett experiment skallen monterade naturen hos sändaren. Här visar vi proof-of-principen experiment från tre difftekniker när experimentella modeller av anfall: perinatal hypoxi-ischemi 13, 27, 28 i en råttunge (Figur 4), DFP-inducerad status epilepticus (Figur 5) och kramper i en genetiskt inducerad modell av mullrande kärlmissbildningar (Figur 6).
Kanske den mest kritiska aspekten för att få artefakt-fria, långsiktiga elektrografiska inspelningar är att kontrollera ohämmad elektrod tillgång till kortikala regionen av intresse (Figur 4-6). Detta inkluderar den gemensamma referens / jordelektrod. Speciellt kritisk är att fästa sändaren till skallen för epidural EEG applikationer. Under denna process är det möjligt att oavsiktligt belägga spetsen på elektrod med cyanoakrylat med tanke på den mycket korta längden på elektroderna. Beläggning elektroderna i cyanoakrylat kan dämpa EEG-signaler eller helt isolera dem i värsta fall. På samma sätt, brist på god elektrisk anslutning Bindexets gemensamma referens / marken och djurets hjärna kommer att förhindra korrekt drift av differentialförstärkaren i sändaren, vilket resulterar i ett elektriskt "bullriga" utsignal. Ofta efter kirurgi, god kvalitet signaler kan äventyras i upp till 48 timmar på grund av ödem som omger Burr hål i skallen. Som ödem avtar, signaler förbättrar i allmänhet. Detta kan undvikas genom att placera elektroderna på ytan av skallen utan att göra burr hål. Konsekvenserna av denna process är ökad risk för att belägga elektroderna med cyanoakrylat, minskad högfrekventa aktivitet på grund av de låga passerar elektriska egenskaperna hos skallbenet, och möjligheten att elektriskt isolera den gemensamma referens / marken gör brus i signalerna. Praktiserande korrekt placering av elektroder kan göras med en tunn bit av trä eller faner som härmar tjockleken hos mus eller råtta skallen. Resultaten som presenteras i detta manuskript illustrerar quatets inspelningar som kan erhållas med hjälp av trådlös telemetri teknik.
Kirurgisk implantation med användning av metoden som beskrivs häri kan ta så lite som 10 min, beroende på komplexiteten i operationen. För kirurgisk åtkomst till djupa hjärnstrukturer, såsom CA1-regionen av hippocampus, är det bäst att sätta fast sändaren till en mikromanipulator monterad på en stereotaktisk ram. Den mikromanipulator kommer att ge kirurgen med noggrannhet att implantera sändaren enligt publicerade stereotaktiska koordinater i atlas över musen 29 och råtta 30 hjärnor. Detta kan göras genom att helt enkelt tacking ett stycke injektionsnål slang till sändaren med cyanoakrylat och sedan montering av injektionsnålen i mikromanipulator. Mikromanipulator kontroll av x, y och z-koordinater kommer att ge ytterligare stabilitet vid montering av sändaren till skallen före suturering huden stängd. Tillsatsen av benskruvar runt perimeter hos sändaren kan hjälpa till att förankra sändaren till skallen, även om de inte är nödvändiga. Benskruvar kan vara effektiv, men i vissa djurmodeller av krampanfall och epilepsi, såsom litium-pilokarpin-behandlade vuxen råtta. Dessa djur tenderar att ha spontana konvulsiva anfall med intensiv motorisk aktivitet som kan skada sändaren under anfall. Ytterligare komplexitet kunde läggas till dessa försök. Till exempel, är sändaren kompatibel med många olika modeller av traumatisk hjärnskada, såsom kontrollerad kortikal påverkan 31. Hållbarheten sändaranordningen testades genom att implantera djur med sändare på P7, och sedan inhysta i djuranläggningen. Efter 12 månader, mest av implantaten förblev intakt på skallen. När djuren avlivades, verkade skallar att vara normal och sändaren var inbäddad i skallbenet, vilket kräver betydande kraft för att extrahera den. Var försiktig när djupa hjärnstrukturerstuderas; som hjärnan växer, och elektroderna stå stilla, förväntas den slutliga positionen av elektroderna att ändra. För de metoder som beskrivs här, har elektroderna typiskt placerad ovanför dura, vilket gjorde både hjärnan och skallen att växa och för elektroder att stanna kvar i sina ursprungliga positioner. Den begränsande faktorn för hur länge sändaren kan användas är batteristorleken (dvs. tills batteriet tar slut).
En fristående monolitisk konstruktion (dvs sändaren är inbäddad i hård epoxy) av sändarens huset lämpar sig för användning med omogna valpar som hålls med dammen och deras syskon. Ofta sam-hölje implanterade djur med trådbundna tjuder resulterar i förstörelsen av den implanterade hårdvara eller cannibalization av valparna av dammen. Den släta väggar form av sändaren möjliggör implantation med praktiskt taget ingen hårdvarufel eller förlust av ungar på grund av cannibalization.
Disclosures
Drs. Lehmkuhle och Dudek har ett ekonomiskt intresse i epitel, Inc., konstruktörer av Epoch trådlösa biopotential registreringssystem.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats genom det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke R43 / R44 NS064661.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Powder Free Sterile Latex Surgical Glove |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
| Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
| Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
| Fine burr | FST | 19007-07 | |
| Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
| Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
| Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
| Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
| Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
| Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
| Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
| Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
| Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
| Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
| Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
| PC-compatible computer |
References
- Boylan, G. B., Stevenson, N. J., Vanhatalo, S.
- Panzica, F., Varotto, G., Rotondi, F., Spreafico, R., Franceschetti, S. Identification of the Epileptogenic Zone from Stereo-EEG Signals: A Connectivity-Graph Theory Approach. Front Neurol. 6 (4), 175 (2013).
- Arciniegas, D. B. Clinical electrophysiologic assessments and mild traumatic brain injury: state-of-the-science and implications for clinical practice. Int J Psychophysiol. 82 (1), 41-52 (2011).
- Mizrahi, E. M., Kellaway, P. Cerebral concussion in children: assessment of injury by electroencephalography. Pediatrics. 73 (4), 419-425 (1984).
- Pisarenco, I., Caporro, M., Prosperetti, C., Manconi, M. High-density electroencephalography as an innovative tool to explore sleep physiology and sleep related disorders. Int J Psychophysiol. S0167-8760 (14), 3-8 (2014).
- Konadhode, R. R., et al. Stimulation of MCH neurons increases sleep. J. Neurosci. 33 (25), 10257-10263 (2013).
- Bertram, E. H., Williamson, J. M., Cornett, J. F., Spradlin, S., Chen, Z. F. Design and construction of a long-term continuous video-EEG monitoring unit for simultaneous recording of multiple small animals. Brain Res. Protoc. 1-2 (1), 85-97 (1997).
- Stables, J. P., et al. Therapy discovery for pharmacoresistant epilepsy and for disease-modifying therapeutics: Summary of the NIH/NINDS/AES Models II Workshop. Epilepsia. 44 (12), 1472-1478 (2003).
- White, A. M., et al. Efficient unsupervised algorithms for the detection of seizures in continuous EEG recordings from rats after brain injury. J. Neurosci. Methods. 152 (1-2), 255-266 (2006).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The ontogeny of seizures in a rat model of limbic epilepsy: evidence for a kindling process in the development of chronic spontaneous seizures. Brain Res. 625 (2), 295-300 (1993).
- Bertram, E. H., Cornett, J. F. The evolution of a rat model of chronic spontaneous limbic seizures. Brain Res. 661 (1-2), 157-162 (1994).
- Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. J. Neurosci. 29 (7), 2103-2112 (2009).
- Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous electroencephalographic monitoring with radio-telemetry in a rat model of perinatal hypoxia-ischemia reveals progressive post-stroke epilepsy. J. Neurosci. 30 (1), 404-415 (2010).
- Galanopoulou, A. S. Basic mechanisms of catastrophic epilepsy -- overview from animal models. Brain Dev. 35 (8), 748-756 (2013).
- Lerche, H., et al. Ion channels in genetic and acquired forms of epilepsy. J Physiol. 591 (Pt 4), 753-764 (2013).
- Rossignol, E., et al. WONOEP appraisal: new genetic approaches to study epilepsy). Epilepsia. 55 (8), 1170-1186 (2014).
- Westmark, C. J., et al. Reversal of fragile X phenotypes by manipulation of AβPP/Aβ levels in Fmr1KO mice. PLoS One. 6 (10), e26549 (2011).
- Sukhotinsky, I., et al. Optogenetic delay of status epilepticus onset in an in vivo rodent epilepsy model. PLoS One. 8 (4), e62013 (2013).
- Krook-Magnuson, E., Armstrong, C., Oijala, M., Soltesz, I. On-demand optogenetic control of spontaneous seizures in temporal lobe epilepsy. Nat Commun. 4, 1376 (2013).
- Paz, J. T., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nat Neurosci. 16 (1), 64-70 (2013).
- Monod, N., Pajot, N., Guidasci, S. The neonatal EEG: statistical studies and prognostic value in full-term and pre-term babies. Electroecephalogr Clin Neurophysiol. 32 (5), 529-544 (1972).
- Deshpande, L. S., Carter, D. S., Blair, R. E., DeLorenzo, R. J. Development of a Prolonged Calcium Plateau in Hippocampal Neurons in Rats surviving Status Epilepticus Induced by the Organophosphate Diisopropylfluorophosphate. Toxicol Sci. 116 (2), 623-631 (2010).
- Todorovic, M. S., Cowan, M. L., Balint, C. A., Sun, C., Kapur, J. Characterization of status epilepticus induced by two organophosphates in rats. Epilpsy Res. 101 (3), 268-276 (2012).
- Lehmkuhle, M. J., et al. A simple quantitative method for analyzing electrographic status epilepticus in rats. J. Neurophysiol. 101 (3), 1660-1670 (2009).
- Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J. Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
- Pouliot, W., et al. A comparative electrographic analysis of the effect of sec-butyl-propylacetamide on pharmacoresistant status epilepticus. Neuroscience. 12 (231), 145-156 (2012).
- Levine, S.
- Vannucci, R. C., Vaccucci, S. J. A model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Ann N Y Acad Sci. 835, 234-249 (1997).
- Paxinos, G., Franklin, K. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th Ed, Academic Press. Waltham, MA. (2013).
- Bolkvadze, T., Pitkanen, A. Development of post-traumatic epilepsy after controlled cortical impact and lateral fluid-percussion-induced brain injury in the mouse. J. Neurotrauma. 29 (5), 789-812 (2012).
