Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.
Il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata e la comunicazione dinamica di assiemi neuronali. Un importante questione aperta è come un vasto repertorio di motivi dinamici, che sono alla base funzioni cerebrali più diverse, può emergere da un'organizzazione topologica fissa e modulare di circuiti cerebrali. Rispetto a studi in vivo di circuiti neuronali che presentano difficoltà intrinseche sperimentali, preparati in vitro offrono una possibilità molto più grande di manipolare e sondare le proprietà strutturali, dinamiche e chimiche dei sistemi neuronali sperimentali. Questo lavoro descrive un metodo sperimentale in vitro che permette crescente di reti modulari composti da spazialmente distinte, assemblee di neuroni funzionalmente interconnessi. Il protocollo consente il controllo bidimensionale (2D) architettura della rete neuronale a diversi livelli di complessità topologica.
Un patterning rete desiderata può essererealizzato sia su vetrini regolari e substrato integrato array micro elettrodi. Strutture microlavorati sono impressi su un wafer di silicio e usati per creare matrici polimeriche biocompatibili, che incorporano le caratteristiche negative della architettura di rete desiderato. Le matrici sono disposte sui substrati di coltura durante la procedura di rivestimento con uno strato molecolare per promuovere l'adesione cellulare. Dopo la rimozione delle matrici, i neuroni sono placcati e spontaneamente reindirizzato alle zone rivestite. Diminuendo la distanza inter-vano, è possibile ottenere circuiti neuronali o isolate o interconnessi. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule sono co-coltura con una rete neuronale supporto che si trova alla periferia del piatto di coltura. Registrazioni elettrofisiologiche e ottiche di attività delle reti modulari ottenuti rispettivamente mediante substrato integrato micro schiere di elettrodi e di imaging di calcio sono presentati. Mentre ogni modulo mostra SPONTsincronizzazioni globali aneous, il verificarsi di sincronizzazione tra moduli è regolata dalla densità di collegamento fra i circuiti.
Evidenze sperimentali e teorici sostengono la possibilità che il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata di gruppi di cellule 1-5, che può essere considerato come unità funzionali dinamici che transientemente interagiscono tra loro, sagomatura e sottostanti diversi stati cerebrali. Modularità funzionale dipende anche e associato con l'organizzazione modulare strutturale dei circuiti cerebrali 6,7. Come funzione e la struttura dei circuiti cerebrali reciprocamente forma l'altro è ancora una delle principali questioni aperte nel campo delle neuroscienze. Per fornire una comprensione più approfondita di questa domanda, è importante identificare quadri sperimentali ottimali dove è possibile affrontare, almeno parzialmente, tali problemi. Dal controllo manipolazione delle dinamiche spazio-temporali delle reti neuronali in esperimenti in vivo è impegnativo, lo sviluppo di modelli in vitro reti neuronali è di notevole interesse per la loro facile accessibility, il monitoraggio, la manipolazione e modellazione 8,9. Negli ultimi anni, nel settore delle tecnologie in vitro sostenute da metodi di substrato patterning avanzati hanno permesso di indurre le reti neuronali per sviluppare una gamma di strutture modulari predefinite 3 e per studiare le proprietà funzionali delle reti con topologie imposti 10. In particolare, i metodi sono stati recentemente utilizzati per organizzare reti imponendo vincoli fisici 4,11. Infatti, per studiare il legame tra struttura e funzione nelle reti neuronali e per fornire una rappresentazione semplificata ma plausibile di interagire assiemi neuronali, sistemi in vitro dovrebbero fornire neuronali sottopopolazioni interconnessi. Omogenei colture neuronali ampiamente studiato 2D non impongono vincoli spaziali sul cablaggio emergenti auto-organizzato dei circuiti. Quindi un possibile approccio per modellare gruppi di cellule artificialmente interconnessi è di posizionare diverse popolazioni neuronali in battibeccoaree distinte buona resa. La distanza tra queste zone non impedisce i collegamenti assemblee interrelazioni. Questo approccio, pur garantendo un controllo notevole sopra complessità della rete, ha dimostrato di fornire un repertorio ricco di modelli di sincronizzazione 6,7,12.
Al fine di facilitare una coltura riproducibile di gruppi neuronali modulari, un protocollo per assemblare l'auto-organizzazione di reti in cluster neuronali collegati da assoni e dendriti è presentato e descritto. La struttura polimerica per il confinamento fisico di colture neuronali è stato creato da polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS è un elastomero ampiamente utilizzati per applicazioni biomediche grazie alla sua biocompatibilità, la trasparenza e la permeabilità ai gas 13. Il PDMS è preparato e escluso dalla SU8 micromachined 2075 14,15 strutture da-spin rivestimento a PDMS liquido su un "maestro" come descritto in precedenza in Jackman et al. 16 THa raggiunto modellato reti neuronali sono composti da moduli di diverse dimensioni interconnesse e che sono stati ottenuti con successo su entrambi i vetrini e Micro Electrode Array (MEA) 17-20. La densità delle connessioni tra i moduli può cambiare le caratteristiche della sincronizzazione di rete, da una rete completamente sincronizzato, tipica delle culture uniformi, a stati transitori di sincronizzazione tra i moduli.
Un protocollo di crescere reti neuronali modulari 2D in vitro composto da circuiti funzionalmente interconnessi è descritto. La procedura si basa su uno strato adesivo patterning cellulare. Patterning si ottiene con PDMS stencil riproduce la caratteristica negativa della architettura di rete desiderato. Stencil PDMS definiscono le aree in cui lo strato adesivo cellulare è depositato. Una volta che le cellule sono placcati, spontaneamente si riuniscono per le isole ricoperte e di auto-organizzarsi in circuiti …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal BRIANBOW Progetto Europeo (7PQ Giovani Esploratori, Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jacopo Tessadori per gli utili commenti sul manoscritto, e Silvia Chiappalone per il suo aiuto nel produrre la grafica utilizzata nel video.
PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
TC02 | Multi Channel Systems | ||
Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
B-27 | Gibco | 17504044 | |
glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |