Detta manuskript beskriver ett protokoll för att växa in vitro modulära nätverk bestående av rumsligt begränsade, funktionellt sammankopplade neuronala kretsar. Ett polymert mask används för att mönstra ett proteinskikt för att främja cellulär adhesion över odlingssubstrat. Pläterade nervceller växer på belagda områden upprättande spontana kontakter och uppvisar elektrofysiologiska aktivitet.
Hjärnan fungerar genom samordnade aktivering och den dynamiska kommunikation av neuronala församlingar. En stor öppen fråga är hur en stor repertoar av dynamiska motiv, som ligger till grund mest skiftande hjärnfunktioner, kan växa fram ur en fast topologisk och modulär organisation av hjärnkretsar. Jämfört med in vivo-studier av neuronala kretsar som utgör inneboende experimentella svårigheter, in vitro förberedelser erbjuder en mycket större möjlighet att manipulera och sondera de strukturella, dynamiska och kemiska egenskaper experimentella neuronala system. Detta arbete beskriver ett in vitro experimentell metodik som tillåter odling av modulära nätverk som består av rumsligt distinkta, funktionellt sammankopplade neuronala församlingar. Protokollet tillåter styrning av tvådimensionella (2D) arkitektur av neuronala nätverket på olika nivåer av topologisk komplexitet.
Ett önskat nätverk mönstring kan varauppnås både på vanliga täckglas och substrat inbäddade mikroelektrod matriser. Mikrobearbetade strukturer är präglade på en kiselskiva och används för att skapa biokompatibla polymera schabloner, som inkorporerar de negativa särdragen hos den önskade nätverksarkitektur. De schabloner som är placerade på odlingssubstrat under ytbeläggningsförfarande med en molekylskikt för att främja cellulär adhesion. Efter avlägsnande av schablonerna är neuroner pläterade och de spontant omdirigeras till de belagda områdena. Genom att minska den interutrymmet avstånd, är det möjligt att erhålla antingen isolerade eller sammankopplade neuronala kretsar. För att främja cellöverlevnad, cellerna är samodlade med en stödjande neuronala nätverket som ligger vid periferin av odlingsskålen. Elektrofysiologiska och optiska inspelningar av aktiviteten av modulära nät erhålls respektive genom substrat inbäddade mikroelektrod arrayer och kalcium avbildning presenteras. Medan varje modul visar spontuttalanden, globala synkroniseringar, är förekomsten av synkronisering mellan moduler regleras av tätheten av anslutningen bland kretsarna.
Experimentella och teoretiska bevis stöder möjligheten att hjärnan fungerar genom samordnad aktivering av cellaggregat 1-5, vilket kan betraktas som dynamiska funktionsenheter som övergående interagerar med varandra, formning och underliggande olika hjärntillstånd. Funktionell modularitet är också beroende av och i samband med den strukturella modulära organisationen av hjärnkretsarna 6,7. Hur funktion och struktur av hjärnkretsar ömsesidigt forma varandra är fortfarande en av de viktigaste öppna frågorna i neurovetenskap. För att ge en djupare förståelse av denna fråga är det viktigt att identifiera optimala experimentella ramar där det är möjligt att ta itu med, åtminstone delvis, dessa frågor. Eftersom kontrollerad manipulation av spatio-temporala dynamik neuronala nätverk i in vivo-försök är utmanande, utvecklingen av in vitro neuronala nätverk modeller är av stort intresse på grund av deras enkla accessibility, övervakning, manipulation och modellering 8,9. Under de senaste åren, in vitro teknik som stöds av avancerade substrat mönstring metoder har tillåtit att förmå neuronala nätverk för att utveckla en rad fördefinierade modulstruktur 3 och studera de funktionella egenskaperna hos nät med ålagts topologier 10. I synnerhet har metoder som nyligen använts för att organisera nätverk genom att införa fysiska begränsningar 4,11. Faktum att studera sambandet mellan struktur och funktion i neuronala nätverk samt att ge en förenklad men trolig representation av samverkande neuronala församlingar bör in vitro-system ger sammankopplade neuronala delpopulationer. Brett studerade 2D homogena neuronala kulturer inte införa några rumsliga begränsningar på självorganiserade emergent ledningar av kretsarna. Därför en möjlig strategi för att forma ett konstlat sätt sammankopplade cell församlingar är att placera olika neuronala populationer i spatially olika områden. Avståndet mellan dessa områden hindrar inte de inter församlingar anslutningar. Detta tillvägagångssätt, samtidigt som en betydande kontroll över nätverks komplexitet, har visat sig ge en rikare repertoar av synkroniseringsmodeller 6,7,12.
För att underlätta en reproducerbar odling av modulära neuronala församlingar, för att ett protokoll montera självorganisering av nätverk i neuronala kluster sammanbinds av axoner och dendriter presenteras och beskrivs. Den polymera strukturen för den fysiska begränsningen av neuronala kulturer har skapats från polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS är en elastomer i stor utsträckning för biomedicinska applikationer på grund av sin biokompatibilitet, öppenhet och permeabilitet för gaser 13. PDMS är beredd och undantas från mikrobearbetade SU8 2075 14,15 strukturer genom spin-beläggning en flytande PDMS på en "master" som tidigare beskrivits i Jackman et al. 16 THan uppnådde mönstrade neuronala nätverk består av sammankopplade moduler av olika storlek och de har framgångsrikt fått både täck och Micro Elektrod Arrays (MEA) 17-20. Densiteten av förbindelser mellan modulerna kan ändra funktionerna i nätverkssynkroniseringen, från en fullt synkrona nätet, typiskt av enhetliga kulturer, för att transienta tillstånd av synkronisering bland modulerna.
Ett protokoll för att växa 2D modulära neuronala nätverk in vitro består av funktionellt sammankopplade kretsar beskrivs. Förfarandet bygger på mönstring en cellulär vidhäftningsskikt. Mönstring uppnås med PDMS stenciler reproducera den negativa inslag i den önskade nätverksarkitektur. PDMS stenciler definierar de områden där det cellulära klisterskiktet deponeras. När cellerna är pläterade, de spontant samlas för att de belagda öarna och själv organisera sig i aktiva sammankopplade krets…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Europeiska Project BRIANBOW (FP7 Young Explorers skulle Författarna tacka Dr Jacopo Tessadori för värdefulla synpunkter på manuskriptet, och Silvia Chiappalone för hennes hjälp i att producera de bilder som används i videon.
PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
TC02 | Multi Channel Systems | ||
Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
B-27 | Gibco | 17504044 | |
glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |