Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस में तेदेपा-43 वेरिएंट के खिलाफ आकृति विज्ञान विशिष्ट अभिकर्मकों के अलगाव के लिए उपन्यास परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के आधार Biopanning
Summary
Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.
Abstract
प्रोटीन वेरिएंट तेदेपा-43 Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस में (ए एल एस) में, अल्फा-synuclein सहित कई बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं क्योंकि पार्किंसंस रोग और अल्जाइमर रोग में बीटा amyloid और ताऊ, यह आकृति विज्ञान विशिष्ट अभिकर्मकों चुनिंदा लक्षित कर सकते हैं कि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है इन रोग विशिष्ट प्रोटीन रोग विकृति विज्ञान में और संभावित नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए इन वेरिएंट की भूमिका का अध्ययन करने के वेरिएंट। हम चुनिंदा रोग विशिष्ट प्रोटीन वेरिएंट समझते हैं कि अभिकर्मकों के अलगाव सक्षम है कि उपन्यास परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) आधारित biopanning तकनीक को विकसित किया है। प्रक्रिया, नकारात्मक और सकारात्मक panning के चरणों में शामिल दो प्रमुख चरण होते हैं। नकारात्मक panning के चरण के दौरान, बंद लक्ष्य एंटीजन को प्रतिक्रियाशील रहे हैं कि फगेस ध्यान से चयनित बंद लक्ष्य एंटीजन की एक श्रृंखला का उपयोग व्यकलित panning के कई दौर के माध्यम से समाप्त हो जाते हैं। नकारात्मक में एक प्रमुख विशेषताpanning चरण की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए और सभी अवांछित फेज कणों को हटा रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए AFM इमेजिंग का उपयोग होता है। सकारात्मक panning के चरण के लिए ब्याज का लक्ष्य प्रतिजन एक अभ्रक सतह पर तय हो गई है और बाध्य फगेस eluted और चुनिंदा लक्ष्य प्रतिजन कि बाँध फगेस की पहचान के लिए जांच कर रहे हैं। लक्ष्य प्रोटीन संस्करण उपयुक्त नकारात्मक panning के नियंत्रण इस्तेमाल किया गया है प्रदान करने के शुद्ध होने की जरूरत नहीं है। यहां तक कि सकारात्मक panning के कदम में उपयोग किया जा सकता जटिल जैविक सामग्री में बहुत कम मात्रा में ही मौजूद हैं कि प्रोटीन वेरिएंट लक्ष्य। इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के माध्यम से, हम चुनिंदा मानव ए एल एस मस्तिष्क के ऊतकों में पाया जाता है कि तेदेपा-43 के प्रोटीन वेरिएंट के लिए एंटीबॉडी का अधिग्रहण किया। हम इस प्रोटोकॉल चुनिंदा विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं और रोगों की एक विस्तृत विविधता में मौजूद प्रोटीन वेरिएंट कि बाँध पैदा करने अभिकर्मकों के लिए लागू किया जाना चाहिए कि उम्मीद है।
Introduction
प्रोटीन वेरिएंट की उपस्थिति ऐसे अल्जाइमर, पार्किंसन, ए एल एस और Frontotemporal मनोभ्रंश (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 के रूप में neurodegenerative रोगों सहित कई बीमारियों की प्रगति में एक कारक के रूप में फंसाया गया है , 10,11। प्रोटीन बीटा amyloid और अल्फा-synuclein की Oligomeric रूपों अल्जाइमर और पार्किंसंस, क्रमशः 2,3,4,5 के लिए जिम्मेदार विषाक्त प्रजाति माना जाता है। टीएआर डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन 43 (तेदेपा-43) का समुच्चय ए एल एस और FTD 12,13,14 से जोड़ा गया है। इसलिए चुनिंदा अलग प्रोटीन वेरिएंट के रूप में नैदानिक मार्करों और संभावित चिकित्सा विज्ञान की सेवा के लिए शक्तिशाली उपकरण हो सकता है लक्षित कर सकते हैं कि एंटीबॉडी के रूप में इस तरह के अभिकर्मकों। इस अध्ययन में, हम हालांकि इस पत्र में उल्लिखित तकनीक prot की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ अभिकर्मकों के अलगाव के लिए लागू किया जाना चाहिए, चुनिंदा ए एल एस में फंसा तेदेपा-43 प्रोटीन की वेरिएंट कि बाँध अभिकर्मकों के विकास पर ध्यान केंद्रितEin वेरिएंट।
तेदेपा-43 के cytoplasmic एकत्रीकरण ए एल एस 15,16,17,18,19 में एक रोग सुविधा के रूप में पहचान की गई है। यह साइटोसॉल और नाभिक 15,17 के बीच ले जाने के लिए जाता है, हालांकि आमतौर पर तेदेपा-43, एक सामान्य व्यक्ति से सभी कोशिकाओं के नाभिक में पाया जाता है। तेदेपा-43 की हालांकि, ए एल एस में एकत्रित रूपों रोग प्रगति 16,20 दौरान कोशिका द्रव्य को नाभिक से तेदेपा-43 के आंदोलन का सुझाव नाभिक में पाया कम सांद्रता के साथ चुनिंदा न्यूरॉन्स की कोशिका द्रव्य और glia में पता चला रहे हैं। तेदेपा-43 के एकत्रीकरण ए एल एस मामलों के बहुमत में पाया जाता है, यह में परिवर्तन से जुड़े हुए हैं 1% कुल ए एल एस मामलों (या 15% पारिवारिक ए एल एस मामलों के -20%) की -2% के बाद से सभी मामलों के लिए खाते में नहीं है superoxide dismutase 1 (SOD1) जीन 15,17। क्योंकि ए एल एस मामलों की विशाल बहुमत में तेदेपा-43 की महत्वपूर्ण भूमिका की है, यहाँ हम चुनिंदा हैं कि तेदेपा-43 वेरिएंट के लिए बाध्य कर सकते हैं कि एंटीबॉडी आधारित अभिकर्मकों के विकास पर ध्यान केंद्रितहमारे उपन्यास AFM के आधार biopanning तकनीक के उपयोग मानव ए एल एस मस्तिष्क के ऊतकों में मौजूद।
शुरू में हम एंटीबॉडी बाध्यकारी डोमेन की एक विविध प्रदर्शनों की सूची की जरूरत है। हम तीन अलग-अलग फेज प्रदर्शन एकल श्रृंखला चर डोमेन एंटीबॉडी टुकड़ा (scFvs) पुस्तकालयों, (टॉमलिंसन मैं और जम्मू और शीट्स पुस्तकालयों 21) संयुक्त। panning प्रक्रिया नकारात्मक और सकारात्मक panning के चरणों में बांटा गया है। पुस्तकालयों से फगेस पहले कई बंद लक्ष्य एंटीजन बाहर रखा गया है करने के लिए प्रतिक्रियाशील फगेस के दौरान जो नकारात्मक पॅनिंग प्रक्रिया के अधीन हैं। प्रत्येक बंद लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ नकारात्मक पैनिंग के प्रत्येक दौर के पूरा होने के बाद, इस प्रक्रिया को बंद लक्ष्य एंटीजन बाध्यकारी सभी फेज हटा दिया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए AFM इमेजिंग द्वारा नजर रखी है। केवल सभी प्रतिक्रियाशील फगेस हटा रहे हैं कि AFM इमेजिंग द्वारा पुष्टि करने के बाद हम अगले लक्ष्य के लिए आगे बढ़ना है। ए एल एस में फंसा तेदेपा-43 वेरिएंट के खिलाफ अभिकर्मकों को अलग-थलग करने के लिए हम निम्न नकारात्मक panning एंटीजन का उपयोग किया: 1) बीएसए दुर्बलता या गैर विशेष रूप से प्रोटीन के लिए बाध्य है कि फेज को दूर करने के लिए; 2) एकत्रित अल्फा synuclein एकत्रित प्रोटीन की सामान्य संरचनात्मक तत्वों के लिए बाध्य है कि फेज को दूर करने के लिए; 3) मानव मस्तिष्क ऊतक homogenates किसी भी प्रोटीन या स्वस्थ मानव मस्तिष्क के ऊतकों का पोस्टमार्टम नमूनों में मौजूद अन्य घटकों के लिए बाध्य है कि फेज को दूर करने के लिए; 4) स्वस्थ मानव मस्तिष्क से जुड़ी सभी तेदेपा-43 रूपों के लिए बाध्य है कि फेज दूर करने के लिए स्वस्थ मानव मस्तिष्क से तेदेपा-43 immunoprecipitated; और 5) तेदेपा-43 गैर-ए एल एस विकृति के साथ जुड़े तेदेपा-43 वेरिएंट कि बाँध फेज को दूर करने के FTD मस्तिष्क homogenates से अलग immunoprecipitated। सब बंद लक्ष्य एंटीजन को प्रतिक्रियाशील सभी फेज को हटाने के बाद, हम तो मानव ए एल एस मस्तिष्क के ऊतकों से immunoprecipitated इस मामले तेदेपा-43 में, ब्याज की प्रतिजन कि बाँध एंटीबॉडी टुकड़े अलग कर रहे हैं, जिसके दौरान सकारात्मक panning के चरण के लिए रवाना हुए। इन अलग एंटीबॉडी तेदेपा-43 के एकत्रित या संशोधित रूपों के लिए प्रतिक्रियाशील हो सकता है।
"> परम्परागत फेज biopanning सकारात्मक panning के चरण 22,23 पर मुख्य रूप से केंद्रित है। आमतौर पर ब्याज का लक्ष्य स्थिर है, फेज पुस्तकालय जोड़ा और बाध्य फगेस। इस प्रवर्धन और ऊष्मायन प्रक्रिया फगेस तो परिलक्षित कर रहे हैं। Eluted और फिर से लक्ष्य करने के लिए जोड़ा इस प्रक्रिया के रूपांतरों लक्ष्य एंटीजन की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ एंटीबॉडी अभिकर्मकों अलग करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, जबकि आम तौर पर सकारात्मक बंधन फेज का प्रतिशत बढ़ाने के लिए कई बार दोहराया है।, वे आम तौर पर शुद्ध लक्ष्य प्रतिजन 24,25,26 की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, हमारी प्रक्रिया केवल लक्ष्य प्रतिजन की मात्रा का पता लगाने की आवश्यकता है, जबकि। 27, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल शुद्धि और panning के लिए आवश्यकता के बिना बहुत कम मात्रा में मौजूद हैं कि चुनिंदा बाँध लक्ष्य एंटीजन, के खिलाफ सीधे किया जा सकता है कि अभिकर्मकों को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जटिल ऊतकों के नमूनों में प्रतिजन मौजूद। संपूर्ण नकारात्मक panning के प्रोटोकॉल का उपयोग सत्यापित के रूप मेंAFM के द्वारा शुद्ध या समृद्ध नहीं जब सकारात्मक प्रतिजन के खिलाफ अलग-थलग क्लोन चुनिंदा भी लक्ष्य बाध्य होना चाहिए कि यह सुनिश्चित करता है।कस्तूरीरंगन और उनके सहयोगियों (2003) लक्ष्य 5 की nanogram एकाग्रता का उपयोग कर oligomeric बीटा amyloid के लिए प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी अलग करने के लिए इसी तरह की एक नकारात्मक और सकारात्मक biopanning प्रक्रिया से बाहर किया जाता है। यहाँ हम चुनिंदा रोग विशिष्ट प्रोटीन मानव ऊतकों के नमूनों से सीधे वेरिएंट कि बाँध अभिकर्मकों की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए इस प्रक्रिया पर विस्तार। भविष्य के अध्ययनों में हम आगे न केवल यहां पृथक अभिकर्मकों के नैदानिक मूल्य की जांच, लेकिन यह भी ए एल एस के इलाज के लिए उनके चिकित्सीय प्रासंगिकता का आकलन करना चाहते हैं।
कुल मिलाकर, हमारे उपन्यास AFM के आधार biopanning प्रौद्योगिकी, प्रोटीन शुद्धि या संशोधन के लिए आवश्यकता के बिना किसी भी जैविक सामग्री में किसी भी रोग विशिष्ट प्रोटीन संस्करण के अलगाव के लिए लागू किया जाना चाहिए, तब भी जब लक्ष्य प्रतिजन concentratioएनएस बेहद कम हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध एनआईएच से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: R21AG042066। हम स्क्रीन पर कब्जा वीडियो बनाने में उनके योगदान के लिए फिलिप स्चुल्ज़ को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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