Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning
Summary
Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.
Abstract
Protein varyantları TDP-43 Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 'de, alfa-sinüklein de dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynadığı için, Parkinson hastalığı ve Alzheimer hastalığı, beta-amiloid tau, bu morfoloji özel reaktifler seçici hedefleyebilir geliştirilmesi kritik bir öneme sahiptir Bu hastalığa özgü bir protein hastalık patolojisinde ve potansiyel diagnostik ve terapötik uygulamalar için bu varyantların rolünü incelemek için varyantları arasından seçilir. Burada özellikle hastalığa özgü protein varyantlarını tanıyan reaktifler izolasyonuna olanak veren, yeni atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) göre Bio belirleme yöntemleri geliştirmişlerdir. Süreç, negatif ve pozitif kaydırma aşamalarında alan iki önemli aşamaları vardır. Negatif kaydırma aşamasında, off-hedef antijenlere karşı reaktif olan fajlar özenle seçilmiş hedef dışı antijenleri bir dizi kullanarak Eksiltici kaydırma birden tur üzerinden elimine edilir. Negatif bir anahtar özelliğikaydırma faz sürecini izlemek ve tüm istenmeyen faj partikülleri kaldırılır onaylamak için AFM görüntüleme kullanmaktadır. Pozitif kaydırma fazı için, ilgi konusu hedef antijen, bir mika yüzeyi üzerinde sabit olan ve bağlanmış fajlar yıkanır ve seçici hedef antijene bağlanma fajlarından tespit etmek taranır. Eğer hedef protein varyantı uygun negatif kaydırma kontrol kullanılmıştır temin saflaştırılabilir gerek yoktur. Hatta pozitif kaydırma aşamada kullanılabilecektir karmaşık biyolojik malzemede çok düşük konsantrasyonlarda, sadece mevcut, protein varyantları hedef alır. Bu teknolojinin uygulanması sayesinde, seçici insan ALS beyin dokusunda bulunan TDP-43 protein varyantları antikorlar almıştır. Bu protokol, seçici olarak farklı biyolojik süreç ve hastalıkların çok çeşitli olan protein varyantları bağlanan üreten reaktifler için geçerli olmalıdır bekler.
Introduction
protein varyantlarının varlığı, Alzheimer, Parkinson, ALS ve frontotemporal demans (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 gibi nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere bir çok hastalığın ilerlemesinde bir faktör olarak implike edilmiştir , 10,11. Proteinler, beta-amiloid ve alfa-sinüklein oligomerik biçimleri, Alzheimer ve Parkinson sırasıyla 2,3,4,5 sorumlu toksik türler olduğu düşünülmektedir. TAR DNA-bağlama proteini 43 (TDP-43) agregalar ALS FTD 12,13,14 ile bağlantılı olmuştur. Bu nedenle seçici farklı protein varyantları olarak teşhis belirteçleri ve potansiyel terapötik hizmet güçlü araçlar olabilir hedefleyebilir antikorlar gibi reaktifler. Bu çalışmada, ancak bu yazıda anlatılan teknik prot geniş bir yelpazesine karşı reaktif izolasyonu için geçerli olmalıdır, seçici ALS implike TDP-43 protein varyantlarını bağlanan reaktif geliştirilmesi üzerine odaklanmıştırein varyantları arasından seçilir.
TDP-43 sitoplazmik yığılması ALS 15,16,17,18,19 patolojik özellik olarak tanımlanmıştır. Bu sitozol ve çekirdeği 15,17 arasında hareket eğilimi Tipik olarak TDP-43, normal bir bireyden alınan tüm hücre çekirdeğinde bulunur. TDP-43 Ancak, ALS toplanan formlar hastalığın ilerlemesi 16,20 sırasında sitoplazmaya çekirdekten TDP-43 hareketini düşündüren çekirdeğinde bulunan düşük konsantrasyonları ile seçin nöronların sitoplazmasında ve glia tespit edilir. TDP-43 toplama ALS vakalarının çoğunda bulunan iken, mutasyonlarla bağlantılı olan% 1, toplam ALS vakalarının (veya% 15 ailesel ALS vakalarının -20%) -2% beri tüm durumlar için hesap değil süperoksit dismutaz 1 (SOD1) gen 15,17. Çünkü ALS vakalarının büyük çoğunluğunda TDP-43 önemli rolü, burada seçici olan TDP-43 varyantları bağlanabilen bu antikor bazlı reaktifler geliştirmeye odaklanmakBizim yeni AFM tabanlı biopanning teknikleri kullanılarak insan ALS beyin dokusunda mevcut.
Başlangıçta biz antikor bağlanma etki çeşitli bir repertuar gerekir. Biz üç farklı faj gösterim tek zincir değişken alan antikor fragmanı (scFv'ler) kütüphaneleri, (Tomlinson I ve J ve Levhalar kütüphaneler 21) birleştirdi. kaydırma işlemi negatif ve pozitif kaydırma evreye ayrılır. Kütüphanelerden fajlar ilk olarak çok sayıda hedef dışı antijenleri hariç reaktif Enterobacteria fajı sırasında negatif bir geçişle işleme tabi tutulmaktadır. Her hedef dışı antijene karşı olumsuz her panlamadan tamamlanmasından sonra, süreç dışı hedef antijenleri bağlama tüm faj kaldırıldı emin olmak için AFM görüntüleme ile izlenir. Sadece tüm reaktif fajlar kaldırılır AFM görüntüleme ile doğruladıktan sonra bir sonraki hedefe geçin yoktur. ALS karışmış TDP-43 yönlerine karşı reaktifler izole etmek için aşağıdaki negatif kaydırma antijenler kullanılmıştır: 1), BSA zayıf ya da olmayan spesifik proteinlere bağlanan faj kaldırmak için; 2) toplu alfa-sinüklein toplu proteinlerin genel yapı elemanları bağlanan faj kaldırmak için; 3), insan beyin dokusu homojen halleri herhangi bir protein ya da sağlıklı bir insan beyin dokusunun ölüm sonrası örneklerdeki mevcut diğer bileşenlere bağlanan faj kaldırmak için; 4) Sağlıklı insan beyninin ile ilgili tüm TDP-43 formları bağlanan faj kaldırmak için sağlıklı insan beyninden TDP-43 immunoprecipitated; ve 5) TDP-43-olmayan ALS patoloji ile ilişkili TDP-43 türevleri bağlayan faj kaldırmak için FTD beyin homojenatlar izole immunoprecipitated. Tüm hedef dışı antijenlere karşı reaktif her faj çıkarılmasından sonra, daha sonra insan ALS beyin dokusundan imüno Bu durumda TDP-43, ilgi konusu antijen bağlayan antikor fragmanları izole edilmiştir sırasında pozitif kaydırma aşamasına ilerledi. Bu izole edilmiş antikorlar TDP-43 toplanan veya modifiye edilmiş formları, reaktif olabilir.
"> Geleneksel faj Bio belirleme pozitif kaydırma faz 22,23 üzerinde odaklanmıştır. Genellikle ilgi konusu hedef, immobilize edilmekte, faj kütüphanesi ilave edildi ve bağlanmış fajlar. Bu amplifikasyon ve kuluçka işlemi getirici fajlar daha sonra güçlendirilir. Yıkanır ve tekrar hedefe ilave Bu işlem varyasyonları, hedef antijenleri geniş bir karşı antikor reaktifleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, genellikle pozitif bağlanma faj yüzdesini arttırmak için birçok kez tekrarlanır., genel olarak, saflaştırılmış hedef antijenin 24,25,26 büyük miktarda gerektirir, Süreç, sadece hedef antijenin eser miktarda gerektirir, oysa. 27, burada tarif edilen protokol saflaştırma ve yatay kaydırma için gerek kalmadan çok düşük konsantrasyonlarda mevcut olan seçici olarak bağlanan bir hedef antijene karşı doğrudan yapılabilir reaktifler izole etmek için de kullanılabilir Karmaşık doku örneklerinde antijen mevcut. ayrıntılı negatif kaydırma protokollerinin kullanımı doğrulanmadı gibiAFM ile arıtılmış, ya da zenginleştirilmemiş pozitif oldukları zaman antijene karşı izole edilen klonların selektif da hedef bağlanmasının sağlar.Kasturirangan ve arkadaşları (2003) hedef 5 nanogram konsantrasyonu kullanılarak oligomerik beta-amiloid reaktif antikorları izole etmek için de benzer bir negatif ve pozitif Bio belirleme işlemini gerçekleştirmiştir. Burada seçici hastalığa spesifik protein, insan doku örnekleri doğrudan varyantları bağlama reaktiflerin nesil etkinleştirmek için bu süreci genişletin. Gelecekteki çalışmalarda daha da değil sadece burada izole reaktif tanısal değerini araştırmak değil, aynı zamanda ALS tedavisi için terapötik alaka değerlendirmek niyetinde.
Genel olarak, yeni ve AFM bazlı Bio belirleme teknolojisi, protein saflaştırma veya modifikasyonunu gerektirmeyen herhangi bir biyolojik madde içindeki bir hastalığa özgü bir protein değişkeni yalıtıldı için geçerli olmalıdır bile hedef antigen concentrations son derece düşüktür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma NIH hibe ile desteklenmiştir: R21AG042066. Biz ekran yakalama videoları oluştururken katkılarından dolayı Philip Schulz teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
- Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
- Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
- Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
- Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
- Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
- Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
- Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer’s Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
- Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer’s Disease. 28, 961-969 (2012).
- Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
- Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
- Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
- Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer’s Disease. 42, 641-650 (2014).
- Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
- Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. . Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
- Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
- Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
- Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
- Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
- Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
- Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
- Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
- Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
- Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
- Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
- Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
- Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
- Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
- Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
- Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
- Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).
