Abstract
Weil Protein-Varianten spielen kritische Rollen bei vielen Erkrankungen einschließlich TDP-43 in Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit und beta-Amyloid und Tau in Alzheimer-Krankheit, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Morphologie spezifische Reagenzien, die selektiv entwickeln kann Diese krankheitsspezifische Proteinvarianten, die Rolle dieser Varianten in Krankheitspathologie und für mögliche diagnostische und therapeutische Anwendungen zu untersuchen. Wir haben neue Rasterkraftmikroskopie (AFM), basierend Biopanning Techniken, die Isolierung von Reagentien, die selektiv erkennen krankheitsspezifische Proteinvarianten können entwickelt. Es gibt zwei wichtige Phasen in den Prozess, den negativen und positiven Panning Phasen beteiligt. Während der negativen Panning Phase werden Phagen, die Off-Target-Antigenen reaktiv sind, durch mehrere Runden der subtraktiven Panning unter Verwendung einer Reihe von sorgfältig ausgewählten off-Zielantigene eliminiert. Ein wesentliches Merkmal in der negativenPanning Phase nutzt AFM, um den Prozess zu überwachen und zu bestätigen, dass alle unerwünschten Phagen Partikel entfernt sind. Für die positive Panning Phase wird das Zielantigen von Interesse auf einer Glimmer-Oberfläche fixiert und gebundenen Phagen werden eluiert und gesiebt, um Phagen, die selektiv das Zielantigen binden identifizieren. Die Zielproteinvariante muss nicht gereinigt werden, sofern die entsprechenden negativen Panning Kontrollen verwendet wurden. Auch Zielproteinvarianten, die nur in sehr niedrigen Konzentrationen in komplexen biologischen Materials in der positiven Panning Schritt verwendet werden vorliegen. Durch Anwendung dieser Technologie übernahmen wir Antikörper gegen Proteinvarianten der TDP-43, die selektiv in menschlichen ALS Hirngewebe gefunden werden. Wir erwarten, dass dieses Protokoll anwendbar sein sollte, um die Erzeugung Reagentien, die selektiv binden Proteinvarianten in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten vorkommen.
Introduction
Die Anwesenheit von Protein-Varianten wurde als ein Faktor beim Fortschreiten vieler Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, ALS und frontotemporale Demenz (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 verwickelt , 10,11. Oligomere Formen der Proteine beta-Amyloid und alpha-Synuclein sind gedacht, um die toxischen Spezies von Alzheimer und Parkinson, jeweils 2,3,4,5 verantwortlich. Aggregate der TAR DNA-bindende Protein 43 (TDP-43) wurden an ALS und FTD 12,13,14 verbunden. Daher Reagenzien wie Antikörpern, die selektiv die verschiedenen Proteinvarianten können leistungsfähige Werkzeuge, um als diagnostische Marker und potenziellen Therapeutika dienen können. In dieser Studie haben wir uns auf die Entwicklung von Reagenzien, die selektiv binden Varianten des TDP-43-Proteins in ALS verwickelt, aber die Technik, die in diesem Dokument beschriebenen sollte für die Isolierung von Reagenzien werden gegenüber einer Vielzahl von protEin Varianten.
Zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 wurde als pathologisches Merkmal bei ALS 15,16,17,18,19 identifiziert. Typischerweise TDP-43 ist im Kern von allen Zellen, die von einem normalen Individuum gefunden werden, obwohl es zwischen Cytosol und Nukleus 15,17 bewegen tendiert. Bei ALS aggregierten Formen von TDP-43 sind im Zytoplasma der ausgewählten Neuronen und Glia mit geringeren Konzentrationen in den Zellkern was auf die Bewegung des TDP-43 aus dem Zellkern in das Cytoplasma bei der Krankheitsprogression 16,20 gefunden detektiert. Während Aggregation von TDP-43 ist in den meisten Fällen gefunden, ALS, ist es nicht in allen Fällen, da 1% bis 2% der gesamten ALS Fälle (oder 15% -20% der familiären ALS Fälle) werden, um Mutationen in die verknüpfte Konto Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) Gen 15,17. Wegen der wichtigen Rolle der TDP-43 in der überwiegenden Mehrheit der Fälle ALS, hier konzentrieren wir uns auf die Entwicklung von Antikörper-basierten Reagenzien, die selektiv an TDP-43-Varianten, die sich binden könnenin der menschlichen Nutzung unserer neuartigen AFM basierend Biopanning Techniken ALS Hirngewebe vorhanden.
Zunächst brauchen wir ein breites Repertoire von Antikörper-Bindungsdomänen. Wir kombinierten drei verschiedenen Phagen-Display-single chain variable Domäne Antikörperfragment (scFv) Bibliotheken (Tomlinson I und J und Blätter Bibliotheken 21). Die Panning Prozess ist in negative und positive Panning Phasen unterteilt. Phagen aus den Bibliotheken werden zuerst mit der negativen Panning während welcher Phagen reaktiv mehreren Off-Target-Antigene ausgeschlossen unterworfen. Nach dem Abschluss jeder Runde der negativen Panning gegen jede Off-Target-Antigen wird der Prozess durch AFM überwacht, um sicherzustellen, dass alle Phagenbindung die Off-Target-Antigene wurden entfernt. Erst nach Überprüfung durch AFM, die alle reaktiven Phagen entfernt werden wir gehen in die nächste Ziel. Um Reagenzien gegen TDP-43-Varianten bei ALS beteiligt isolieren wir benutzt die folgenden negativen Panning-Antigene: 1) BSA, um Phagen, die schwach oder nicht-spezifisch an Proteine binden, zu entfernen; 2) aggregierte Alpha-Synuclein, um Phagen, die generische Strukturelemente der aggregierten Proteine binden zu entfernen; 3) menschliche Gehirn Gewebehomogenaten auf Phagen, die auf alle Proteine oder andere in Post-mortem-Proben von gesunden menschlichen Hirngewebe vorhandenen Komponenten zu binden, zu entfernen; 4) immun TDP-43 von gesunden menschlichen Gehirn auf Phagen, die für alle TDP-43 bildet mit gesunden menschlichen Gehirn assoziiert binden zu entfernen; und 5) immunpräzipitiert TDP-43 isoliert von FTD Hirnhomogenaten auf Phagen, die TDP-43-Varianten mit nicht-ALS-Pathologie assoziiert binden zu entfernen. Nach Entfernung aller Phagen an alle Off-Target-Antigenen reaktiv sind, schließlich wurden die positive Schwenkphase, in der Antikörperfragmenten, die das Antigen von Interesse binden, isoliert werden, in diesem Fall TDP-43 von menschlichem ALS Hirngewebe immunpräzipitiert. Diese isolierten Antikörper können aggregiert oder modifizierte Formen von TDP-43 reagieren.
"> Konventionelle Phagen Biopanning konzentriert sich vor allem auf die positive Phase 22,23 Panning. Gewöhnlich wird die interessierende Target immobilisiert ist, die Phagen-Bibliothek hinzugefügt und gebundene Phagen eluiert. Die Phagen werden dann verstärkt und in die Richt erneut. Diese Verstärkung und Inkubationsprozesses wird üblicherweise mehrmals wiederholt, um den Prozentsatz an positiven bindenden Phagen zu erhöhen. Obwohl Variationen dieser Verfahren sind weitgehend verwendet worden, um Antikörper-Reagenzien gegen ein breites Spektrum von Zielantigene zu isolieren, sie erfordert in der Regel große Mengen an gereinigtem Zielantigen 24,25,26, 27, wohingegen unsere Verfahren erfordert nur Spuren der Ziel-Antigen ist. Die hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Reagenzien, die selektiv an Zielantigenen, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden sind, ohne die Notwendigkeit für die Reinigung und den Schwenk direkt gegen erfolgen isolieren in komplexe Gewebeproben vorhandenen Antigen. Die Verwendung von erschöpfenden negativen Panning-Protokolle verifiziertAFM sorgt dafür, dass Klone gegen die positive Antigen isoliert sollten selektiv das Ziel binden, auch wenn sie nicht gereinigt oder angereichert.Kasturirangan und Mitarbeiter (2003) haben eine ähnliche negative und positive Biopanning Verfahren, um Antikörper zu oligomeren beta-Amyloid mit Nanogramm-Konzentration des Target 5 reaktive isolieren geführt. Hier an diesem Verfahren zu erweitern, um die Erzeugung von Reagenzien, die selektiv binden krankheitsspezifische Proteinvarianten direkt aus menschlichen Gewebeproben zu ermöglichen. In zukünftigen Studien wollen wir weiter untersuchen nicht nur den diagnostischen Wert der Reagenzien hier isoliert, sondern auch prüfen, ihre therapeutische Bedeutung für die Behandlung von ALS.
Insgesamt sollte unserer neuartigen AFM basiert Biopanning-Technologie für die Isolierung irgendkrankheitsspezifische Proteinvariante in jedes biologische Material sein, ohne die Notwendigkeit für die Proteinreinigung oder Änderung, auch wenn das Ziel-Antigen concentrations sind extrem niedrig.
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Protocol
1. Phagenproduktion
- Führen Sie alle Phagenproduktion und Biopanning Prozessen in einem biologischen Sicherheitsschrank. Produzieren Phagen Partikel aus den verschiedenen Bibliotheken (Tomlinson I und J Bibliotheken und Blätter Bibliothek 21) für das Biopanning Prozess mit den Anweisungen des Herstellers (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
BEMERKUNG: Wir verwenden mehrere Bibliotheken in unserer Panning, um die Vielfalt der zur Verfügung stehenden Antikörper zu erhöhen. - Kurz gesagt, Kulturbakterien Bestände der drei Bibliotheken in 200 ml 2 × YT, das 1% Glucose und 100 ug / ml Ampicillin auf einem Schüttler bei 37 ° C, bis die OD 600 0,4.
- Hinzufügen 8 x 10 11 KM13 Helferphagen zu 200 ml der Tomlinson I und J Bibliotheken und 8 x 10 11 VCSM13 Helferphagen zu 200 ml des Sheets Bibliothek. Bibliothek Proben mit Helferphage inkubieren 30 min bei 37 ° C ohne Schütteln.
- Zentrifugieren Sie dieKulturen bei 3.000 xg für 10 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 200 ml 2 × YT mit 0,1% Glucose, 100 ug / ml Ampicillin und 50 ug / ml Kanamycin.
- Die Kulturen O / N-Inkubation bei 30 ° C unter Schütteln und dann drehen für 30 min bei 3300 xg am folgenden Tag.
- Zugeben von 50 ml Polyethylenglykol (PEG) 8000 in 2,5 M NaCl zu den 200 ml des Überstands aus jeder der Bibliotheken und Inkubation auf Eis für 1 Std. Nach PEG-Fällung, drehen Sie die Lösungen wieder für 30 Minuten bei 3300 x g.
- 1-2 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu dem Zellpellet (abhängig von der Größe des Pellets) werden in Mikrozentrifugenröhrchen.
- Inkubieren Phagenpartikel auf Eis für 1 h bei 37 ° C unter gelegentlichem Mischen vor dem Zentrifugieren für 10 min bei 11.600 x g. Sammeln Sie den Überstand und bei -80 ° C.
- Vor dem Einfrieren übertragen ein kleines Volumen der Phagenpartikel von den drei Bibliotheken auf einen anderen Mikrozentrifugenröhrchen und den Titer jeder Bibliothekeinzeln mit TG1-Zellen, um die Konzentration zu bestimmen. Nachfolgend finden Sie eine Beschreibung der Titer Prozesses für ein Bibliothek.
- Wachsen TG1-Zellen bis zu einer OD 600 von 0,4. Fügen Sie 990 ul PBS bis 6 Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zu dem ersten Röhrchen werden 10 ul der Phagenpartikel. Nach dem Mischen entfernt 10 ul von Rohr und einem in den Rohr 2. Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden 4 Röhren.
- Gib 200 ul TG1-Zellen zu 6 Rohre und gibt 10 & mgr; l von jeder der sechs Phagenverdünnungen auf diesen Rohren. Ermöglichen, dass die Phagenpartikel während 30 min ohne Schütteln bei 37 ° C infiziert.
- Platte 100 ul der Zellen zu Luria-Bertani-Agar-Platten mit 100 ug / ml Ampicillin (LBA). Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C und dann bestimmen die pfu / ml unter Verwendung der Anzahl der sichtbaren Kolonien.
2. Negative Biopanning Prozess
Hinweis: Für den Biopanning Prozess vermeiden zu viele Gefrier-Tau der Phagen. Identifikationeally, ist es am besten für die Durchführung, wie viele der negativen Panning Schritte wie möglich an einem Tag. Nach dem Abschluss der Runden negativ oder positiv Panning gegen jedes Ziel ist es wichtig, etwas von dem Phagen bei Kontamination bei jedem Schritt zu speichern.
- 12 Runden von Negative Panning gegen Rinderserumalbumin (BSA)
- 4 ml 1 mg / ml BSA-Lösung in PBS zu 12 Immunoröhrchen inkubieren O / N bei 4 ° C.
- Kombinieren Sie 1 x 10 12 Phagenpartikel von jedem der drei Bibliotheken (beiseite eine kleine Menge dieser Phagen-Mischung für die künftige Überprüfung der negativen Panning).
- Entsorgen Sie die BSA-Lösung aus dem ersten Rohr und waschen das Rohr 2-3 mal mit PBS, um alles ungebundene BSA zu entfernen.
- Die zusammenPhagenBibliotheken zu diesem ersten Rohr, Inkubation 30 min bei RT auf den Rotator und sammeln die ungebundenen Phagen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.3 mit dem zweiten immunotube und fügen Sie die in Schritt 2.1.4 gesammelt Phagen zu dieser immunotube. Wiederholen Sie Schritt 2.1.4.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.3-2.1.4 mit den restlichen 10 Röhrchen von BSA-Lösung und dem ungebundenen Phagen nach jeder Inkubation gesammelt.
- Um zu überprüfen, Entfernung aller BSA Phagen Bindemittel eingesetzt AFM. Zugabe von 10 ul des Phagen aus Schritt 2.1.2 und 10 & mgr; l der verbleibenden Phagen nach Schritt 2.1.7 separat auf 10 ug / ml BSA zur gespaltenem Glimmer gebunden. Eine kurze Version des AFM-Verfahren wird in Abschnitt 8 beschrieben.
- Es ist wichtig, eine kleine Menge von Phagen nach Beendigung der zahlreichen Runden negativen Panning gegen jedes Ziel für den Erfolg der Pan-Prozess zu überprüfen speichern.
- 10 Runden von Negative Panning gegen verschiedene Formen von Alpha-Synuclein
HINWEIS: In diesem Projekt, um Phagen, die anderen aggregierten Formen von Proteinen, wie Alpha-Synuclein (Monomer, Dimer, Trimer usw.) und so werden wir jede dieser Phagen zu eliminieren (das Ziel ist es, so zu beseitigen binden könnte entfernen möchten wir viele kreuzreaktiven Phagen wie möglich). Zulassen gereinigte alpha-Synuclein, für mindestens 7 Tage zu aggregieren, so daß beide monomeren und oligomeren Formen für negative Panning vorliegen.- Herstellung von 4 Immunoröhrchen mit 500 ug / ml von aggregierten alpha-Synuclein in PBS und 4 Immunoröhrchen mit 100 ug / ml von aggregierten alpha-Synuclein und inkubieren O / N bei 4 ° C.
- Entsorgen Sie die Lösung aus einem der Rohre mit 500 ug / ml von aggregierten Alpha-Synuclein, waschen mit PBS und fügen Sie die Phagen-Bibliothek nach den 12 Runden von negativen Panning mit BSA gesammelt.
- Das Röhrchen 30 Minuten lang bei RT auf der Rotator und Sammeln der ungebundenen Phagen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.3 und 2.2.4 für die übrigen Röhrchen mit 500 & mgr; g / ml von aggregierten alpha-Synuclein und dann wurden die Röhrchen mit 100 & mgr; g / ml von aggregierten alpha-Synuclein Verwendung des ungebundenen Phagen nach jedem Schritt 2.2.4 aufgefangen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 unter Verwendung des Phagen nach dem ersten negativen Panning gegen 500 ug / ml von aggregierten alpha-synuclein und die Phagen nach der achten Runde der negativen Panning gegen 100 ug / ml von Alpha-Synuclein.
- Um alle negativen Bindemittel gegen beseitigen Alpha-Synuclein bereiten zwei zusätzliche Immunoröhrchen mit 500 ug / ml von aggregierten Alpha-Synuclein und wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.4.
- 10 Runden von Negative Panning gegen gesunde menschliche Gehirn Gewebehomogenat
- Hinzufügen 1x STEN Puffer (50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF und Protease Cocktail Inhibitor) an humanen Hirngewebe 28. Homogenisierung bei 24000 Upm für 1 min, Zentrifuge Proben bei 3000 Upm und sammeln Stand.
- Planen 2 Immunoröhrchen mit 2 ml von 50 ug / ml menschlichem Gehirngewebe in PBS und 8 Immunoröhrchen mit 10 & mgr; g / ml von menschlichem Gehirngewebe und inkubieren O / N bei 4 ° C.
- Die Schritte 2.2.3-2.2.5 zuerst mit den Rohren, die 50 ug / ml menschlichem Gehirngewebe und dann mit denen, die 10 ug / ml Human bregen Gewebe mit dem ungebundenen Phagen nach der negativen Panning gegen Alpha-Synuclein gesammelt.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 unter Verwendung des Phagen nach dem ersten negativen Panning gegen 50 ug / ml menschlichem Gehirngewebe und der Phage nach dem zehnten Runde der negativen Panning gegen menschliches Gehirngewebe.
- 8 Runden von Negative Panning gegen Gesunde immunpräzipitiert TDP-43
- Immunpräzipitieren gesunde TDP-43-Protein aus mit Hilfe der in Abschnitt 9 beschriebenen Protokoll gesunden Hirngewebe aufgrund geringerer Menge immunpräzipitierten Proteins führen diese Runden negativen Panning mit Glimmer.
- Spalten acht Glimmeroberflächen.
- Zur ersten Glimmer hinzuzufügen ~ 100 & mgr; l von 5 & mgr; g / ml des immunpräzipitierten Proteins und Inkubation für 5-10 min bei RT.
- 5mal mit 0,1% PBS mit Tween 20 (PBST) waschen Glimmer.
- In ~ 100 ul des Phagen nach der negativen Panning gegen gesundem Hirngewebe und Inkubation für 5-10 min beiRT.
- Auf halber Strecke der Inkubation von Schritt 2.4.5, führen Sie Schritt 2.4.3 unter Verwendung des zweiten Glimmer.
- Sammeln Sie die Phagen aus Schritt 2.4.5 und waschen Sie die Glimmer 5-mal mit PBST 0,1%.
- Waschen Sie Glimmer aus Schritt 2.4.6 und fügen Sie die Phagen aus 2.4.7.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4.4 bis 2.4.9 bis der Phagen ist negativ gegen alle acht Glimmer mit dem immun Protein verrissen. Wiederholen Sie Schritt 2.1.7 unter Verwendung des Phagen nach der ersten und achten Runde der negativen Panning.
- 2 Runden von Negative Panning gegen FTD immunpräzipitiert TDP-43
- Immunopräzipitat TDP-43-Proteins im Gehirn von Patienten mit FTD.
- Spalten 2 Glimmeroberflächen.
- Zugeben von 50 ul von 10 ug / ml FTD TDP-43 einem Glimmer. Inkubation für 5 min bei RT.
- 5mal mit 0,1% PBST waschen die Glimmer.
- Fügen Sie 50 ul der nach negativen Panning gegen gesunde TDP-43 gesammelt Phagen. Inkubation für 5 min.
- Sammeln Sie die ungebundenen Phagen.
- Repeats Schritte 2.5.3, mit dem zweiten Glimmer und ungebundenen Phagen in 2.5.6 gesammelt 2.5.6.
3. Positive Panning gegen immunpräzipitiert TDP-43 von Personen mit ALS
- Immunopräzipitat TDP-43-Proteins im Gehirn von Patienten mit ALS. Spalten 3 Glimmeroberflächen. Zugeben von 50 ul von 10 ug / ml von ALS TDP-43 einem Glimmer. Inkubation für 5 min bei RT. 5mal mit 0,1% PBST waschen die Glimmer.
- Dann werden 50 ul des nach negativer Panning gegen gesunde TDP-43 zu dem Glimmer gesammelt Phagen. Inkubation für 5 min.
- Sammeln Sie die ungebundenen Phagen. Sammeln Sie auch die gebundenen Phagen mit drei Elutionsverfahren. Es ist wichtig, alle gesammelten Phagen in diesen Panning Schritte getrennt zu halten.
- Zuerst werden 50 & mgr; l Trypsin (1 mg / ml in PBS) zu jeder Glimmer und Inkubation für nicht mehr als 10 min. Sammeln Sie die Lösung und sparen. Als nächstes werden 50 ul 100 mM Triethylamin (TEA) zu jedem Glimmer und Inkubation für nicht mehr als 10 min. Collect der Lösung hinzuzufügen gleichen Volumen von 1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,4 und speichern.
- Drittens werden 50 ul TG1 bei OD 600 von 0,4 direkt auf dem Glimmer und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. Fügen Sie außerdem die von den beiden Elutionsverfahren gesammelt Phagen in 3.3.1 zu 100 ul TG1 bei OD 600 von 0,4 und Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1 mit einem zweiten Glimmer.
- Nehmen Sie die ungebundenen Phagen in 3.3.2 gesammelt. mit dem ersten Glimmer mit ALS TDP-43 und in den zweiten Glimmer mit ALS TDP-43 hinzuzufügen. Inkubation für 5 min.
- Wiederholen Sie alle Schritte in 3.3 für diese zweite Satz von Glimmer.
- Kombinieren Sie die TG1-Zellen mit den Phagen mit Trypsin von den beiden ALS TDP-43 Glimmer und Teller auf LBA Platten eluiert infiziert. Wiederholen des gleichen Verfahrens für das TEA und TG1 eluierten Phagen aus beiden ALS TDP-43 Glimmer für insgesamt drei Platten.
HINWEIS: Aufgrund der TDP-43 Beteiligung an den ALS und FTD, einige der Klone in der isoliertzwei Runden positive Panning gegen ALS TDP-43 speziell für dieses Ziel sein, aber einige können auch binden FTD. Um besser zu isolieren ALS spezifische Klone, nehmen Sie die ungebundenen Phagen nach 2 Runden negativen Panning gegen gesammelt FTD TDP-43 (da diese beiden Runden der negativen Waschen sollte jedes Ziel, die reaktionsfähig ist, um FTD TDP-43 entfernt haben) und diese Phagen eine weitere Runde von positiven Panning gegen die ALS-TDP-43-Antigen auf Glimmer (Vorbereitung der ALS TDP-43 Glimmer, wie oben in 3.3 und 3.4 beschrieben). - Wiederholen Sie alle Schritte in 3.3 mit diesem dritten ALS Glimmer und Platte die infizierten TG1-Zellen auf drei LBA Platten O / N bei 37 ° C. Am nächsten Tag zählen die Anzahl der Kolonien auf den Platten 6 LBA mit den potentiellen ALS Klone. Es sollte weniger Kolonien auf den drei LBA Platten mit den potentiellen ALS Klone nach der dritten Runde von Panning positive Vergleich zu den drei LBA Platten nach zwei Runden Panning positive sein.
4. Die Kultivierung und Phage ProduktIon Potential positiven Klonen gegen ALS Spezifische TDP-43
- Wachsen jede Kolonie aus den 6 Platten in 96-Well-Platten, die 100 & mgr; l 2xYT mit 1% Glucose und 100 ug / ml Ampicillin auf einem Schüttler bei 37 ° CO / N.
- Am nächsten Tag Übertragungs 10 ul aus den Vertiefungen, welche die Klone aus den 3 Platten LBA nach der dritten Runde von Panning positive mit der ALS TDP-43-Protein in Mikroröhrchen, die 1 ml 2xYT mit 1% Glucose und 100 ug / ml Ampicillin .
- Hinzufügen Glycerin zu allen Kulturen in den 96-Well-Platten bis zu einer Endkonzentration von 15% und ein Einfrieren der Platten bei -80 ° C. Ermöglichen, dass die 1-ml-Kulturen, für 2-3 Stunden bei 37 ° C Schütteln wachsen.
- Werden 10 9 KM13 Helferphagen und ermöglichen dem Helfer-Phagen, um für 1 Stunde bei 37 ° C unter Schütteln infizieren. Zentrifuge die Zellen für 10 min bei 3.000 × g, der Überstand verworfen und 1 ml 2 × YT mit 0,1% Glucose, 100 ug / ml Ampicillin und 50 ug / ml kanamycin.
- Kultur die Zellen O / N bei 30 ° C unter Schütteln. Zentrifuge werden die Röhrchen bei 3.300 xg für 30 min den Überstand, neue Mikrozentrifugenröhrchen und 250 & mgr; l PEG / NaCl in jedes Röhrchen.
- Die Röhrchen auf Eis für 1 Stunde inkubiert. Wieder Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 3300 xg für 30 min den Überstand verwerfen und fügen Sie 100 ul PBS in jedes Röhrchen.
- Die Röhrchen auf Eis für 1 Stunde inkubiert. Drehen Sie die Rohre für 10 min bei 11.600 xg und den Überstand in neue Röhrchen. Bewahren Sie die Phagen bei -80 ° C.
5. Sequenzierung des Potenzial ALS Clones
- Wiederholen Sie Schritt 4.2 und ermöglichen Kulturen zu O / N bei 37 ° C unter Schütteln wachsen. Am nächsten Tag durchzuführen DNA Plasmid-Präparationen der Klone gemß den Anweisungen des Herstellers. Sequenz, die das Klonen mit dem entsprechenden Vorwärts- und Rückwärtsprimer.
6. Abschirmung Potenzial positiven Klonen gegen ALS Spezifische TDP-43 Verwenden Indirekte ELISA
- 100 ul 2,5 ug / ml von ALS, FTD und gesunden menschlichen Hirngewebe zu den Vertiefungen einer hohen Bindungs ELISA Platte für jede potentielle ALS-Klon. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 1 Stunde unter langsamem Schütteln inkubiert.
- 3 mal mit 0,1% PBST, waschen. Nach Zugabe von 200 ul 2% Milchpulver in PBS zu der Vertiefung und inkubiere die Platten bei 37 ° C für 1 Stunde unter langsamem Schütteln inkubiert.
- Wiederholen des Waschschrittes, und dann werden 100 ul jeder Phage in die Vertiefungen verdünnt mindestens 1/100 in PBS. Nach der Inkubation und Waschschritte, werden 100 ul einer 1 / 1.000 anti-M13-HRP in jede Kammer. Waschen Sie die Platten und Visualisierung mit Hilfe der ELISA Femto Chemilumineszenzsubstrat Kit.
7. scFv Produktion und Screening mit Indirekter ELISA
- Wachsen HB 2151 Zellen bis zu einer OD 600 von 0,4. In 5 ul der verschiedenen Phagen zu 20 ul der HB 2151 Zellen. Ermöglichen die Phagen 30 min bei 37 ° C ohne Schütteln infizieren. Teilen Sie LBA Platten in Netze sodass etwa 20 Klone können auf jedem plattiert werden.
- Hinzufügen 5-10 ul jeder Phagen infizierten Bakterien auf die Platte und Inkubation O / N bei 37 ° C. Am nächsten Tag setzen individuelle Kolonien zu 1 ml 2 × YT mit 0,1% Glucose und 100 ug / ml Ampicillin und Schütteln bei 37 ° C für 3-4 Stunden, bis die OD 600 0,6.
- 1 ul 1 M Isopropylthiogalactosid (IPTG) in jedes Röhrchen und inkubieren O / N bei 30 ° C unter Schütteln. Drehen Sie die Rohre bei 11.600 g für 10 min geerntet und der Überstand für ELISA-Tests.
- Für den ELISA-Tests gelten die gleichen Verfahren in Kapitel 6, außer statt Phagen in 6,5 fügen Sie die scFv unverwässert und für 6.6 werden 100 ul einer 1 / 1.000 9E10 HRP.
8. AFM-Prozess
- 10-20 ul des Zielantigens an gespaltenem Glimmer und Inkubation für 5-10 min. 5-mal mit Wasser Waschen Sie die Glimmer. In 10 bis 20 & mgr; l der Phagen auf den Glimmer und Inkubation für 5-10 min.
- Waschen Sie die Glimmer 5 mal wieder with Wasser und lassen Sie den Glimmer an der Luft trocknen. Visualisieren Phagenbindung mit AFM 1. Führen Sie das Verfahren unter Verwendung von AFM AFM-Tapping-Modus mit einem Nanoscope IIIa-Controller an der Luft bei RT 29. Die Silizium-AFM-Sonden haben eine Resonanzfrequenz von 300 kHz und einer Federkonstante von 40 N / m. Verwenden Sie eine Abtastrate von 3,05 Hz und einer Scanauflösung von 512 Abtastungen / Zeile.
- Verarbeiten Sie die Bilder von Grund Abflachung der Hintergrund, um sicherzustellen, dass alle Partikelgrößen sind in jedem Bild vergleichbar. Phage Breite (nicht der Länge) von Bild zu Bild durch andere Partikelgrößen und den Abtastbereich variieren, aber es wird nie beeinträchtigt die Genauigkeit, ob Phagen an das Antigen bindet.
- Wenn bei AFM Überprüfung für jeden Satz von negativen Panning Phagen auf dem Glimmer sichtbar, führen Sie zusätzlich Runden, bis keine Phagen werden, bevor Sie mit der nächsten negativen Panning nachgewiesen.
9. Immunpräzipitation von Zielantigen
- Um isolate das Zielantigen (TDP-43), gibt man 250 & mgr; g nachhomogenisieren Hirngewebe (von motorischen Cortex), 100 ul von 1/100 Verdünnung von anti-TDP 43 polyklonalen und 1x STEN Puffer auf 700 & mgr; l Gesamtvolumen in ein Eppendorf Rohr 28.
- Inkubieren Sie O / N bei 4 ° C auf einem Rotator. Wash A / G-Agarosekügelchen mit dem 1x STEN Puffer 2-3 mal und 25 ml in das Gewebe Mischung. Inkubieren bei 4 ° C für 1,5 h auf einem Rotator und dann bei 2000-4000 rpm zentrifugieren für 1 Min.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen das Pellet einmal mit 1x STEN Puffer und 5-mal mit PBS. In 40 bis 60 ul 1x STEN-Puffer zu dem Pellet und kochen für 5 min. Nach den Proben sind kühl, Zentrifuge und sammeln Sie den Überstand. Verwenden SDS-PAGE und Western-Blotting, um Erfolg der Immunpräzipitation Gang 30 zu verifizieren.
10. Dot-Blot-Analyse
- Schneiden Sie Nitrocellulosepapier in kleine Rechtecke für jeden Klon, der getestet werden soll. Punkt 2 ul von ALS, FTD und gesunde menschliche Gehirn Gewebeproben zu dem Nitrocellulose-Papier und lassen Sie es vollständig trocknen.
- 1-2 ml von 5% Milchpulver in PBS und lassen Sie es für 1 h bei RT schütteln. 1 ml der 1/100 Verdünnung jeder Phagen und lassen Sie es schütteln O / N bei 4 ° C. 3 mal, jeweils 10 Minuten mit 0,5% PBST Waschen der Membran.
- 1 ml der 1/1000-Verdünnung von Anti-M13-HRP und lassen Sie es für 1 h bei RT schütteln. Wiederholen Sie die Waschverfahren und visualisiert mit Western Chemilumineszenz-Lösung.
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Representative Results
In Abbildung 1 ist die schematische zeigt die negativen Panning von denen wir entfernt Phagenbindung off-Zielantigene aus der Bibliothek unter Verwendung von Immunoröhrchen. Wir haben zunächst mit BSA begonnen, da dies ein gemeinsames Blockmittel und jeder Phage, unspezifisch reagieren mit dieser Ziel problematisch wäre in Zukunft Immunoassays. Als nächstes wir entfernt Bindemittel aggregierte alpha-Synuclein Phagen mit generischen Strukturen der aggregierten Proteine (dh, ein Antikörper, sein kreuzreaktiv aggregierten alpha-Synuclein würde, TDP-43, Abeta, etc.) reaktiv sind zu beseitigen. AFM Ergebnisse zeigten Phagenbindung nach dem 1. Runde des negativen Panning gegen die aggregierten Alpha-Synuclein (2A) und keine Bindung nach 8 Runden (2B). Wir haben dann negativ gegen gesunden Hirngewebe geschwenkt, um Phagen zu entfernen Bindung der vielen in gesunden menschlichen Hirnhomogenat Antigene präsentieren. 2C (2D). Da die Menge des gesunden und FTD immunpräzipitiert TDP-43 Proteins für Panning verfügbar war niedrig, mit Glimmer anstelle Immunoröhrchen verwendet weniger Volumen und damit abgesenkt Gesamtprotein verbraucht (Figur 3). Nach 8 Runden negativen Panning gegen gesunden immun TDP-43 wurde die Phagen unterteilt. Die Hälfte der Phage wurde in zwei Runden der negativen Panning gegen FTD TDP-43 aufgewendet. Das Ziel war es, eventuelle FTD TDP-43 reaktiven Klone (aufgrund des TDP-43 Einbeziehung in FTD) zu beseitigen, unter Beibehaltung mögliche ALS TDP-43 spezifische Klone.
Für die positive Panning Abschnitt (4), haben wir ebenfalls verwendet Glimmer als Substrat zum Materialeinsatz zu minimieren. Wir nutzten die ungebundenen Phagen nach der FTD TDP-43 negativen Panning gegen ALS TDP-43 zu einem zu erwerbenALS-spezifischen Klonen. Wir auch positiv gegen ALS TDP-43 zwei Mal in dem Fall, dass wir nicht Klone nach der Verwendung der nicht gebundenen Phagen von der negativen Panning gegen FTD TDP-43 nicht gestattet, geschwenkt. Nachdem die gesamte Panning, ergab unsere drei Elutionsverfahren 154 Klone aus der zwei positive Panning gegen ALS TDP-43 und 45 potenzielle ALS spezifische Klone (Klone, die an ALS und FTD reaktiv sein können) (unter Verwendung der nicht gebundenen Phagen aus der FTD TDP 43 negativen Panning).
Um die 45 potentiellen ALS spezifische Klone weiter zu reduzieren, werden die Klone sequenziert, und nur die Klone ohne Stop-Codons wurden weiter betrachtet, mit Ausnahme eines Klons, der zweimal gezeigt. Dies hat uns mit 23 potenziellen ALS spezifische Klone. Nach der Vorbereitung sowohl Phagen- als auch Lösungs scFv mit diesen Klonen, werden sie in indirekten ELISAs auf Spezifität gegen ALS Tissue getestet. Fast alle der Phagen zeigten eine Präferenz für ALS Gewebe über das gesunde Gewebe (5). Ähnliche Ergebnisse sind obtained beim Vergleich Phagenbindung an ALS zu FTD Gewebe (Abbildung 6). Für zukünftige Studien ist es wichtig, dass diese Klone exprimieren hohe Ausbeuten an funktionellem scFvs, so dass wir produziert Kleinserien der unterschiedlichen scFvs und durchgeführt ähnlichen indirekten ELISAs. Vergleich der scFv-Bindung an ALS Gewebe sowohl gesunde (Figur 7) und FTD Gewebe (Figur 8) zeigte wiederum eine selektive Bindung an ALS Tissue in fast allen Klonen.
Wir haben eine andere Immunoassay (Dot-Blots), um weiter zu verifizieren Bindung an ALS Gewebe und auch festzustellen, welche Klone in anderen immunologischen Anwendungen reaktiv sind. Clone 2A Bindung an ALS Gewebe wird angezeigt (Bild 9). Alle diese Klone zeigten vielversprechende Ergebnisse in einem oder beiden der Phagen und scFv-ELISA. Diese Ergebnisse bestätigen, dass unsere AFM basiert Biopanning Verfahren ist eine sehr leistungsfähige Technik, die verwendet werden können, um Reagenzien, die selektiv binden krankheitsspezifische Protein vari erzeugenAmeisen direkt von komplexen Quellen.
Abbildung 1. Negative Biopanning Prozess Verwendung Immunoröhrchen. Schematischer Nachweis der negativen Biopanning Prozess. Phagen, die Proteine wie BSA, aggregiert Alpha-Synuclein und gesundes Hirngewebe werden mit Immunoröhrchen entfernt reaktiv sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Die Bestätigung der Ergebnisse Negative Panning. AFM wird verwendet, um die negativen Panning Schritte gegen die verschiedenen Ziele zu überwachen, um sicherzustellen, dass alle reaktiven Phagen werden entfernt. Hier zeigen wir einige der AFM-Ergebnisse, die dieNiveau der Phagenbindung vor und nach der negativen Panning. (A) Phage Bindung kann nach der ersten Runde der negativen Panning aggregierte Alpha-Synuclein-Partikel festgestellt werden, aber (B) keine Phagen sichtbar nach 8 Runden von negativen Panning sind. (C ) Nachdem die erste Runde der negativen Panning gegen gesundes Gewebe Phagenbindung ist offensichtlich, aber (D) keine Bindung wird nach 10 Runden negativen Panning nachgewiesen. Alle Bilder sind 5 um. Die großen weißen Strukturen auf den AFM-Bilder sind in der Regel aufgrund von in den Puffern oder Rest PEG aus der PEG-Fällungsschritt bei Phagenproduktion vorhandenen Salze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Negative BiopannProzess Verwendung Mica. Schematische demonstrieren zusätzliche negative Biopanning mit Glimmer. Angesichts des begrenzten Probenglimmeroberfläche eingesetzt wird, um zuerst zu beseitigen Bindemittel, um gesunde und dann FTD immunpräzipitiert TDP-43. Bevor Sie mit den beiden Runden der negativen Panning gegen FTD TDP-43 wird die Phagen in zwei Hälften geteilt (im Falle einer erfolglosen Isolierung von ALS TDP-43 exklusive Phagen während der positiven Phase-Panning). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Zahl.
Abbildung 4. ALS Positive Biopanning Prozess. Schematischer Nachweis der ALS positive Biopanning Prozess. Die ungebundenen Phagen nach dem negativen Panning gegen FTD TDP-43 werden in einem Rund positiver Panning gegen ALS verwendet TDP-43 eluiert mehr ALSTDP-43 spezifische Klone. Auch sind zwei Runden positive Panning gegen ALS TDP-43 erfolgt mit Glimmeroberfläche und die ungebundenen Phagen nach negativen Panning gegen gesunden immun TDP-43 (die gebundenen Phagen werden eluiert, da diese Phagen nicht gesund TDP-43 binden, aber einige geführt kann sowohl mit ALS und FTD) kreuzreaktiv ist. Drei Elutionsverfahren verwendet (Trypsin, TEA und TG1-Zellen), um sicherzustellen, dass alle gebundenen Phagen werden entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Phagen ELISA Screening potenzieller ALS Clones (ALS gegenüber HT). Mit homogenisiert menschlichen ALS, FTD und gesundes Hirngewebe (HT) Proben, die wir durchgeführt indirekten ELISA unter Verwendung von Phagen aus den verschiedenen Klonen hergestellt. Ergebnisse dargestellt werden, als das Verhältnis zu gesunden Gewebeproben. Die Ergebnisse zeigten, dass einige Klone unterscheiden TDP-43 bei ALS-Patienten und bei gesunden gefunden. Die ALS, FTD und HT Gewebe sind eine Mischung aus Gehirnproben (Motorkortex) aus drei Personen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Phagen ELISA Screening potenzieller ALS Clones (ALS gegen FTD). Hier zeigen wir die Phagen-ELISA-Ergebnisse von ALS gegen FTD-Patienten. Die meisten Klone haben eine Vorliebe für ALS auf FTD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 7. scFv-ELISA-Screening potenzieller ALS Clones (ALS gegenüber HT). Mit Hilfe der von jedem Klon können wir Klone, die eine Vorliebe für die TDP-43 von ALS-Patienten über gesunde habe beobachten hergestellt scFvs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Zahl.
Abbildung 8. scFv-ELISA-Screening potenzieller ALS Clones (ALS gegen FTD). Der Erfolg unserer Panning wird weiter gezeigt, beim Vergleich von ALS zu FTD für die unterschiedlichen scFvs in den indirekten ELISAs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen .
Abbildung 9. Dot-Blot-Analyse von ALS Potential Clones. Mit Dot-Blot statt ELISA ist eine weitere Technik, um die Spezifität der Klone für ALS auf FTD oder HT zeigen. Clone 2A gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus NIH: R21AG042066. Wir möchten Philip Schulz für seine Verdienste bei der Erstellung der Videos mit Bildschirmaufzeichnungen danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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