Роман Атомно-силовая микроскопия на основе Биопэннинг для изоляции морфологии специфических реагентов против TDP-43 варианты, в амиотрофического латерального склероза
Summary
Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.
Abstract
Потому что варианты белков играют важную роль во многих заболеваний, включая TDP-43 в боковой амиотрофический склероз (БАС), альфа-синуклеина в болезнь Паркинсона и бета-амилоида и тау при болезни Альцгеймера, крайне важно развивать морфологии специфических реагентов, которые могут выборочно воздействовать на это болезнь-специфический белок вариантов для изучения роли этих вариантов в патологии болезни и для потенциальных диагностических и терапевтических применений. Мы разработали новые атомно-силовой микроскопии (АСМ) методы Биопэннинг основе, которые позволяют изолировать реагентов, которые избирательно распознают конкретных заболеваний варианты белка. Есть два основных этапов, участвующие в процессе, отрицательных и положительных фаз панорамирования. Во время отрицательной фазы панорамирования, фаги, которые реагируют на офф-целевых антигенов выводится через несколько раундов субтрактивного панорамирования с использованием ряда тщательно отобранных мимо цели антигенов. Ключевой особенностью в отрицательнойпанорамирование фаза использования АСМ для наблюдения за процессом и убедиться, что все нежелательные частицы фага удаляются. Для положительной фазы панорамирования, антиген-мишень представляет интерес фиксируется на поверхности слюды и связанные фаги элюируют и скринингу для выявления фагов, которые селективно связываются с антигеном-мишенью. Вариант целевой белок не должны быть очищены обеспечивая соответствующие отрицательные контроли панорамирования были использованы. Даже целевой варианты белка, которые присутствуют только в очень низких концентрациях в комплексном биологического материала могут быть использованы в положительном этапе дражирования. Путем применения этой технологии, мы приобрели антитела к вариантам белковых TDP-43, которые избирательно, найденных в человеческой ALS ткани головного мозга. Мы полагаем, что этот протокол должен быть применим к генерации реагентов, которые селективно связываются варианты белка, присутствующего в широком разнообразии различных биологических процессов и заболеваний.
Introduction
Наличие вариантов белков были причастны как фактор прогрессирования многих заболеваний, включая нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, ALS и лобно деменции (УТД) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Олигомерных форм белков бета-амилоида и альфа-синуклеина, как считается, токсичных видов, ответственные за болезнь Альцгеймера и Паркинсона, соответственно 2,3,4,5. Агрегаты гудрона ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) были связаны с БАС и УТД 12,13,14. Поэтому реагентов, таких как антитела, которые могут выборочно воздействовать на различные варианты белка могут стать мощными инструментами, чтобы служить в качестве диагностических маркеров и потенциальных терапии. В этом исследовании мы сосредоточились на разработке реагентов, которые избирательно связываются варианты TDP-43 белка, причастных к ALS, однако методика рассмотрены в этой статье, должны применяться к изоляции реагентов против широкого спектра протВарианты Эйн.
Цитоплазма агрегация TDP-43 был определен как патологический функции в БАС 15,16,17,18,19. Обычно TDP-43 находится в ядре всех клеток нормального человека, хотя это, как правило, для перемещения между цитозоле и ядре 15,17. Тем не менее, в АЛС агрегированных форм TDP-43 обнаружены в цитоплазме некоторых нейронов и глии с более низких концентрациях, найденных в ядре предполагая движение TDP-43 из ядра в цитоплазму при прогрессирования заболевания 16,20. В то время как агрегация TDP-43 находится в большинстве случаев БАС, она не учитывает всех случаях, так как 1% -2% от общего числа случаев БАС (или 15% -20% семейных случаев БАС), связаны с мутациями в супероксиддисмутаза 1 (SOD1) гена 15,17. Из-за важной роли TDP-43 в подавляющем большинстве случаев БАС, здесь мы сосредоточены на разработке реагентов антител на основе, которая может выборочно связываются с TDP-43 вариантов, которыеприсутствует в человеческой ALS мозговой ткани, используя наши методы, основанные Биопэннинг роман АСМ.
Первоначально мы должны разнообразный репертуар антител связывающих доменов. Мы объединили три разные фагов из одной цепи вариабельного домена фрагмента антитела (scFvs) библиотеками (Томлинсон I и J и листов библиотеки 21). Способ панорамирования делится на отрицательных и положительных фаз панорамирования. Фагов из библиотеки сначала подвергаются отрицательному процесса панорамирования, в течение которого фагов реагирует на несколько офф-антигенов-мишеней исключаются. После завершения каждого раунда отрицательного панорамирования против каждого офф-антиген-мишень, процесс контролируется АСМ обеспечить, чтобы все фага связывания с-антигенов-мишеней были удалены. Только после проверки с помощью АСМ изображений, что все реактивные фаги удаляют мы переходим к следующей цели. Для выделения реагенты против TDP-43 вариантов, вовлеченных в БАС мы использовали следующие негативные панорамирования антигены: 1) БСА, чтобы удалить фага, которые связывают слабо или неспецифически с белками; 2) агрегированной альфа-синуклеина, чтобы удалить фаги, которые связываются с общих структурных элементов агрегированных белков; 3) гомогенаты головного мозга человека, чтобы удалить фаги, которые связываются с какими-либо белками или других компонентов, присутствующих в образцах посмертных здорового человеческого мозга ткани; 4) иммунопреципитировали TDP-43 от здорового человека мозг, чтобы удалить фаги, которые связывают всех TDP-43 форм, связанных со здоровым человеческим мозгом; и 5) иммунопреципитировали TDP-43 изолирован от УТД гомогенатах мозга, чтобы удалить фаги, которые связывают TDP-43 варианты, связанные с непредоставлением ALS патологии. После удаления всех фага реактивной всем вне антигенов-мишеней, то затем перешел к положительной фазы панорамирования, в течение которого фрагменты антител, которые связываются с антигеном интерес изолированы, в данном случае TDP-43 иммунопреципитации из человеческой мозговой ткани ALS. Эти изолированные антитела могут быть реактивной агрегированным или модифицированных форм TDP-43.
"> Обычные фага биопэннинга ориентирован в основном на положительной фазе панорамирования 22,23. Обычно целевой интерес иммобилизован, добавляют фаговой библиотеки и связанные фаги элюируют. Фаги затем усиливаются и вновь добавляют к цели. Этот процесс амплификации и инкубации обычно повторяется несколько раз, чтобы увеличить процент положительного связывания фага. В то время как варианты этого процесса широко используются, чтобы изолировать реагентов антител против широкого спектра антигенов-мишеней, они как правило, требует больших количеств очищенного антигена-мишени 24,25,26, 27, в то время как наш способ требует только следовые количества антигена-мишени. протокол, описанный здесь, может быть использован для изоляции реагентов, которые селективно связываются целевые антигены, которые присутствуют в очень низких концентрациях, без необходимости очистки и панорамирование могут быть выполнены непосредственно против антиген присутствует в сложных образцов тканей. Использование исчерпывающих негативных протоколов панорамирования, как проверитьАСМ гарантирует, что клоны, выделенные по отношению к положительному антигену должны селективно связываются цель даже тогда, когда не очищенным или обогащенным.Kasturirangan и коллеги (2003) провели аналогичный негативный и позитивный процесс биопэннинга, чтобы изолировать антитела, реагирующие на олигомерным бета-амилоида, используя концентрацию нанограммовые мишени 5. Здесь мы расширяем этот процесс для того, чтобы поколение реагентов, которые избирательно связывают заболевания специфический белок вариантов непосредственно из образцов тканей человека. В будущих исследованиях мы намерены и дальше исследовать не только диагностическое значение реагентов изолированных здесь, но также оценить их терапевтическую значимость для лечения БАС.
В целом, наши новые технологии АСМ биопэннинга основе должен быть применим к выделению любой конкретной болезни вариант белка в любом биологическом материале без необходимости очистки белков или модификации, даже когда антиген-мишень concentratioнс являются крайне низкими.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом от NIH: R21AG042066. Мы хотели бы поблагодарить Филиппа Шульца за его вклад в создание видео захвата экрана.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
- Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
- Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
- Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
- Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
- Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
- Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
- Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer’s Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
- Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer’s Disease. 28, 961-969 (2012).
- Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
- Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
- Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
- Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer’s Disease. 42, 641-650 (2014).
- Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
- Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
- Ling, S. -. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. . Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
- Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
- Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
- Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
- Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
- Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
- Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
- Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
- Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
- Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
- Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
- Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
- Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
- Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
- Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
- Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
- Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).
