Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning för Isolering av morfologi Särskilda reagenser mot TDP-43 varianter i amyotrofisk lateralskleros

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Eftersom proteinvarianter spelar avgörande roller i många sjukdomar inklusive TDP-43 i amyotrofisk lateralskleros (ALS), alfa-synuklein vid Parkinsons sjukdom och beta-amyloid och tau i Alzheimers sjukdom, är det oerhört viktigt att utveckla morfologi specifika reagens som selektivt kan rikta dessa sjukdomsspecifika proteinvarianter för att studera den roll som dessa varianter i sjukdomspatologi och för potentiella diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. Vi har utvecklat nya atomkraftsmikroskopi (AFM) baserade biopanning tekniker som möjliggör isolering av reagens som selektivt känner igen sjukdomsspecifika proteinvarianter. Det finns två viktiga faser inblandade i processen, de negativa och positiva vaskfaserna. Under den negativa panorering fasen, är fager som är reaktiva till off-målantigener elimineras genom flera omgångar av subtraktiv vask utnyttjar en serie noggrant utvalda off-target antigener. En nyckelfunktion i den negativapanorering fasen utnyttjar AFM avbildning att övervaka processen och bekräfta att alla oönskade fagpartiklar avlägsnas. För den positiva vaskfasen målantigenen intressanta fast på en glimmer yta och bundna fager elueras och screenas för att identifiera fager som selektivt binder målantigenet. Målproteinet varianten behöver inte renas tillhandahålla lämpliga negativa vask kontroller har använts. Även målprotein varianter som är endast närvarande i mycket låga koncentrationer i komplexa biologiska material kan utnyttjas i positiv vasksteget. Genom tillämpning av denna teknik, förvärvade vi antikroppar mot proteinvarianter av TDP-43 som selektivt finns i human ALS hjärnvävnad. Vi förväntar oss att detta protokoll bör tillämpas på generera reagens som selektivt binder proteinvarianter som finns i ett stort antal olika biologiska processer och sjukdomar.

Introduction

Förekomsten av proteinvarianter har varit inblandad som en faktor i utvecklingen av många sjukdomar inklusive neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons, ALS och frontotemporal demens (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Oligomera former av proteiner beta-amyloid och alfa-synuklein tros vara den giftiga arten ansvarar för Alzheimers och Parkinsons, respektive ^2,3,4,5. Aggregat av TAR-DNA-bindande protein 43 (TDP-43) har varit kopplade till ALS och FTD ^12,13,14. Reagenser Därför såsom antikroppar som selektivt kan rikta de olika proteinvarianter kan vara kraftfulla verktyg för att fungera som diagnostiska markörer och potentiella läkemedel. I denna studie har vi fokuserat på att utveckla reagens som selektivt binder varianter av TDP-43 protein inblandad i ALS, men tekniken beskrivs i detta dokument bör gälla för isolering av reagens mot ett brett spektrum av protein varianter.

Cytoplasmisk aggregering av TDP-43 har identifierats som en patologisk funktion i ALS ^{15,16,17,18,19.} Typiskt TDP-43 finns i kärnan av alla celler från en normal individ, även om det tenderar att röra sig mellan cytosolen och kärnan ^15,17. Men i ALS aggregerade former av TDP-43 detekteras i cytoplasman av utvalda nervceller och glia med lägre koncentrationer som finns i kärnan tyder rörelse TDP-43 från kärnan till cytoplasman under sjukdomsförloppet ^16,20. Medan aggregering av TDP-43 återfinns i de flesta ALS-fallen, tar det inte hänsyn till alla fall sedan 1% -2% av de totala ALS fall (eller 15% -20% av familjära ALS-fallen) är kopplade till mutationer i superoxiddismutas 1 (SOD1) -genen ^15,17. På grund av den viktiga roll som TDP-43 i de allra flesta ALS-fallen, här fokuserar vi på att utveckla antikroppsbaserade reagens som selektivt kan binda till TDP-43 varianter som ärnärvarande i human ALS hjärnvävnad utnyttja våra romanen AFM baserade biopanning tekniker.

Inledningsvis behöver vi en varierad repertoar av antikroppsbindande domäner. Vi kombinerade tre olika fagdisplay enda kedja variabel domän antikroppsfragment (scFv) bibliotek, (Tomlinson I och J och lakan biblioteken ^21). Den panorering Processen är uppdelad i negativa och positiva vaskfaserna. Fager från biblioteken först utsätts för negativa panorering processen under vilken fagerna reaktiv till flera off-målantigener exkluderas. Efter slutförandet av varje omgång av negativ vask mot var off-målantigen, är processen övervakas av AFM avbildning för att säkerställa att all fagbindning off-målantigener har avlägsnats. Först efter att ha kontrollerat med AFM avbildning att alla reaktiva fager avlägsnas går vi vidare till nästa mål. Att isolera reagenser mot TDP-43 varianter inblandade i ALS vi utnyttjade följande negativa panorering antigener: 1) BSA för att avlägsna fag som binder svagt eller icke-specifikt till proteiner; 2) aggregerad alfa-synuklein att avlägsna fag som binder till generiska strukturella element av aggregerade proteiner; 3) mänskliga hjärnan vävnadshomogen att avlägsna fag som binder till alla proteiner eller andra komponenter som finns i obduktionsprover av friska människor hjärnvävnad; 4) immunoprecipiterade TDP-43 från friska mänskliga hjärnan att avlägsna fag som binder till alla TDP-43 former i samband med friska mänskliga hjärnan; och 5) immunoprecipiterade TDP-43 isolerad från FTD hjärnhomogenater att avlägsna fag som binder TDP-43 varianter associerade med icke-ALS patologi. Efter avlägsnande av all fag reaktiv till alla off-målantigener, sedan fortsatte vi till den positiva panorering under vilken antikroppsfragment som binder antigenet av intresse är isolerade, i detta fall TDP-43 immunoprecipiterade från human ALS hjärnvävnad. Dessa isolerade antikroppar kan vara reaktiv till aggregerade eller modifierade former av TDP-43.

"> Konventionell fag biopanning fokuserar främst på den positiva vaskfasen ^22,23. Vanligtvis målet av intresse är immobiliserad, tillade fagbiblioteket och bundna fager elueras. Fagerna förstärks sedan och läggs till målet igen. Denna förstärkning och inkubation process brukar upprepas flera gånger för att öka andelen positiva bindande fag. Även variationer av denna process har använts i stor utsträckning för att isolera antikroppsreagens mot ett brett spektrum av målantigener, kräver de i allmänhet stora mängder renat målantigen ^{24,25,26, 27,} medan vår process kräver endast spårmängder av målantigenet. Protokollet som beskrivs här kan användas för att isolera reagens som selektivt binder mål-antigener som är närvarande i mycket låga koncentrationer, utan behovet av rening, och panorering kan utföras direkt mot antigen närvarande i komplexa vävnadsprover. Användningen av uttömmande negativa vaskprotokoll som verifieratsfrån AFM garanterar att kloner isolerade mot den positiva antigenet selektivt bör binda målet även när de inte renas eller berikas.

Kasturirangan och kollegor (2003) har genomfört en liknande negativ och positiv biopanning process för att isolera antikroppar reaktiva till oligomerisk beta-amyloid använder nanogram koncentration av målet ^5. Här vi expandera på denna process för att möjliggöra generering av reagens som selektivt binder sjukdomsspecifik protein varianter direkt från vävnadsprover mänskliga. I framtida studier avser vi att ytterligare undersöka inte bara det diagnostiska värdet av reagenserna isolerade här men också bedöma deras terapeutiska relevans för behandling ALS.

Sammantaget bör vår roman AFM baserade biopanning teknik tillämpas på isolering av någon sjukdom specifikt protein varianten i allt biologiskt material utan behov av proteinrening eller modifiering, även när målantigenen concentrations är extremt låga.

Protocol

1. fagproduktion Utför alla fag produktions- och biopanning processer i en biosäkerhet skåp. Producera fager partiklar från de olika biblioteken (Tomlinson I och J bibliotek och lakan biblioteks 21) för biopanning processen med hjälp av tillverkarens instruktioner (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). OBS: Vi använder flera bibliotek i vår vaskprocess för att öka mångfalden av antikropparna som finns. I korthet är kulturbakterier l…

Representative Results

I figur 1, demonstrerar den negativa panorering process genom vilken vi bort fagbindning ej åsyftade antigener från vårt bibliotek med hjälp immunotubes schemat. Vi ursprungligen började med BSA eftersom detta är en vanlig blockerande medel och varje fag som skulle reagera ospecifikt med detta mål skulle vara problematiskt i framtida immun. Nästa, vi bort bindemedel till aggregerad alfa-synuklein att eliminera fag som är reaktiva med generiska strukturer av aggregerade proteiner (dvs, …

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10