Vi beskriver en protokol til overvågning Ca 2+ dynamik i Axon terminaler kegle fotoreceptorer bruger en ex-vivo skive forberedelse af musen nethinden. Denne protokol giver mulighed for omfattende undersøgelser af kegle Ca2 + signalering i en vigtig pattedyr modelsystem, musen.
Retinale kegle fotoreceptorer (kræmmerhuse) tjener vision dagslys og er grundlaget for farven diskrimination. De er underlagt degeneration, hvilket ofte fører til blindhed i mange retinale sygdomme. Calcium (Ca2 +), en central second messenger i fotoreceptor signalering og metabolisme, er blevet foreslået at være indirekte forbundet med fotoreceptordegenerering i forskellige dyremodeller. Systematisk studere disse aspekter af kegle fysiologi og patofysiologi er blevet hæmmet af vanskelighederne ved elektrisk optagelse fra disse små celler, især i musen, hvor nethinden er domineret af stang fotoreceptorer. For at omgå dette problem, vi etableret en to-foton Ca2 + imaging-protokol under anvendelse af en transgen mus linje, der udtrykker den genetisk indkodede Ca2 + biosensor TN-XL udelukkende kegler og kan krydset med musemodeller for fotoreceptordegenerering. Den her beskrevne protokol indebærer forbereder lodrette sektioner (R20, skiver ") af nethinder fra mus og optisk billeddannelse af lette stimulus-fremkaldte ændringer i kegle Ca 2+ niveau. Protokollen giver også mulighed "i-slice måling" absolutte Ca 2 + koncentrationer; som på båndene kan efterfølges af kalibrering. Denne protokol muliggør studier i funktionelle kegle egenskaber, og forventes at bidrage til forståelsen af keglen Ca 2 + signalering samt den potentielle inddragelse af Ca2 + i fotoreceptor død og retinal degeneration.
Vision begynder med lys-induceret aktivering af lysoverførelsen i retinale fotoreceptorer. Rod fotoreceptorer tillader vision ved lave lysniveauer, mens kegle fotoreceptorer mægle farver og høj opløsning dagslys vision. Mange fotoreceptor-specifikke gener er modtagelige for mutationer, der fører til degeneration af disse celler. En række molekylære markører associeret med fotoreceptor tab er blevet identificeret 1, men indtil videre de detaljerede molekylære mekanismer og hændelsesforløbet fortsat uklare. Altered Ca2 + homøostase blev spekuleret at være en udløser af fotoreceptor celledød, en hypotese støttes af opregulering af aktiviteten af Ca2 + -afhængige calpain-proteaser under degeneration proces 2,3. Men til dato, denne hypotese ikke bakket op af fysiologiske målinger af Ca 2+. Uoverensstemmelser i flere undersøgelser om effekten af Ca 2+ kanal blokkere i retinal sygdomme anfægtede endvidere inddrages Ca 2+ i celledød 4-6, der opfordrer til metoder til direkte at vurdere Ca 2+ i mammale kegle fotoreceptorer.
Tidligere har de fleste elektriske optagelse og Ca 2+ billeddiagnostiske undersøgelser udført hos padder og krybdyr modeller på grund af den lettere adgang til kegler 7-9. Dog kan pattedyr fotoreceptor fysiologi være forskellig fra ikke-pattedyr 10 og især i forbindelse med menneskelige arvelig retinal degeneration, en bedre forståelse af pattedyr fotoreceptor fysiologi er en nøgle til udviklingen af innovative behandlinger. Mange musemodeller efterligner humane retinale sygdomme er tilgængelige, men lidt er kendt om Ca2 + dynamik i muse kegler 11. Elektriske teknikker er ikke egnede til high-throughput optagelser fra kegler, især ikke i mus, hvor stængerne (~ 97%) væsentligt overtal kegler (~ 3%) 12 </sop>. Desuden følsomme elektrofysiologiske teknikker såsom hel-celle patch-clamp optagelser forstyrre den intracellulære miljø og levere data om Ca 2 + strøm, men ikke på absolutte intracellulære Ca 2 + koncentrationer. Derfor, på trods af lavere tidsmæssig opløsning, billedbehandling er den foretrukne metode, når man behandler spørgsmål om kegle Ca 2 + dynamik. Det centrale spørgsmål med billedbehandling er, hvordan man selektivt mærke keglerne med en fluorescerende Ca2 + indikatorfarvestof. Korrekt opdeling og cellespecificitet er svært at opnå ved "bulk-loading" syntetisk Ca2 + indikatorfarvestoffer i vævet. Som følge heraf mærkede kegler, stænger 13,14, og Müller gliaceller ikke pålideligt kan skelnes. Også syntetiske farvestoffer tendens til at sive ud af cellerne, forebygge langvarige optagelser under ensartede betingelser. Desuden lastning syntetiske Ca 2 + indikatorer i deres AM-esterform er problematisk, da det kræver devaskemidler (f.eks DMSO) og genererer formaldehyd 15. For absolutte Ca 2 + målinger ratiometriske indikatorer er obligatoriske. Men i øjeblikket den bedste syntetisk ratiometrisk indikator Fura-2 kræver excitation lys i området fra 700 til 760 nm (for to-foton excitation), som, afhængigt af dens intensitet, kan i sig selv stimulere kegler, og dermed hindre undersøgelser af, kegle Ca2 + dynamik under fysiologiske belysningsforhold.
Modsætning syntetiske farvestoffer, kan genetisk kodede Ca2 + indikatorer udtrykkes i en celletype-selektiv måde. De behøver ikke sive ud af celler, og derfor om blegning undgås, er mulige langvarige og pålidelige ratiometriske målinger. Celletype-selektive udtryk for Ca 2 + biosensorer, når den kombineres med to-foton mikroskopi, er et effektivt redskab til at vurdere og studere subcellulære Ca2 + under stort set fysiologiske forhold 13,16,17 </sup>. Her beskriver vi en protokol til at studere lys stimulus-fremkaldte kegle Ca 2 + dynamik i en transgen Ca 2+ biosensor mus linje (HR2.1: TN-XL), som udtrykker FRET-baserede Ca 2+ biosensor TN-XL 18 selektivt i kegler, under den humane røde opsin promotor HR2.1 19. At få adgang til kegle terminaler blev en ex-vivo skive forberedelse 20 ansat. Protokollen blev allerede med succes anvendt i tre undersøgelser om kegle funktion hos raske mus 10,21,22. Desuden tillader den protokol studere kegle Ca 2 + signalering i specifikke genetiske forhold, fx ved at krydse musemodeller for arvelig retinal degeneration med HR2.1: TN-XL mus.
Allerede eksisterende protokoller anvender elektrofysiologiske encellede optagelser eller Ca2 + billeddannelse med syntetiske fluorescerende indikatorer kæmper for at optage Ca 2+ dynamik i mus kegle fotoreceptorer for en række tekniske årsager (se Indledning). Den her beskrevne protokol tillader måling af Ca 2 + signaler og endda absolutte Ca 2+ niveauer i enkelte, identificerede mus kegle terminaler i en effektiv og relativt enkel måde.
Denne protokol er allerede blevet anvendt med succes i tre undersøgelser omhandler forskellige aspekter af kegle funktion i raske mus nethinden. I den første undersøgelse 10, at HR2.1: blev TN-XL mus karakteriseret ved hjælp af immunhistokemi, ERG optagelser, to-foton Ca 2+ billedbehandling, og farmakologi, der viser, at kegle-specifikke udtryk for Ca 2+ biosensor ikke hæmmer kegle anatomi og funktion. I den anden undersøgelse 21, kromatiskog akromatiske respons egenskaber af muse kegler blev kortlagt hele nethinden, demonstrerer slående forskelle i kegle funktion mellem den "grønne" opsin-dominerede ryg og "blå" opsin-dominerede ventrale mus nethinden. Disse regionale forskelle i kegle egenskaber matches forskellen kontrast fordeling i det naturlige miljø (dvs. himmel vs. jord), hvilket antyder, at de forskellige spektrale typer mus kegler fastsætte (nær) optimal prøvetagning af akromatiske kontraster og således kan tilbyde en evolutionær fordel. I den tredje undersøgelse 22 gensidig feedback, kegle axonterminaler modtager fra vandrette celler blev undersøgt. Som alle de foreslåede horisontale celle feedbackmekanismer handle på spændingsafhængige Ca 2 + kanaler i kegle Axon terminalerne 28, kan kegle terminal Ca 2+ fungere som en proxy til horisontale celle-til-kegle interaktioner. Undersøgelsen fra Kemmler og kolleger 22 understøtningerden opfattelse, at vandrette celler bruger en kompleks feedback-system, der omfatter flere mekanismer til at styre fotoreceptorer glutamatfrigivelse.
Disse undersøgelser viser alsidigheden af den beskrevne protokol og vise, at den kan tilpasses til en lang række spørgsmål vedrørende kegle funktion og dens synaptiske kredsløb. Derudover muliggør den protokol studere lokale Ca 2+ signalering i de forskellige kegle rum, til en bedre forståelse af kegle fysiologi. En sådan viden er vigtigt at forstå patofysiologiske processer i degenererende kegler, at i sidste ende mulighed for en rationel udvikling af potentielle terapeutiske metoder, især for degenerative sygdomme, der rammer kegler.
I HR2.1: TN-XL muse linje, er Ca2 + biosensor udtrykt i hele keglen, med undtagelse af den ydre segment. Dette giver mulighed for direkte og ratiometrisk vurdering af Ca 2+ dynamiskesi forskellige kegle rum. Da ændringer i Ca 2 + strømme i det ydre segment afspejles i terminalerne via det potentiale og den deraf aktivering af spændingsafhængige Ca 2 + kanaler membran, kan processer i det ydre segment observeres indirekte.
Potentielle faldgruber:
Dissektion af nethinden er et kritisk trin: I mus, nethinden adskiller fra øjestykket normalt mellem fotoreceptor ydre segmenter og pigment epitel. Derfor er de lysfølsomme fotoreceptor ydre segmenter af det isolerede nethinde eksponeret og ekstremt følsomme over for mekanisk beskadigelse. Der skal udvises stor omhu for ikke at beskadige ved at berøre fotoreceptor side med værktøj eller ved at bevæge væv sidelæns på en klæbende overflade (fx en filtermembran).
Høj kvalitet retina skiver kan genkendes under mikroskopet ved deres rene skærefladen ogved en velorganiseret fotoreceptorlaget med klart definerede ydre segmenter. Funktionel vurdering af skive kvalitet kan hurtigt gøres ved blinkende lyse lys stimuli og bestemme den procentdel af responsive kegler (f.eks, i et synsfelt med 10 – 20 kegler). Her, bør respons kvalitet evalueres ved at beregne signal-støj-forholdet (S / N) (amplituden af baseline støj før lyset stimulus vs. amplituden af lyset respons); et S / N af 2 – 3 bør betragtes som minimumsgrænsen. Typisk vi kassere skiver med mindre end 50% responsive kegler. Også skiver med kogler, der viser overdreven spontane spiking adfærd (se figur 4 i 10) bør kasseres.
Skiver i optagelsen kammer, der opfylder de førnævnte anatomiske og funktionelle kriterier viser konsistente svar for 1 – 2 timer (for detaljer om svar konsistens, se 10). Fordi skiver overleve hvores i holdekammeret, kan et vellykket eksperiment vare op til 6 timer. Det er bemærkelsesværdigt, at der er nogle begrænsninger med hensyn til at studere lange spænder rumlige interaktioner mellem kegler og vandrette celler, som udskæring uundgåeligt skærer laterale forbindelser i retinale netværk. Men forøgelse af tykkelsen af retinale skiver til 300 um ameliorates dette emne 22.
Anvendelsen af lodrette retinal skiver undgår scanning af lysfølsomme kegle ydre segmenter af excitation laser og dermed i vid udstrækning forhindrer opsin blegning (for omfattende diskussion, se 10,21). Ikke desto mindre er de optagne Ca 2 + signaler ikke kun afhænge af de lette stimuli, men også blive påvirket af en baggrundsbelysning komponent genereres af scanningen excitation laser. Faktisk er den effektive baggrundsbelysningen i sådanne to-foton imaging eksperimenter er en kombination af spredt laserlys, fluorescerende lys udsendt af den optagede ceLLS, og enhver LED stimulus baggrund komponent. Derfor bør kegler have lov til at tilpasse i mindst 20 – 30 s til laser scanning (med baggrunden komponent af lyset stimulus tændt) forud for optagelsen.
Fordele og anvendelser:
Mens nogle anvendelser til denne kegle Ca2 + -imaging protokol er blevet beskrevet ovenfor 10,21,22, kan andre applikationer kan forestille sig: Farmakologiske studier i kombination med kegle Ca2 + billeddiagnostik kan validere Ca2 + signalveje i kogler og kunne være bruges til at teste effektiviteten og styrken af lægemidler rettet mod forskellige aktører i Ca 2 + -signaling 10. Dog kan en central ansøgning være at studere sygdomme hos kegle funktion. Mange retinal degeneration musemodeller efterligner humane sygdomme er tilgængelige. Eksempelvis keglen fotoreceptor tab 1 (CPFL 1) mus er en primær kegle degeneration model lidelserfra en Pde6c mutation 29. Omvendt stangen degeneration 1 (rd 1) mus lider af en Pde6b mutation. Mens dette medfører primære stang fotoreceptordegenerering 30, når rd 1 stang tab afsluttet, sekundære kegle degeneration sæt i 1. Krydsning disse dyr med HR2.1: TN-XL linje vil tillade at studere og sammenligne Ca 2+ dynamik i både primær og sekundær kegle degeneration og vil sandsynligvis give værdifuld indsigt i rollen som Ca2 + under kegle celledød. Også farmakologisk induceret kegle degeneration – eksempelvis ved hjælp af selektive PDE6 hæmmere – kan tjene til at identificere de efterfølgende mekanismer kegle degeneration 10,29,31.
Sammenfattende beskrevet protokollen her tillader måling Ca2 + i subcellulære rum i mus kegle fotoreceptorer og præsenterer store muligheder for at afdække kegle fysiologi under en bred viftefysiologiske og patofysiologiske tilstande. Derudover kan denne protokol anvendes til screening af farmakologiske midler beregnet til forstyrre kegle Ca 2+ -signaling og dermed bidrage til at etablere nye terapier for kegle sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |