我々は、マウス網膜のex vivoでのスライス標本を用いて、錐体光受容体の軸索末端におけるCa 2+動態を監視するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、重要な哺乳動物モデル系におけるコーンのCa 2+シグナル伝達の包括的研究、マウスを許可します。
網膜錐体視細胞(コーン)昼光のビジョンを提供し、色判別の基礎となっています。彼らはしばしば、多くの網膜疾患で失明につながる、変性の対象となっています。カルシウム(Ca 2+)、光受容体シグナル伝達および代謝において重要なセカンドメッセンジャーは、間接的に種々の動物モデルにおける光受容体変性と関連することが提案されています。体系コーン生理学および病態生理学のこれらの側面を研究することは、網膜が桿体によって支配されているマウスでは、特に、電気的にこれらの小さな細胞から記録することの難しさによって妨げられてきました。この問題を回避するために、我々はコーンでのみ遺伝的にコードされたCa 2+のバイオセンサーTN-XLを発現するトランスジェニックマウスラインを使用して、2つの光子のCa 2+イメージングプロトコルを設立し、光受容体変性のためのマウスモデルを交配させることができます。ここで説明するプロトコルは、垂直方向の切片を作製伴う(R20;マウス由来の網膜のスライス」)とコーンのCa 2+レベルの光刺激誘発変化の光学イメージング。プロトコルは、絶対のCa 2+濃度の「インスライス測定」を可能にします。録音は、キャリブレーションを行うことができますように。このプロトコルは、機能的なコーンプロパティに研究を可能にし、コーンのCa 2+シグナル伝達の理解だけでなく、光受容体の死と網膜変性におけるCa 2+の関与の可能性に貢献することが期待されます。
ビジョンは、網膜の光受容体での光伝達カスケードの光誘起活性化から始まります。錐光受容体は、色と高解像度昼光ビジョンを媒介するのに対し、桿体は、低い光レベルでのビジョンを可能にします。多くの光受容体特異的遺伝子は、これらの細胞の変性を引き起こす変異の影響を受けやすいです。光受容体の損失に関連した分子マーカーの数が1を同定されているが、今のところ詳細な分子機構やイベントの順序は不明です。改変されたCa 2+ホメオスタシスは光受容体細胞死のトリガー、変性プロセス2,3の間のCa 2+依存性カルパイン型プロテアーゼの活性のアップレギュレーションによってサポート仮説であることが推測されました。しかし、今日まで、この仮説はのCa 2+の生理学的測定によってバックアップされていません。再中のCa 2+チャネル遮断薬の効果に関するいくつかの研究の不一致tinal疾患はさらに直接哺乳類錐体視細胞中のCa 2+を評価する方法を求めて、細胞死4-6中のCa 2+の関与に挑戦しました。
以前は、ほとんどの電気的記録およびCa 2+イメージング研究があるためコーン7-9に簡単にアクセスの両生類と爬虫類のモデルで行われています。しかし、哺乳動物の光受容体の生理機能は、特に非哺乳類10とのそれとは異なる可能性があり、人間の遺伝性網膜変性との関連で、哺乳動物の光受容体の生理機能をよりよく理解するには、革新的な治療法の開発の鍵です。人間の網膜疾患を模倣する多くのマウスモデルが用意されていますが、少しは、マウスコーン11におけるCa 2+動態について知られています。電気技術は、ロッド(〜97%)を大幅にコーン(〜10%)12を上回っコーンから、特にないマウスでは、高スループットの録音に適していません</s>アップ。また、このような全細胞パッチクランプ記録などの機密電気生理学的技術は、細胞内環境を乱すおよびCa 2+電流ではなく、絶対的な細胞内Ca 2+濃度に関するデータを提供します。コーンのCa 2+動態についての質問に対処するときしたがって、低い時間分解能にもかかわらず、撮影が選択される方法です。イメージングとの重要な問題は、選択的蛍光のCa 2+指示薬色素でコーンを標識する方法です。適切な区画化および細胞特異性は、組織の中に、「バルク·ロード」の合成のCa 2+指示色素によって達成することは困難です。その結果、円錐を標識し、13,14のロッド、およびミュラーグリア細胞を確実に区別することはできません。また、合成染料は、一貫性の条件の下で長時間の録音を防止する、細胞の外に漏出する傾向があります。それはドを必要とするまた、そのAM -エステルの形で合成のCa 2+指標をロードすると、問題がありますtergents( 例えば、DMSO)およびホルムアルデヒド15を生成します。絶対のCa 2+測定には、レシオメトリック指標は必須です。しかし、最善の、現在利用可能な合成レシオメトリック指示薬のFura-2は、その強度に応じて、それ自体が円錐を刺激し、ひいてはの研究を妨げることができ、760ナノメートル〜700の範囲の励起光(二光子励起用)を必要としますコーンのCa生理照明条件の下で2+動態。
合成染料とは異なり、遺伝的にコードされたCa 2+指標は、細胞型選択的に発現させることができます。彼らは、細胞外に漏れない、と漂白が回避された場合、したがって、長期の信頼性およびレシオメトリック測定が可能です。細胞型選択的二光子顕微鏡と組み合わせたCa 2+バイオセンサーの発現は、主に生理学的条件の下で13,16,17細胞内のCa 2+を評価し、研究するための強力なツールを表し、 </SUP>。 FRETベースのCa 2+のバイオセンサーTN-XL 18を表現し 、:ここでは、光刺激誘発コーンのCaトランスジェニックのCa 2+バイオセンサーマウスライン(TN-XL HR2.1)2+動態を研究するためのプロトコルを記述します選択コーンで、ヒト赤オプシンプロモーターHR2.1 19の下。コーン端末にアクセスするために、 エクスビボのスライス標本20を使用しました。プロトコルは、すでに正常健康なマウス10,21,22でコーン機能の3つの研究で使用しました。また、プロトコルはHR2.1を伴う遺伝性網膜変性のためのマウスモデルを交配することにより、コーンのCa 2+特異的な遺伝的な条件でのシグナリング、 例えば勉強できます。TN-XLマウスを。
電気生理学的単一細胞記録または合成蛍光指示薬とのCa 2+イメージングを使用して、既存のプロトコルには、技術的な理由(概要を参照してください)の数のマウスの錐体光受容体におけるCa 2+動態を記録するために苦労しています。ここで説明するプロトコルは、Ca 2+シグナルと、効率的で、比較的簡単な方法で個々の、識別されたマウスのコーン端末であっても絶対のCa 2+レベルの測定を可能にします。
このプロトコルは、すでに正常健康なマウス網膜において円錐機能のさまざまな側面に対処する3つの研究で使用されています。最初の研究10では、HR2.1:TN-XLマウスは、バイオセンサーのCa 2+の円錐特異的発現は妨げないことを示し、免疫組織化学、ERG記録、二光子のCa 2+イメージング、および薬理学を用いて特徴付けました。コーン解剖学と機能。第二の研究21では、有彩色マウスコーンの無彩色応答特性は、「グリーン」オプシン支配背と「青」オプシン支配腹マウス網膜の間の円錐機能の著しい違いを実証し、網膜全体にマッピングしました。コーンのプロパティでこれらの地域差は、マウスコーンの異なるスペクトルタイプは無彩色コントラストの(近くの)最適サンプリングを提供することを示唆し、自然環境(地上対すなわち、空)の差動コントラスト分布と一致したと、このように、提供することができます進化上の利点。コーン軸索末端は、水平細胞から受け取ることを第三の研究22往復フィードバックに調査しました。提案されたすべての水平細胞フィードバック機構はコーン軸索末端28における電位依存性のCa 2+チャネルに作用するように、コーン端末Ca 2+が 、水平細胞-コーン相互作用のためのプロキシとして機能することができます。 Kemmlerおよび共同研究者による研究22のサポートビュー水平細胞は光受容体のグルタミン酸放出を制御するためのいくつかのメカニズムを含む複合フィードバックシステムを使用すること。
これらの研究は、記載されたプロトコールの多様性を示し、それは円錐関数とシナプス回路に関する質問の広い範囲に適応させることができることを示しています。また、プロトコルはコーン生理学のより良い理解に向けて、異なる円錐区画内にローカルのCa 2+シグナル伝達の研究を可能にします。このような知識は、最終的にはコーンに影響を与える変性疾患のために、特に、潜在的な治療アプローチの合理的開発を可能にするために、変性コーンにおける病態生理学的プロセスを理解することが重要です。
HR2.1で:TN-XLマウスライン、のCa 2+バイオセンサは外側セグメントを除いて、コーンを通して発現されます。これは、Ca 2+、ダイナミックの直接およびレシオメトリック評価のための機会を提供します異なるコーン区画内の。カルシウムの変化は、外側セグメント内2+電流は膜電位と電位依存性のCa 2+チャネルの結果として活性化を介して端末に反映されているので、外側セグメントの処理が間接 的に観察することができます。
落とし穴:
網膜の解剖は重要なステップである:マウスでは、網膜は、通常、光受容体の外側セグメントと色素上皮との間のアイカップから分離します。したがって、単離された網膜の感光光受容体の外側セグメントが公開され、機械的な損傷に非常に敏感。細心の注意は、ツールを使用して、感光体の側に触れることによって、または( 例えば、濾過膜)の接着剤表面に横に組織を移動することによって損傷しないよう注意する必要があります。
高品質の網膜スライスがそのきれいな切断面によって顕微鏡下で認識することができ、明確に定義された外側セグメントとよく組織感光層による。スライス品質の機能評価を迅速に( – 20コーン10との視野内に、例えば )明るい光刺激を点滅し、応答性のコーンの割合を決定することによって行うことができます。ここで、応答の品質は、信号対雑音比(S / N)(光応答の振幅対光刺激の前にベースラインノイズの振幅)を算出することによって評価されるべきです。 2のS / N – 3が最小しきい値として考慮されるべきです。一般的に、我々は50%未満の応答コーンでスライスを捨てます。また、廃棄されるべきである(10で図4を参照)、過度の自発的なスパイクの挙動を示すコーンでスライス。
(応答の一貫性の詳細については、10を参照してください)2時間-上記の解剖学的および機能的基準を満たす記録チャンバー内のスライスを1に一貫した応答を示します。スライスは時間生き残るので保持室で私たちは、成功した実験では、6時間まで持続することができます。スライスは、必然的に、網膜ネットワークの横の接続を切断するように、それは、コーンと水平細胞間の長い範囲の空間的相互作用を研究に関していくつかの制限があることは注目に値します。しかし、300μmの網膜スライスの厚さを増加すると、この問題を改善する22。
垂直網膜スライスの使用は、励起レーザーによって感光コーン外側セグメントのスキャンを回避し、したがって、大部分が(広範な議論のために、10,21参照 )オプシン漂白を防ぐことができます。それにもかかわらず、記録されたCa 2+シグナルだけでなく、光刺激に依存するだけでなく、走査励起レーザによって生成された背景照明成分によって影響を受けます。実際には、このような二光子イメージング実験において有効背景照明は、散乱レーザ光記録CEによって放出される蛍光の組み合わせでありますLLS、および任意のLED刺激背景成分。記録の前に(オン光刺激の背景成分と)レーザ走査に30秒 – そのため、コーンは、少なくとも20のために適応させるべきです。
利点と用途:
コーンでシグナル伝達経路のCa 2+を検証することができる円錐のCa 2+イメージングとの組み合わせで薬理学的研究をし、次のようになります。この円錐のCa 2+ -imagingプロトコルの一部のアプリケーションは、10,21,22の上に記載されているが、他のアプリケーションを想定することができますカリフォルニア州の別の選手を標的薬の有効性および効力をテストするために使用2+ 10を -signaling。しかし、主要なアプリケーションは、円錐機能に影響を及ぼす疾患を研究することであってもよいです。ヒト疾患を模倣する多くの網膜変性のマウスモデルが用意されています。例えば、錐体光受容体の損失1(CPFL 1)マウスは、一次コーン変性モデル苦しみですPde6c変異 29から。逆に、ロッド変性1(RD 1)マウスはPDE6B変異の影響を受けています。これは、主ロッド光受容体の変性30、1 番目の 1ロッド損失が完了すると、二次コーン変性セットが発生しているが。 HR2.1でこれらの動物を交配:TN-XL線が勉強したり、プライマリとセカンダリの両方のコーン変性中のCa 2+動態を比較できるようにし、コーン細胞死中のCa 2+の役割に貴重な洞察を提供する可能性があります。また、薬理学的に円錐変性を誘起-例えば選択PDE6阻害剤を使用して-コーン変性10,29,31の下流側の機構を識別するのに役立ち得ます。
要約すると、ここで説明するプロトコルは、マウスの錐体光受容体の細胞内区画中のCa 2+を測定することができ、広い範囲の下でコーン生理学を発見するための素晴らしい機会を提供します生理学的および病態生理学的状態の。さらに、このプロトコルは、円錐のCa 2+ -signaling干渉するしたがってコーン疾患に対する新しい治療法を確立するのに役立つように設計された薬理学的薬剤のスクリーニングのために使用することができます。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |