Introduction
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en invalidiserende motor neuron sykdom forbundet med tap av både øvre og nedre motoriske nevroner og påfølgende muskellammelse. Ved diagnose, er overlevelses i gjennomsnitt bare 2-5 år en. Phrenic motor nevron (PhMN) tap er en kritisk komponent i patogenesen ved ALS. Pasienter som til slutt dør på grunn av tap av PhMN innervasjon av membranen, det primære muskelinspirasjons 2,3. Traumatisk ryggmargsskade (SCI) er også et alvorlig problem med tilhørende pustevansker. Omtrent 12.000 nye tilfeller av SCI oppstår hvert år 4 grunnet traumatiske skader på ryggmargen. Til tross for sykdom heterogenitet med hensyn til plassering, type og alvorlighetsgrad, de fleste av SCI tilfeller medføre traumer til cervical ryggmargen, noe som ofte resulterer i ødeleggende og vedvarende luft kompromiss. I tillegg til ALS og SCI, andre sentralnervesystemet (CNS) sykdommer kan knyttes with magen respiratorisk dysfunksjon 5,6.
Phrenic nerve er en efferent motor nerve som innervates ipsilaterale hemi-membran og som stammer fra PhMN celle organer ligger i C3-C5 nivåer av ipsilaterale cervical ryggmargen. PhMN produksjonen er kontrollert av synkende bulbospinal innspill fra hjernestammen i et område kjent som rostralt ventral åndedretts gruppe (rVRG) 7. Den rVRG-PhMN-membran krets er sentralt for kontroll av inspirasjons puste, samt andre ikke-ventilasjonsmembran atferd. Ulike traumatiske skader og nevrodegenerative lidelser som påvirker dette krets kan føre til en dyp nedgang i lungefunksjon og pasientens livskvalitet. Synkende innspill til PhMNs fra rVRG, PhMN overlevelse, phrenic nerve integritet og riktig innervasjon på membranen nevromuskulære krysset (NMJ) er alle nødvendige for normal membran funksjon. Det er derfor viktig å anvende teknikker somkan kvantitativt vurdere denne kretsen in vivo i gnagermodeller av ALS, SCI og andre CNS sykdommer.
Med denne protokollen, er målet å beskrive eksperimentelle verktøy for å vurdere PhMN innervasjon av membranen på både elektrofysiologiske og morfologiske nivåer. Sammensatte muskelaksjonspotensialer (CMAPs) registreres ved å stimulere alle efferent motor neuron axons av en gitt motor nerve og deretter analysere fremkalte depolarization responsen målet myofibers. Denne teknikken kan brukes in vivo hos bedøvede rotter og mus for å kvantifisere funksjonell innervasjon av hemi-diafragma ved PhMNs 8. På grunn av det faktum at CMAPs representerer samtidig registrering av alle (eller i det minste mange / de fleste) myofibers av hele hemi-membran, er det nyttig å også undersøke fenotyper av enkelte motoriske aksoner og myofibers på membranen NMJ for å spore sykdom - og terapirelevante morfologiske endringer som delvis og komplekserte denervering, regenerativ spirende og reinnervation. Dette kan gjøres via hel-mount immunhistokjemi (IHC) av membranen, etterfulgt av detalj morfologisk vurdering av den enkelte NMJs hele muskelen 9. Kombinere CMAPs og NMJ analysen gir en kraftig tilnærming for kvantitativt studere magen innervasjon i gnagermodeller av CNS og PNS sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Thomas Jefferson Universitetet institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen og utføres i samsvar med den europeiske fellesskaps rådsdirektiv (2010/63 / EU, 86/609 / EEC og 87-848 / EEC), NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og Society for Neuroscience politikk om bruk av dyr i Neuroscience Research.
1. Forbindelse Muscle aksjonspotensialer (CMAPs)
- Forbereder dyret:
- Bedøve rotte ved hjelp av en sniffe (isofluran) på 1-2% levert til effekt eller ved injeksjon (ketamin, xylazin, acepromazin). Dosering av injiserbare anestesi er som følger: 95,0 mg / kg ketamin, 10,0 mg / kg xylazin, 0,075 mg / kg acepromazin.
MERK: Vi lykkes med å bruke både sniffe og injiserbare bedøvelse tilnærminger når gjennomføre dette CMAP innspillingen protokollen, med ingen preferanse. - Dyret skal opprettholdes på et passendenesthetic dybde før operasjonen er startet, gjennom inngåelse av kirurgi, og fram til postoperativ buprenorfin har trådt i kraft. Bekreft riktig anesthetization av kort tå klype for å fastslå at en tilbaketrekking respons ikke er utløst. I tillegg teste hornhinnen refleks med en bomullspinne. Gjennom hele den kirurgiske prosedyre, fastslå at hjertefrekvens og respirasjonsfrekvens ikke har økt, noe som antyder at bedøvelse dybden har blitt for lys.
- Påfør en veterinær salve på dyrets øyne for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Kirurgen bør vaske hans / hennes hender med et desinfeksjonsmiddel (klorhexidin skrubb) før du starter operasjonen. Kirurgen må bruke sterile hansker, ansiktsmaske og kappe eller ren labfrakk. Alle instrumenter bør vaskes og autoklaveres før operasjonen. Legg til en steriliseringsindikator strimmel inne i instrumentet settet før autoklavering ved nivået av instrumentene for å verifisere at steriliseringen er fullført. Kirurgen børverifisere at hele linjen på stripen er svart før du begynner kirurgi. Tape utsiden av boksen med indikasjon autoklav tape også. Hvis operasjonen skal utføres på flere dyr på samme dag, rengjøre instrumenter mellom operasjoner og sterilisere i et glass perle sterilisator. Hvis det er nødvendig, sterilisere begge ender av instrumentet i glassperle sterilisatoren ved å anbringe håndtaket av instrumentet i sterilisatoren for riktig tidspunkt, å fjerne instrumentet med en steril hemostat, kjøle den i et sterilt felt og deretter plassere den funksjonelle enden av instrumentet inn i glassperle sterilisator for det aktuelle tidsrom.
- Når dyret er bedøvet, kan plass på kirurgisk bord med dorsalflaten ned og magen vendt opp slik at båndet skal brukes til å sikre dyrets forbein til kirurgisk bord.
- Barbere ventral overflate caudally som begynner ved bunnen av skallen, og sørge for at området rundt magen på hver side av midtlinjen er shaved avhengig av hvilken hemi-membran blir innspilt. Påfør povidon-jod til det barberte overflaten av huden.
- Bedøve rotte ved hjelp av en sniffe (isofluran) på 1-2% levert til effekt eller ved injeksjon (ketamin, xylazin, acepromazin). Dosering av injiserbare anestesi er som følger: 95,0 mg / kg ketamin, 10,0 mg / kg xylazin, 0,075 mg / kg acepromazin.
- Forberedelse til CMAP opptak:
- Etter dyr forberedelse, sted jordings subkutant i halen (figur 1).
- Plasser referanseelektrode subkutant i kontralaterale nedre mageregionen.
- Plasser ledende gel på selvklebende overflate stripe eller disk opptak elektrode (dimensjoner av flatestrimmel elektrode: 0,5 x 3 cm), og deretter plassere overflateelektroder på tvers langs unilateral costal margin.
- Plasser stimulerende elektroder transkutant 0,5 cm fra hverandre sideveis til luftrøret og overlegen til krageben. Sett elektrodene ca 1,0 cm dype gjennom huden. Fest elektrodene for hånd, slik at deres plassering ikke beveger seg med påfølgende stimuleringer.
MERK: Vinkel stimulerende elektroder 90 ° i forhold til huden på stedet av insertion.
- Forbindelse Muscle aksjonspotensial (CMAP) opptak:
- Skaff elektrofysiologiske opptak med en stimulator / forsterker etterfulgt av dataassistert dataanalyse.
- Stimulanse parametere av snor stimulering bør være 0,5 ms, 1,0 Hz supramaksimalt pulser. Amplituden av stimulans bør være mellom 6,0 og 8,0 V (figur 2A).
MERK: I et eksperiment, bruk en stimulus intensitet med samme amplitude over dyr. Målet er å maksimere responsen amplitude ved hjelp av den minimale amplitude av stimulering. Det er viktig å merke seg at den opprinnelige reaksjon som finner sted på tidspunktet for stimulering er en stimulerings gjenstand. I tillegg bør man sørge for å oppnå en CMAP respons som blir etterfulgt av en stabil / flat grunnlinje etter stimulering gjenstand, som deretter følges av hurtig CMAP respons. For å oppnå en slik respons, kan det være nødvendig å flytte stimulering og / elleropptak elektroder. - Vent 30 sekunder mellom stimulering, og gjenta 10 stimuleringer på rad for å oppnå gjennomsnittlig svartid (figur 2B - C). Mål amplitude fra baseline til peak (Figur 2A). Gjennomføre phrenic nervestimulering i fasen av dyrets respirasjonssyklusen når phrenic nerve / membranen ikke er aktivert. Prosedyren kan gjentas på samme dyr for den kontralaterale hemi-diafragma.
- Etter den siste CMAP innspillingen, perfuse dyret hvis NMJ flekker vil bli gjennomført. Gjennomføre CMAP opptak gjentatte ganger på samme dyret omtrent en gang hver uke (eller i det intervall på valg).
- Etter overlevelse CMAP innspillinger, tillater dyret å komme på en sirkulerende varmt vann varmepute, og kontinuerlig overvåke under utvinning før våken og sternally tilbakelent. Ikke returnere et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert. </ Li>
- Når sternally tilbakelent, overvåke dyret hver 12. time for første 48 timer (en gang daglig). Hvis dyret ser ut til å være dehydrert (slapp hud, slapphet), administrere væske (Ringer-laktat oppløsning, subkutant, 1-2 ml per injeksjon, med områdene rotert, to ganger per dag) til post-kirurgisk vekt og væsketap stabiliseres. Gi dyr med myknet mat i små retter i den akutte postoperative perioden dersom det er nødvendig for å oppmuntre spise hvis de ikke får tak i ledningen bar lokket mater.
- Administrere buprenorfin i en dose på 0,05 mg / kg før slutten av operasjonen, og deretter ved 12 timers intervaller for den første 24 timer (og avhengig av symptomer på smerte / belastning etterpå) via subkutan injeksjon (site rotert). Ved tegn på smerte eller ubehag blir lagt merke til etterpå, behandle dyr med buprenorfin. Tegn som indikerer smerte / ubehag inkluderer mangel på aktivitet, lyder, mangel på å spise eller drikke (dehydrering), overdreven vekttap, vokter, excessiv gnager eller skrape på stedet av snittet. Andre kriterier som brukes for å bestemme smerte og ubehag inkluderer manglende respons på ytre stimuli, forbigående eller uprovosert vokalisering, anstrengt eller unormal pusting, vedvarende rødbrun naso-Occular utslipp, merket piloereksjon. Også overvåke bevis på dårlig hygiene som ville foreslå syke dyr. Hvis dyret fremdeles er observert å være i nød etter 72 timer fra behandlingen (i henhold til smerte / spenningskriterier skissere ovenfor, og etter å ha mottatt den analgetiske protokoll som er beskrevet ovenfor) avlive dyret.
2. Membran nevromuskulære krysset (NMJ) Analyse
- Animal disseksjon:
- Administrere dyret en overdose av injiserbar anestesi (3 ganger dosen som ble brukt ovenfor: ketamin på 285,0 mg / kg xylazin på 30,0 mg / kg acepromazin ved 0,225 mg / kg, i.p.). Etter overdose, bør alle dyr har en annen metode for aktiv dødshjelp (toraktomi) to sikre død. Døden bør bekreftes ved å observere hjerte- og respirasjonsstans og ved å notere dyrets faste og utvidede pupiller.
- Gjennomføre en laparotomi med skalpell eller disseksjon saks utvide excision fra zyphoid prosessen caudally langs midtlinjen. Skille nøye hud og bindevev fra underliggende muskel ved hjelp av skalpell og tang.
- Mens du trekker opp på zyphoid prosessen, bruke disseksjon saks for å fjerne hele mellomgulvet, slik at membranen forblir festet til omkringliggende bein. Dette er viktig fordi det vil hindre skade på membranen muskler, vil gi rom for vellykket disseksjon av hele mellomgulvet, og vil hjelpe til med å rense muskel for påfølgende farging.
MERK: På dette punktet, kan dyret bli dynket om nødvendig.
- Rengjøring og farging av mellomgulvet:
- Peke ut hele dissekert gulvet, overlegen flaten opp, til silikongummi i et glass 100 mm petriskål i4% paraformaldehyd (gjort i 1% fosfat-bufret saltløsning - PBS) i 20 min ved anvendelse av et stereomikroskop. Strekk membranen for å gjøre den stram, og ved hjelp av insekt pinner, peke ut det omgivende vev for å unngå låsing membranen muskel selv (figur 3).
- Rengjør forsiktig av bindevev fra bare den overlegne overflaten av muskel med # 5 pinsett og liten saks.
MERK: Utfør alle etterfølgende trinnene i denne fargingen protokollen sakte rocking ved romtemperatur dekket fra lys med mindre annet er spesifisert. Sikre at membranen muskelen er alltid helt nedsenket i væske for å unngå uttørking. - Før farging fremstille alle de nødvendige reagenser: 1 x PBS, 2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS, 0,1 M glycin laget i 2% BSA / PBS, 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x PBS, og 0,2% TBP (0,2 % Triton X100 i 2% BSA / PBS). Sørg for å pre-cool metanol ved -20 ° C.
- Vask 3 x i 10 min i 1 x PBS.
- Inkuber i 0,1 M glycin (laget i to% BSA / PBS) i 30 min.
- Inkuber i RBTX (rhodaminkonjugert α-bungarotoxin) løsning i 15 min. Løsning for RBTX er som følger: rhodamin-konjugert alfa bungarotoxin 1: 400 fortynning i 1 x PBS.
Merk: I denne protokollen blir Rhodamine anvendes, men en hvilken som helst fluoroforen av valg kan brukes til farging. - Vask 3 x i 10 min i 1 x PBS.
- I -20 ° C fryser, inkuber med MeOH i 5 min.
MERK: Ikke legg MeOH før du legger muskel i fryseren, og umiddelbart fjerne løsning etter inkubasjonstid. - Vask 3 x i 10 min i 1 x PBS.
- Block i 0,2% TBP i 1 time (0,2% Triton laget i 2% BSA / PBS).
- Inkuber med primært antistoff-oppløsning (i 0,2% TBP) ved 4 ° C natten over mens rock. Fortynninger av antistoffer som følger: SV2 (01:10) og SMI-312 (1: 1000).
- Vask 3 x i 10 min med 0,2% TBP.
- Inkuber med sekundært antistoff ved bruk av 1: 100 fortynning av FGM1 (FITC-konjugert geit anti-mus IgG1; laget i 0,2% TBP) mens rock for en time.
MERK: Beskytt mot lys for resten av protokollen for farging. - Vask 3 x i 10 min med 1 x PBS.
- Re-ren omgivende bindevev på den overlegne (se ovenfor) overflate av muskel før montering og coverslipping.
MERK: Det anbefales å rengjøre og montere prøven umiddelbart etter farging da. Imidlertid, hvis det er nødvendig, kan prøven bli dekket i 1 x PBS, innpakket i parafilm for å forhindre fordamping og lagret ved 4 ° C i opptil en uke, med endring av PBS daglig. - Ved montering på glass slide, dekk med ikke-hardset Vectashield. Forsegle kantene av dekkglass med klar neglelakk for å hindre uttørking. Lagre lysbilder liggende flatt i papplysbilde mapper i -20 ° C for langsiktig.
- Analyse og Confocal Imaging:
- Kvantitativt analysere morfologi av farget og montert hemi-membran i henhold til 20X og 40X forstørrelse ved hjelp av en oppreist epifluorescencemikroskop.
MERK: Fordi membranen er farget og analysert i en hel-mount mote, er ganske tykk muskelen. Derfor er de fleste av fluorescens farging helt ute av fokus når et statisk bilde er tatt ved hjelp av ikke-confocal fluorescens mikroskopi. Av denne grunn er det best å gjennomføre NMJ analyse i sanntid på mikroskopet, da dette gjør det mulig å hele tiden fokusere "opp" og "ned" gjennom muskelen å riktig identifisere morfologi av hver av de enkelte NMJs. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan man enkelt følge banen til enkelte motoriske aksoner som de beveger seg gjennom vevet i romlige forhold til de postsynaptiske reseptor klynger. - Ved å måle ventral-to-dorsal lengden på muskelen, dele muskelen inn i 3 separate seksjoner for analyse basert på topografiske innerverte mønstre fra bestemte ryggmargsnivåer (figur 4H).
- Begynnelsen på den ventrale region av muskelen og moving dorsally, analysere alle eget ansikt NMJs ligger på overflaten muskelfibre. Ikke analyser muskelfibre dypere enn de første 3-4 fibre fra overflaten som tolkningen kan være vanskelig på grunn av dårligere antistoff penetrasjon (RBTX trenger dypere inn i muskelen på grunn av den lille størrelsen av toksinet i forhold til de større antistoffer som brukes til å merke nevroner).
- Identifiser hver NMJ som intakt dersom det pre-terminale axon av nervecellen er tykk i diameter og alle regioner av nerveterminalen helt overlapper med den underliggende muskel acetylkolinreseptorer (AChRs).
- Identifisere hver NMJ som delvis denerveres om en region av de underliggende muskel AChRs er ledig med tilsvarende nerveterminalen.
- Identifiser hver NMJ som helt denerveres om muskel AChRs har noen tilsvarende nerveterminalen (det er også viktig å ha andre NMJs med merkede nevroner i det samme feltet av fokus, slik at man kan være sikker på at mangelen på nerveterminalen er ikke bare på grunn pooR-antistoff penetrasjon i den regionen av muskel).
- Identifisere hver NMJ som formere stimuleres hvis det er mer enn en pre-terminal axon innervating en individuell NMJ (dette indikerer at det har vært en viss grad av denervering og sannsynlige forsøk på reinnervation på dette krysset).
- Identifiser hver NMJ så tynt innerverte hvis NMJ har fullstendig overlapping mellom nerveterminalen og underliggende AChRs men har en tynn pre-terminal axon (dette er også en indikasjon på noen grad av denervering og forsøk på reinnervation).
- Å utføre analysen for hver av de tre identifiserte regioner for alle de ovennevnte NMJ kategoriene for hvert dyr. Gjennomsnittlig dataene fra hvert dyr med resultater fra andre dyr fra samme eksperimentelle gruppen. Omtrent 200-300 veikryss i rotte hemi-membran muskel og 150-200 i mus hemi-membran bør kvantifiseres i minst 3 (helst 5-6 eller mer) dyr pr eksperimentgruppen.
- Får høyoppløselige konfokale bilder, brukd for publisering, med et konfokal mikroskop.
- Skaff Z-stabler på 0,3 mikrometer trinnstørrelse 20-40 um dybder, og samle ytterligere optiske seksjonene over og under hvert knutepunkt for å sikre at hele synaptiske profilen er inkludert.
- Bruk oppkjøpet programvare for å rekonstruere z-serie bilder til maksimal intensitet projeksjoner.
- Kvantitativt analysere morfologi av farget og montert hemi-membran i henhold til 20X og 40X forstørrelse ved hjelp av en oppreist epifluorescencemikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne Sprague-Dawley rotter fikk enten bare laminektomi (uskadd kontroll) eller unilateral hemi-kontusjon SCI ved C4 ryggmargen nivå 10-12. På fem uker etter operasjonen, peak CMAP amplitude registrert fra hemi-membran ipsilaterale til laminektomi / skade området ble betydelig redusert i SCI rotter (figur 2C) sammenlignet med laminectomy-only kontroll (figur 2B). Alle NMJs i hemi-diafragma var fullstendig intakt i kontroll ikke-syke villtype-rotter (figur 4A, C). Tvert imot, SOD1 G93A rotter (en gnager-modell med ALS) viste signifikant patologi ved hemi-diafragma NMJs (Figur 4B), inkludert fullstendig denervering (figur 4G, pilhode), delvis denervering (figur 4E, pilspiss, figur 4G, NMJ videre høyre), multippel innervasjon (Figur 4D) og tynne pre-terminal aksoner (figur 4F, pilspiss).
Figur 1: CMAP elektrodeplasseringen. Jordingselektroden er plassert subkutant i hale. Referanse-elektroden er plassert i buken. Overflaten opptak elektroden er plassert på tvers langs den ensidige kyst margin. Stimulerende elektroder er avbildet som både rød og svart. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. CMAP opptak og analyse (A) Amplituden CMAP respons kan måles fra grunnlinjen til topp. En typisk CMAP respons bør vise både stimulus artefaktog responskurve. (B - C) Representative gjennomsnittlig CMAP svar. Stimulering bør utføres minst ti ganger etter hverandre for å oppnå en gjentatt gjennomsnitt av responsen. Vist her er en laminectomy-bare uskadd rotte (B) og en sammenligning av CMAP svar for en skadet rotte som fikk en ensidig C4 hemi-kontusjon (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utarbeidelse av membran for hel-mount farging. Insekt pins bør plasseres inn i omkringliggende vev for å sikre hemi-membran å Sylgard. Unngå å plassere pinnene inn i muskelen selv. På dette bildet er både hemi-membran muskler vist og låste ned SEPAfor seg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: NMJ fenotyper. Confocal bildebehandling ble utført for å visualisere postsynaptiske acetylkolinreseptorer (i rødt merket med rhodaminkonjugert α bungarotoxin) og aksonale fibre og presynaptiske terminaler (i grønt merket med SMI-32 og SV2 antistoffer, henholdsvis). Alle NMJs i hemi-membran var helt intakt i kontroll ikke-syke villtype rotter (A, C). Tvert imot, SOD1 G93A rotter (en gnager ALS modell) viste signifikant patologi ved hemi-membran NMJs (B), inkludert komplett denervering (G, pilspiss), delvis denervering (E, pilspiss, G (D) og tynne pre-terminal aksoner (F, Arrowhead). Membranen muskelen er delt inn i tre separate seksjoner for NMJ morfologi analyse (H) 13. Skala:. 25 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som lungefunksjon er kompromittert i både traumatisk SCI og ALS, utvikle behandlingsformer som er rettet mot å puste og spesielt membran innervasjon er klinisk relevant 5,6. For å grundig studere lungefunksjon, bør en kombinert tilnærming metode brukes. CMAPs måle graden av funksjonell innervasjon av membranen ved hjelp av ytre phrenic nervestimulering, men ikke endogene bulbospinal respirasjonen 8. I tillegg har disse opptakene ikke tillater undersøkelse av morfologiske endringer på NMJ, spesielt ved nivået for individuelle motor axoner og postsynaptiske acetylcholinreseptorer. Ved å bruke den beskrevne farging protokollen, kan man kvantitativt vurdere relevante morfologiske fenotyper som komplett denervering, delvis denervering og selv regenerativ spirende og reinnervation på individuelle NMJs av mellomgulvet muskel 9.
Likevel, disse to protocols fortsatt ikke fullt ut fange opp alle aspekter av respiratorisk patologi. For eksempel, hvis skade oppstår til de synkende bulbospinal axoner uten noen skader på PhMN bassenget eller phrenic nerve, CMAP amplituder kan fortsatt vises normalt, selv om det er betydelig svekkelse i denne kretsen fordi phrenic nerve er eksternt stimulert 14. Viktigst, CMAPs ikke tillate for måling av endogen supraspinal respirasjonen. Videre gjør CMAPs ikke gir et mål for generell ventilasjon. Det kan være gunstig å gjennomføre, for eksempel helkroppspletysmografi å undersøke generelle puste atferd og spontane intra-muskulært EMG opptak og phrenic nerve opptak for å teste endogen PhMN aktivering. I tillegg kan andre tilnærminger som måler blodgassnivåer gi viktig informasjon om lungefunksjon 15. Det kan også være mulig å benytte den beskrevne gulvet CMAP opptaksteknikk for motorenheten antall estimering16, men vi har aldri forsøkt dette. Det er også viktig å merke seg at disse to protokollene ble beskrevet for bare én respirasjonsmuskulatur, membranen. Men det er andre inspiratoriske og ekspiratoriske pustemuskulaturen slik som intercostals som kan studeres og som påvirkes av sykdommer som SCI og ALS.
I denne protokollen beskriver vi membran CMAP og NMJ analyse spesielt i rottemodellen. Likheter mellom rotter og mus gjør overføring av begge disse teknikkene til mus grei. Vi har tidligere vist at delvis tap av PhMNs følgende livmorhals kontusjon SCI resultere i målbare reduksjoner i mellomgulvet CMAP amplitude som korrelerer med morfologisk NMJ denervering. Videre har vi demonstrert disse underskuddene i både mus 17 og rotte 10-12 SCI-modeller. I tillegg har vi vist kvantifiserbar diafragma CMAP reduksjon i både mus og rotte 18 13,19 modeller av ALS (
Ved å kombinere histologiske og funksjonelle teknikker beskrevet i denne protokollen å undersøke pust og innervasjon på NMJ, bedre innsikt kan oppnås i nervesystemet sykdommer forbundet med diafragma dysfunksjon, og dermed gi økt bevissthet om hvordan å målrette behandlingsformer i dyremodeller og i siste instans hos pasienter .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS |
| 0.1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. Spinal Cord Injury. , Oxford. Available from: http://www.alibris.com/ (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
