Introduction
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine schwächende Erkrankung der Motoneuronen mit dem Verlust der beiden oberen und unteren motorischen Neuronen und damit Muskellähmung. Nach der Diagnose, ist das Überleben des Patienten auf nur 2-5 Jahren durchschnittlich 1. Zwerchfell Motor Neuron (PhMN) Verlust ist ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese der ALS. Patienten sterben schließlich durch den Verlust von PhMN Innervation der Membran, dem primären Muskelinspirations 2,3. Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist auch ein ernstes Problem im Zusammenhang mit Atembeschwerden. Etwa 12.000 neue Fälle von SCI treten jedes Jahr 4 aufgrund traumatischer Schädigung des Rückenmarks. Trotz Krankheit Heterogenität in Bezug auf Standort, Art und Schwere, die Mehrheit der SCI Fälle betreffen Trauma des zervikalen Rückenmarks, die oft zu einer schwächenden und anhaltenden Atem Kompromiss. Neben der ALS und SCI, anderen zentralen Nervensystems (ZNS) Erkrankungen können w zugeordnet werdenith Zwerchfellatemstörungen 5,6.
Die Zwerchfellnerv ist ein efferenten motorischen Nerven, die die ipsilateral Hemi-Diaphragma innerviert und stammt aus PhMN Zellkörper in den C3-C5 Ebenen des ipsilateralen Halsmark entfernt. PhMN Ausgang durch absteigend bulbospinal Eingang aus dem Hirnstamm in einem Gebiet wie dem rostralen ventralen respiratorischen Gruppe (rVRG) 7 bekannt gesteuert. Die rVRG-PhMN Membran Schaltung ist zentral für die Steuerung der inspiratorischen Atmung, sowie andere nicht-Ventilationsmembran Verhaltensweisen. Verschiedene traumatischen Verletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Schaltungen beeinflussen können, um eine tiefgreifende Rückgang der Lungenfunktion und Lebensqualität der Patienten führen. Nder Eingabe in PhMNs vom rVRG, PhMN Überleben, Phrenicus Integrität und korrekte Innervation am Diaphragma neuromuskulären Synapse (NMJ) sind alle für den normalen Membran-Funktion notwendig. Es ist daher wichtig, Techniken zu verwenden, dassquantitativ zu bewerten diese Schaltung in vivo in Tiermodellen von ALS, SCI und anderen ZNS-Erkrankungen.
Mit diesem Protokoll ist das Ziel, experimentelle Instrumente zur Bewertung PhMN Innervation des Zwerchfells sowohl auf der elektrophysiologischen und morphologischen Ebenen zu beschreiben. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) werden durch die Stimulierung alle efferenten motorischen Neurons Axone eines bestimmten motorischen Nerven und dann die Analyse der hervorgerufenen Depolarisation Reaktion der Ziel Muskelfasern aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann in vivo bei anästhesierten Ratten und Mäuse verwendet werden, um funktionelle Innervation des Hemidiaphragma durch PhMNs 8 quantifizieren. Aufgrund der Tatsache, dass CMAPs repräsentieren gleichzeitige Aufnahme aller (oder zumindest viele / die meisten) der Muskelfasern der gesamte Hemi-Membran ist es sinnvoll, auch die Phänotypen der einzelnen Motor Axonen und Muskelfasern an der Membran NMJ untersuchen, um Krankheit zu verfolgen - und therapierelevanten morphologischen Veränderungen, wie beispielsweise Teil und complete Denervierung, regenerative Sprießen und Reinnervation. Dies kann über ganze-mount Immunhistochemie (IHC) der Membran erreicht werden, gefolgt von detaillierten morphologischen Bewertung der einzelnen NMJs ganzen Muskel 9. Die Kombination CMAPs und NMJ Analyse bietet eine leistungsstarke Ansatz zur quantitativen Studium Zwerchfell Innervation in Nagetiermodellen von ZNS und PNS Krankheit.
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Protocol
Experimentellen Verfahren wurden von der Thomas Jefferson University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates (2010/63 / EU, 86/609 / EWG und 87 bis 848 / EWG), der NIH Leitfaden für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Labortieren und der Society for Neuroscience der Richtlinien über die Verwendung von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung.
1. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs)
- Vorbereiten des Tieres:
- Betäuben die Ratte mit einem Inhalations (Isofluran) bei 1-2% auf Wirkung oder durch Injektion (Ketamin, Xylazin, Acepromazin) geliefert. Dosierung von injizierbaren Anästhesie ist wie folgt: 95,0 mg / kg Ketamin, 10,0 mg / kg Xylazin, 0,075 mg / kg Acepromazin.
HINWEIS: Wir verwenden sowohl erfolgreich Inhalations und Injektionsanästhesie nähert sich bei der Durchführung dieses CMAP Aufzeichnungsprotokoll, ohne Präferenz. - Das Tier muss bei der entsprechenden a beibehalten werdennesthetic Tiefe vor der Operation begonnen wird, durch den Abschluss der Operation und bis zum postoperativen Buprenorphin wirksam geworden. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch kurze toe Prise, um festzustellen, dass ein Rückzug Reaktion nicht ausgelöst. Darüber hinaus prüfen die Kornealreflex mit einem Wattestäbchen. Der gesamten chirurgischen Prozedur zu bestimmen, dass die Herzfrequenz und Atemfrequenz nicht erhöht, was darauf hindeutet, daß die Narkosetiefe hat sich zu leicht.
- Tragen Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen des Tieres bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Der Operateur sollte sie mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin-Peeling) vor Beginn der Operation waschen / Händen. Der Operateur sollte sterile Handschuhe, Gesichtsmaske, und kleid oder reinigen Laborkittel tragen. Alle Instrumente sollten gewaschen und vor der Operation autoklaviert werden. Fügen Sie einen Sterilisationsindikatorstreifen im Inneren des Instruments Kit vor dem Autoklavieren auf der Ebene der Instrumente zu überprüfen, dass die Sterilisation abgeschlossen ist. Der Operateur sollteüberprüfen, ob die gesamte Zeile auf dem Streifen ist schwarz vor Beginn der Operation. Kleben Sie die Außenseite der Box mit Angabe Autoklaven Band auch. Wenn der Operation ist es, auf mehrere Tiere am selben Tag durchgeführt werden, reinigen Sie die Geräte zwischen Operationen und Sterilisieren in einer Glasperle Sterilisator. Falls erforderlich, sterilisiert beide Enden des Instruments in der Glasperle Sterilisator indem das Handstück des Instruments im Sterilisator für die entsprechende Zeit, das Entfernen des Instrumentes mit einer sterilen Hämostatikum, Abkühlen in einem sterilen Bereich und dann Platzieren des funktionalen Ende das Instrument in die Glasperle-Sterilisator für die entsprechende Zeit.
- Sobald Tier betäubt, kann am OP-Board mit Rückenfläche nach unten und Bauch nach oben, so dass die Band verwendet werden, um Tiervorderbeine, um chirurgische Platine befestigt werden.
- Rasur Ventralfläche kaudal beginnend an der Basis des Schädels und sicherzustellen, dass der Bereich um den Bauch zu beiden Seiten der Mittellinie ist shaved je nachdem, welche Hemidiaphragma aufgezeichnet wird. Gelten Povidonjod auf die rasierte Hautoberfläche.
- Betäuben die Ratte mit einem Inhalations (Isofluran) bei 1-2% auf Wirkung oder durch Injektion (Ketamin, Xylazin, Acepromazin) geliefert. Dosierung von injizierbaren Anästhesie ist wie folgt: 95,0 mg / kg Ketamin, 10,0 mg / kg Xylazin, 0,075 mg / kg Acepromazin.
- Vorbereitung für CMAP Aufnahmen:
- Nach Tier Vorbereitung, Ort Masseelektrode subkutan in Schwanz (Abbildung 1).
- Legen Sie die Referenzelektrode subkutan in die kontralaterale untere Bauchregion.
- Zeigen leitendes Gel auf selbstklebende Oberfläche Band oder Plattenaufzeichnungselektrode (Dimensionen der Oberfläche Streifenelektrode: 0,5 x 3 cm), und legen Sie dann Oberflächenelektrode quer entlang der einseitigen Rippenbogen.
- Zeigen Stimulationselektroden transkutan 0,5 cm Abstand seitlich zur Luftröhre und über dem Schlüsselbein. Legen Sie die Elektroden etwa 1,0 cm tief durch die Haut. Sichern Sie sich die Elektroden mit der Hand, so dass ihre Lage nicht mit anschließenden Stimulationen zu bewegen.
HINWEIS: Winkel stimulierenden Elektroden 90 ° relativ zu der Haut an der Stelle der insertion.
- Verbindung Muskelaktionspotenzial (CMAP) Aufnahmen:
- Erhalten Sie elektrophysiologischen Ableitungen mit einem Stimulator / Verstärker gefolgt von computergestützten Datenanalyse.
- Die Stimulationsparameter der einzelnen Pull-Stimulation sollte 0,5 ms, 1,0 Hz supra Impulse sein. Die Amplitude der Anregung sollte zwischen 6,0 und 8,0 V (2A) ist.
HINWEIS: In einem Experiment mit einem Stimulusintensität mit der gleichen Amplitude für Tiere. Das Ziel besteht darin, die Antwortamplitude unter Verwendung des minimalen Amplitude der Stimulation zu maximieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die erste Reaktion, die zum Zeitpunkt der Stimulation auftritt, ist ein Stimulationsartefakt. Außerdem sollte darauf geachtet werden, eine CMAP Reaktion, die von einem stabilen / Flachbasislinie nach der Stimulation Artefakt, das dann durch die schnelle Reaktion CMAP gefolgt vorausgeht erhalten. Um eine solche Reaktion zu erreichen, kann es notwendig sein, um die Stimulation zu positionieren und / oderAufzeichnungselektroden. - Warten Sie 30 s zwischen Stimulationen, und wiederholen Sie 10 Stimulationen in einer Reihe, um die durchschnittliche Antwort (2B - C) zu erhalten. Messung der Amplitude von der Grundlinie zur Spitze (2A). Führen Phrenicus Stimulation während der Phase des Atemzyklus des Tieres, wenn die Zwerchfellnerv / Membran ist nicht aktiviert. Das Verfahren kann auf dem gleichen Tier für die kontralaterale Hemidiaphragma wiederholt werden.
- Nach dem letzten CMAP Aufnahme-Session, durchströmen das Tier, wenn NMJ Färbung wird durchgeführt werden. Führen CMAP Aufnahmen immer wieder auf dem gleichen Tier etwa einmal pro Woche (oder Intervall der Wahl).
- Im Anschluss an das Überleben CMAP Aufnahmen ermöglichen Tier auf einem umlaufenden Warmwasserheizung Pad während der Wiederherstellung, bis wach und sternally Liegerad erholen, und kontinuierlich zu überwachen. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. </ Li>
- Sobald sternally Liegerad, überwachen die Tier jede 12 Stunden für die ersten 48 Stunden (einmal täglich danach). Wenn das Tier scheint dehydriert (schlaffe Haut, Lustlosigkeit) sein, zu verwalten Flüssigkeiten (Ringer-Laktat-Lösung; subkutan; 1-2 ml pro Injektion, mit den Standorten gedreht; 2 mal pro Tag) bis zum postoperativen Gewicht und Flüssigkeitsverlust stabilisiert. Bieten Tieren mit enthärtetem Essen in kleine Gerichte während der akuten postoperativen Phase bei Bedarf zu fördern essen, wenn sie den Draht bar Deckel Einzug nicht erreichen kann.
- Verabreichen Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 mg / kg bis zum Ende der Operation und dann bei 12 Stunden Intervallen für die ersten 24 Stunden (und abhängig von Anzeichen von Schmerz / Belastung danach) subkutan injiziert (site gedreht). Wenn Anzeichen von Schmerzen oder Leiden werden danach aufgefallen, behandeln Tiere mit Buprenorphin. Zeichen, die von Schmerz / Not gehören der Mangel an Aktivität, Lautäußerungen, mangelnder Essen oder Trinken (Dehydratation), übermäßiger Gewichtsverlust, Bewachung, excEssiv nagt oder Kratzen an der Stelle der Inzision. Bei der Bestimmung, Schmerzen und Leiden verwendet zusätzliche Kriterien umfassen Teilnahmslosigkeit auf äußere Reize, vorübergehende oder unprovozierten Stimmgebung, erschwerte oder abnormale Atmung, persistent rotbraune Nasen occular Entladung, markiert Piloerektion. Außerdem überwachen Beweis mangelnder Hygiene, die kranke Tiere vorschlagen würde. Wenn Tier noch beobachtet, um in Not nach 72 h der Behandlung (nach den Schmerz / Stresskriterien skizzieren oben und nach Erhalt der oben beschriebene Analgetikum-Protokoll) das Tier einschläfern.
2. Membranneuromuskuläre Junction (NMJ) Analyse
- Tier Dissektion:
- Verwaltung der Tier eine Überdosis injizierbaren Narkose (: Ketamin auf 285,0 mg / kg, Xylazin bei 30,0 mg / kg, Acepromazin bei 0,225 mg / kg; intraperitoneal 3 mal Dosis oben verwendet). Nach Überdosierung sollten alle Tiere eine zweite Methode der Euthanasie (Thorakotomie) haben to sicherzustellen Tod. Der Tod sollte durch Beobachtung der Herz- und Atemstillstand und mit der Feststellung festgelegt und erweiterte Pupillen des Tieres bestätigt werden.
- Führen Sie eine Laparotomie mit Skalpell oder Dissektion Schere Verlängerung der Exzision von der zyphoid Prozess kaudal entlang der Mittellinie. Sorgfältig trennen Haut und Bindegewebe von darunter liegende Muskulatur mit Skalpell und Pinzette.
- , Und ziehen Sie die zyphoid Prozess verwenden Dissektion Schere gesamte Membran zu entfernen, so dass die Membran bleibt umgebenden Knochen befestigt. Dies ist wichtig, da sie eine Beschädigung der Membrane Muskels zu vermeiden, wird für die erfolgreiche Präparation der gesamten Membran zu ermöglichen und beim Reinigen Muskels zur anschließenden Färbung unterstützen.
HINWEIS: An diesem Punkt kann ggf. Tier perfundiert werden.
- Reinigung und Färbung der Membran:
- Festzunageln die gesamte Membran präpariert, überlegene Seite nach oben, um Silikonkautschuk in einem Glas 100 mm Petrischale in4% Paraformaldehyd (in 1% Phosphat gepufferter Kochsalzlösung - PBS) für 20 min unter Verwendung eines Stereomikroskops. Dehnen Sie den Membran es straff zu machen, und unter Verwendung von Insekten Stifte, festzunageln das umliegende Gewebe, dass Blockieren verhindert die Membran Muskel selbst (Abbildung 3).
- Sorgfältig reinigen Bindegewebe nur von der oberen Fläche Muskel mit # 5 Zangen und kleine Schere.
HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte dieses Färbeprotokoll langsam Schütteln bei Raumtemperatur vor Licht abgedeckt sofern nicht anders angegeben. Stellen Sie sicher, dass die Membran Muskel immer vollständig in Flüssigkeit eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern out. - Vor dem Färben, bereiten alle notwendigen Reagenzien: 1x PBS, 2% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS und 0,2% TBP hergestellt (0,2 % Triton X100 in 2% BSA / PBS). Achten Sie darauf, bei -20 vorzukühlen Methanol ° C.
- Wash 3x für 10 min in 1x PBS.
- Inkubieren in 0,1 M Glycin (in 2 gemacht% BSA / PBS) für 30 min.
- Inkubieren RBTX (Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin) -Lösung für 15 min. Lösung für RBTX ist wie folgt: Rhodamin-konjugiertem alpha Bungarotoxin 1: 400-Verdünnung in 1 × PBS.
HINWEIS: In diesem Protokoll Rhodamin verwendet wird, aber jede Fluorophor der Wahl kann für die Färbung eingesetzt werden. - Wash 3x für 10 min in 1x PBS.
- In -20 ° C Gefrierschrank, Inkubation mit MeOH 5 min.
HINWEIS: MeOH bevor Muskel in der Tiefkühltruhe nicht hinzuzufügen, und umgehend entfernen Lösung nach der Inkubationszeit. - Wash 3x für 10 min in 1x PBS.
- Block in 0,2% TBP 1 Stunde (0,2% Triton gemacht in 2% BSA / PBS).
- Inkubieren mit primärer Antikörperlösung (bei 0,2% TBP) bei 4 ° C über Nacht unter Schütteln. Verdünnungen von Antikörpern wie folgt: SV2 (1:10) und SMI-312 (1: 1000).
- Für 10 min mit 0,2% TBP waschen 3x.
- Inkubieren mit sekundärem Antikörper unter Verwendung von 1: 100 Verdünnung FGM1 (FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG1; in 0,2% TBP) machte beim Schaukeln für 1 Stunde.
HINWEIS: Vor Licht für den Rest des Protokolls für die Färbung. - Wash 3x für 10 min mit 1x PBS.
- Re-clean umgebende Bindegewebe am überlegen (siehe oben) Oberfläche der Muskeln vor der Montage und Eindecken.
HINWEIS: Es wird empfohlen, zu reinigen und dann montieren Probe unmittelbar nach der Färbung. Wenn es jedoch notwendig, Probe kann in 1x PBS bedeckt werden, in Parafilm eingewickelt, um eine Verdunstung zu verhindern und bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert, mit wechselnden PBS täglich. - Bei Montage auf Glasobjektträger, Deckglas mit nicht hardset Vectashield. Siegel Kanten der Deckglas mit klarem Nagellack, um ein Austrocknen zu verhindern out. Shop Folien flach in Karton Dia Ordner liegen in -20 ° C für die langfristige.
- Analyse und konfokale Abbildung:
- Quantitativen Analyse der Morphologie des gefärbten und montiert Hemi-Membran unter 20X und 40-facher Vergrößerung unter Verwendung eines aufrechten EpifluoreszenzMikroskop.
Hinweis: Da die Membran angefärbt und in einer ganzen-mount Weise analysiert, ist ziemlich dick der Muskel. Folglich ist der größte Teil der Fluoreszenzfärbung völlig unscharf, wenn ein statisches Bild mit nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Aus diesem Grund ist es am besten, um die NMJ Analyse in Echtzeit auf dem Mikroskop durchzuführen, da dies ermöglicht es Ihnen, sich ständig konzentrieren "up" und "down" durch den Muskel, um die Morphologie von jedem der einzelnen NMJs richtig zu identifizieren. Mit diesem Ansatz kann man leicht folgen die Flugbahn der einzelnen Motor Axone, wie sie durch das Gewebe in räumlicher Beziehung zu den postsynaptischen Rezeptor-Cluster zu verschieben. - Durch Messung der ventral-zu-Rücken-Länge des Muskels, teilen den Muskel in 3 separate Abschnitte für die Analyse basierend auf topographische Innervationsmuster von bestimmten Rückenmarks Ebenen (Figur 4H).
- Beginnend an der Bauchseite des Muskels und moving dorsal, analysieren alle en face NMJs auf Oberfläche Muskelfasern entfernt. Nicht analysieren Muskelfasern tiefer als die ersten 3-4 Fasern von der Oberfläche als Interpretation schwierig sein kann, an der schlechteren Antikörper Penetration (RBTX dringt viel tiefer in den Muskel durch die geringe Größe des Toxins im Vergleich zu den größeren Antikörper zur Markierung Neuronen).
- Kennzeichnen Sie jeden NMJ als intakt, wenn die Pre-terminalen Axon des Neurons ist dick im Durchmesser und alle Regionen des Nervenende überlappen vollständig mit der zugrundeliegenden Muskelacetylcholinrezeptoren (AChRs).
- Kennzeichnen Sie jeden NMJ als teilweise denervierten falls Bereich der darunter liegende Muskulatur AChRs unbesetzt ist mit entsprechenden Nervenende.
- Kennzeichnen Sie jeden NMJ so vollständig denervierten, wenn die Muskel AChRs haben keine entsprechende Nervenende (es ist auch wichtig, um andere NMJs mit markierten Neuronen in dem selben Gebiet des Fokus zu haben, so dass man sicher, dass der Mangel an Nervenende ist nicht nur darauf zurückzuführen sein poor Antikörper Penetration in dem Bereich des Muskel).
- Identifizierung jedes NMJ wie mehrfachinnerviert, wenn es mehr als eine präterminale Axon innervating eine individuelle NMJ (dies zeigt, dass es an dieser Verbindung war ein gewisses Maß an Denervierung und wahrscheinlich Versuche reinnervation).
- Kennzeichnen Sie jeden NMJ so dünn innerviert, wenn die NMJ hat die komplette Überdeckung zwischen Nervenendigung und die zugrunde liegenden AChRs aber hat eine dünne präterminale Axon (auch dies ist ein Hinweis auf ein gewisses Maß an Denervierung und Reinnervation Versuche).
- Analyse durchzuführen für jede der identifizierten Regionen 3 für alle der oben genannten Kategorien NMJ für jedes Tier. Der Mittelwert der Daten von jedem Tier mit den Ergebnissen aus anderen Tieren aus demselben Versuchsgruppe. Etwa 200-300 Gänge in Ratten Hemidiaphragma Muskel und 150-200 in Maus Hemidiaphragma sollte mindestens 3 (vorzugsweise 5-6 oder mehr) Tiere pro Versuchsgruppe quantifiziert werden.
- Erhalten Sie hochauflösende konfokale Bilder, Verwendungd für die Veröffentlichung, mit einem konfokalen Mikroskop.
- Erhalten Sie Z-Stapel bei 0,3 & mgr; m Schrittweite für 20-40 & mgr; m Tiefe, und sammeln Sie zusätzliche optische Abschnitte oberhalb und unterhalb jeder Verbindung, um sicherzustellen, dass die gesamte synaptischen Profil ist inbegriffen.
- Verwenden Erfassungssoftware zur z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren.
- Quantitativen Analyse der Morphologie des gefärbten und montiert Hemi-Membran unter 20X und 40-facher Vergrößerung unter Verwendung eines aufrechten EpifluoreszenzMikroskop.
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Representative Results
Erwachsene Sprague-Dawley Ratten erhielten entweder nur Laminektomie (unverletzt Kontrolle) oder einseitige Hemi-Prellung SCI an der C4 Rückenmarksebene 10-12. 5 Wochen nach der Operation, Spitzen CMAP Amplitude von aufgezeichneten die Hemi-Membran ipsilateral zur Laminektomie / Verletzungsstelle war maßgeblich an SCI-Ratten (2C) reduziert im Vergleich zu nur Laminektomie-Kontrolle (2B). Alle NMJs in der Hemi-Membran waren in Kontrolle nicht erkrankten Wildtyp-Ratten (4A, C) vollständig erhalten. Im Gegenteil, SOD1 G93A Ratten (ein Nagetier-Modell der ALS) zeigten signifikante Pathologie an Hemi-Membran NMJs (4B), einschließlich vollständiger Denervierung (Abbildung 4G, Pfeilspitze), partielle Denervierung (4E, Pfeilspitze, 4G, NMJ auf rechts), mehrfache Innervation (4D) und dünn präterminale Axone (4F, Pfeilspitze).
Abbildung 1: CMAP Elektrodenplatzierung. Die Masseelektrode wird subkutan in die Schwanzvene gelegt. Die Referenzelektrode wird in das Abdomen platziert. Die Oberfläche Aufzeichnungselektrode quer entlang der einseitigen Rippenbogen platziert. Stimulationselektroden sind, da beide rot und schwarz dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 2: CMAP Aufnahmen und Analysen (A) Die Amplitude der CMAP Antwort kann vom Ausgangswert bis Spitze gemessen werden. Eine typische CMAP Antwort sollte sowohl die Reizartefakt zeigenund-Antwort-Kurve. (B - C) Vertreter durchschnittliche CMAP Antworten. Stimulation sollte mindestens zehn aufeinanderfolgenden Zeiten durchgeführt werden, um eine wiederholte Mittelwert der Reaktion zu erhalten. Sehen Sie hier eine Laminektomie nur unverletzten Ratten (B) und ein Vergleich der CMAP-Antworten für eine verletzte Ratte, die eine einseitige C4 Hemi-Prellung (C) erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Herstellung von Membran für ganze-mount-Färbung. Insect Pins sollten in das umliegende Gewebe, die Hemi-Membran Sylgard sichern platziert werden. Vermeiden Sie es, Stifte in den Muskel selbst. In diesem Bild sind die beiden halbZwerchfellMuskeln gezeigt und festgenagelt SEPArat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: NMJ Phänotypen. Konfokale Bildgebung durchgeführt, um postsynaptischen Acetylcholin-Rezeptoren (in rot mit Rhodamin-konjugierten α Bungarotoxin beschriftet) und axonale Fasern und präsynaptischen Terminals sichtbar zu machen (in grün markiert mit SMI-32 und SV2 Antikörper, respectively). Alle NMJs in Hemi-Membran waren in Kontrolle nicht erkrankten Wildtyp-Ratten (A, C) vollständig erhalten. Im Gegenteil, SOD1 G93A Ratten (ein Nagetier ALS Modell) zeigte eine signifikante Pathologie an Hemi-Membran NMJs (B), einschließlich vollständiger Denervierung (G, Pfeilspitze), partielle Denervierung (E, Pfeilspitze; G (D) und dünn präterminale Axone (F, Pfeilspitze). Das Zwerchfell ist unterteilt in drei getrennte Abschnitte für NMJ Morphologieanalyse (H) 13. Maßstab:. 25 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Als Atemfunktion wird sowohl traumatischen SCI und ALS beeinträchtigt, die Entwicklung von Therapien, die Atmung und speziell Membran Innervation Ziel sind klinisch relevante 5,6. Um die Atemfunktion umfassend zu studieren, sollte ein kombinierter Ansatz Methode verwendet werden. CMAPs messen den Grad der funktionellen Innervation des Zwerchfells durch externe Zwerchfellnervenstimulation, aber nicht endogenen bulbospinal Atemantrieb 8. Hinzu kommt, dass diese Aufnahmen nicht zur Untersuchung von morphologischen Veränderungen im NMJ ermöglichen, insbesondere auf der Ebene der einzelnen Motor Axonen und postsynaptischen Acetylcholinrezeptoren. Durch die Verwendung der beschriebenen Färbungsprotokoll, kann man quantitative Erfassung relevanten morphologischen Phänotypen wie komplette Denervation, partielle Denervierung und sogar regenerative Sprießen und Reinnervation an einzelnen NMJs der Membran Muskel 9.
Dennoch sind diese beiden protocols immer noch nicht vollständig erfassen alle Aspekte des Atem Pathologie. Zum Beispiel, wenn eine Schädigung der Axone absteigend bulbospinal ohne Beschädigung des PhMN Pool oder Zwerchfellnerv tritt, CMAP Amplituden können noch normal erscheinen, obwohl es signifikante Beeinträchtigung in dieser Schaltung, weil die Zwerchfellnerv extern stimuliert 14. Wichtig ist, dass CMAPs nicht zur Messung von endogenen supraspinale Atemantrieb zu ermöglichen. Darüber hinaus haben CMAPs nicht ein Maß für allgemeine Belüftung. Es kann vorteilhaft sein, durchführen zu können, beispielsweise Ganzkörperplethysmographie die Gesamtatmungsverhaltens und spontane intramuskuläre EMG und Zwerchfellnerv-Aufnahmen zu untersuchen, um die endogene Aktivierung PhMN testen. Darüber hinaus können andere Ansätze wie die Messung des Blutgaswerte wichtige Informationen über die Atemfunktion 15 bereitzustellen. Es kann auch möglich sein, den beschriebenen Membran CMAP Aufzeichnungstechnik für Krafteinheit Zahlschätzung einzusetzen16, obwohl wir noch nie versucht diese. Es ist auch wichtig zu beachten, dass diese beiden Protokolle wurden für nur eine Atemmuskel, der Membran beschrieben. Es gibt jedoch auch andere in- und exspiratorischen Atemmuskulatur, wie die Zwischenrippen, die untersucht werden kann und durch Krankheiten wie SCI und ALS betroffen sind.
In diesem Protokoll beschreiben wir Membran CMAP und NMJ Analyse speziell im Rattenmodell. Ähnlichkeiten zwischen Ratten und Mäuse machen Übertragung von sowohl dieser Techniken, um Mäuse unkompliziert. Wir haben bereits gezeigt, dass teilweise Verlust der PhMNs folgenden Halsquetschung SCI ist in messbaren Abnahme der Blende CMAP Amplitude, die mit morphologischen NMJ Denervierung korrelieren führen. Darüber hinaus haben wir diese Defizite in beiden Maus 17 und Ratte 10-12 SCI Modellen gezeigt. Darüber hinaus haben wir quantifizierbare Membran CMAP Verringerung sowohl der Maus 18 gezeigt und Ratten 13,19 Modelle ALS (
Durch die Kombination der histologischen und funktionellen Techniken in diesem Protokoll, um die Atmung und Innervation am NMJ untersuchen detailliert, bessere Einsicht kann in Erkrankungen des Nervensystems mit Membran Dysfunktion gewonnen werden, wodurch das Bewusstsein für wie Therapien in Tiermodellen Ziel und letztlich bei Patienten .
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1x PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2 g BSA into 100 ml of 1x PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (blocking buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2 ml/100 ml 2% BSA/PBS |
| 0.1 M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185 g to 25 ml of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30 mm, 60 mm, 100 mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
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