Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.
It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.
Kvantitativ nukleinsyreamplifikation er en vigtig teknik til påvisning af miljø-, fødevarebårne og vandbårne patogener samt til klinisk diagnostik. Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) er guldstandarden metode til følsomme, specifikke og kvantitativ påvisning af nukleinsyrer, fx for HIV-1 viral afprøvning belastning påvisning af bakterielle patogener, og screening for mange andre organismer 1 – 3. I realtid qPCR primere opformere patogen DNA i cyklusser, og et fluorescerende signal genereres, der er proportional med mængden af amplificeret DNA i prøven ved hver cyklus. En prøve indeholdende en ukendt koncentration af patogen DNA kan kvantificeres ved hjælp af en standardkurve, der relaterer den oprindelige DNA-koncentration af standardprøver og det tidspunkt, hvor det fluorescerende signal når en vis tærskel (dvs. tærskelværdien cyklus eller C T).
<p class="Jove_content"> Fordi realtid qPCR kræver dyrt termisk cykling udstyr og flere timer at modtage resultater, alternative isotermiske amplifikationsteknikker, såsom rekombinase polymerase amplifikation (RPA), er blevet udviklet 4. Disse platforme generelt giver resultater hurtigere og amplificere nukleinsyrer ved en lavere, enkelt temperatur, der kan opnås med billigere, enklere udstyr. RPA, hvilket er særlig attraktivt for point-of-care-programmer, forstærker DNA i minutter, kræver en lav forstærkning temperatur (37 ° C), og forbliver aktiv i nærværelse af urenheder 5,6. RPA assays er blevet udviklet til en bred vifte af applikationer, herunder mad analyse påvisning af patogener, cancer drug screening, og afsløring af biothreat agenter 7-12. Imidlertid har brug af RPA til kvantificering af nukleinsyrer været begrænset 13,14.I tidligere arbejde, det var shown at real-time kvantitativ RPA (qRPA) er mulig 15. Her er en mere detaljeret protokollen i henhold til at bruge real-time kvantitativ RPA at kvantificere ukendte prøver ved hjælp af en standardkurve, en metode, der er analog med kvantificering hjælp qPCR. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en RPA reaktion på en termisk variator til at påvise HIV-1 DNA som et proof-of-concept, samt hvordan man kan udvikle en intern positiv kontrol (IPC) at sikre, at systemet fungerer korrekt. Dataindsamling ved hjælp af en termisk cykler eller mikroskop og dataanalyse til at konstruere en standardkurve ved hjælp træningsdata også detaljeret. Endelig er metoden til kvantificering ukendte prøver ved hjælp af standardkurven med en brugerdefineret script demonstreret. Dette qRPA teknik muliggør kvantificering af prøver med ukendte koncentrationer og har mange fordele frem for traditionelle realtid qPCR.
For at opnå meningsfuld kvantificering af data ved hjælp af MATLAB algoritme, skal brugeren vælge passende input værdier, når du bliver bedt om. Efter opstart hver script i punkt 5 og 6, er alle input variabler automatisk anmodet i kommandovinduet og udgange er automatisk genereret. I afsnit 5.7 brugeren bedt om at vælge en skråning tærskel. Værdien af tærskelværdien hældning påvirker kvadratet af korrelationskoefficienten (R2) af pasform. Ved brug af rå fluorescensdata eksporteres fra et termis…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er finansieret af en bevilling fra Bill & Melinda Gates Foundation gennem Grand Udfordringer i Global Health Initiative.
qRPA Assay | |||
Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
HIV-1 forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ |
HIV-1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ |
HIV-1 probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ |
IPC probe | BioSearch Technologies | custom DNA oligos | 5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’ |
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate | TwistDx | TwistAmp exo | |
PCR tube strips | BioRad | TLS0801 | |
PCR flat cap tube strips | BioRad | TCS0803 | |
Micro-seal adhesive | BioRad | 558/MJ | |
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr) | custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003). | ||
Human male genomic DNA | Applied Biosystems | 360486 | |
96 well cold-block | Cole Parmer | EW-36700-48 | |
Thermal cycler | BioRad | CFX96 | |
MiniFuge | VWR | 93000-196 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | |
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0 | EMD Millipore | 648314 | |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Promega | V4321 | |
Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
IPC Development | |||
Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
Cryptosporidium parvum IPC template | Waterborne Inc | P102C | It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1 |
PCR long forward primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’ |
PCR long reverse primer | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | 5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’ |
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
TAE 10X buffer | EMD Millipore | 574797 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Microscope Experiments | |||
Supply | Vendor | Part number | Comments/Description |
Upright fluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Imager.J1 | |
Stage heater | Bioscience Tools | TC-GSH | |
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller | Bioscience Tools | TC-1100S | |
FAM/GFP filter cube | Zeiss | filter set 38 (000000-1031-346) | excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm |
HEX filter cube | Chroma | 49014 | excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm |
Laser cutter | Engraver's Network | VLS3.60 | |
1/8" black acrylic | McMaster Carr | 8505K113 | |
1.5 mm clear acrylic | McMaster Carr | PD-72268940 | |
Super glue | Office Depot | Duro super glue | |
PCR grade mineral oil | Sigma Aldrich | M8662-5VL | |
Data Analysis | |||
Software | Vendor | ||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
MATLAB | MATLAB | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m” | Included in SI | ||
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m” | Included in SI | ||
Adobe Illustrator | Adobe | ||
JoVE_qRPA_well.ai | Included in SI | ||
JoVE_qRPA_base.ai | Included in SI | ||
AxioVision software | Zeiss | ||
JoVE_AxioVision_Script.ziscript | Included in SI |