The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Tidlig embryogenese ud fra en enkelt celle zygote går gennem hurtig celledeling og morfogenese, og er morfologisk kendetegnet ved præ-globulære, globulære, hjerte, torpedo og kimblad etaper. Denne gradvise udvikling er under den stramme regulering af et komplekst molekylær netværk. Høst tilstrækkelige tidlige embryoner på et tilsvarende udvikling er afgørende for at undersøge den cellulære og molekylære regulering af tidlig embryogenese. Dette er ikke ligetil, da tidlig embryogenese undergår hurtig morfogenese i en kort tid fx 8 dage for Medicago truncatula at nå den tidlige cotyledon fase. Her løse vi problemet ved to tilgange. Den første etablerer en kobling mellem udvikling embryo og pod morfologi i at hjælpe angive den fase af zygotisk embryo. Dette er især baseret på antallet af pod spiraler og udviklingen af pigge. En alternativ måde at supplere in vivo studies er via dyrkning bladeksplantater at producere somatiske embryoer. Mediet omfatter en usædvanlig hormon kombination – et auxin (1-naphthaleneddikesyre), et cytokinin (6-benzylaminopurin), abscisinsyre og gibberellinsyre. De forskellige trin kan skelnes vokser ud af callus uden dissektion.
Bælgfrugter er den tredje største familie af højere planter med ca. 20.000 arter og Leguminosae (eller Fabaceae) familie er andet til korn i området høstet og samlet produktion 1. Sojabønner er den tredje største dyrkede afgrøde. Bælgplanter giver omkring en tredjedel af kosten protein og en tredjedel af vegetabilsk olie til konsum 2. Bælgplanter med deres N2 fastsættelse kapacitet bidrager også til bæredygtige landbrugssystemer. Medicago truncatula, ligesom soja, butikker protein og olie i kimbladene sine frø og er en genetisk og genomisk bælgplanter model med betydelige genetiske og genomiske ressourcer 3,4. Mens M. truncatula har gjort det muligt fremskridt i forståelsen af bælgplante-Rhizobium symbiose 4 er det blevet mere og mere anvendt til at studere frø af bælgplanter biologi 5-7 og embryogenese 8,9. Arabidopsis embryogenese er blevet omfattende undersøgt 10,11, men det jegsa ikke-bælgplanter og detaljerne i embryogenese er ikke identiske med Medicago 8,10. Zygotisk embryogenese i M. truncatula har interessante funktioner, med en karakteristisk multicellulær hypofysen, en endoployploid Suspensor og basal transfer celle 8.
Somatisk embryogenese (SE) er almindeligt anvendt til at regenerere planter 12. I bælgplanter model M. truncatula, frø linje Jemalong 2HA (2HA) er udviklet fra moderselskabet Jemalong at have høje somatisk embryogenese 13. Antallet af embryoner er for nylig blevet indholdsmæssigt forøget ved tilsætning både gibberellinsyre (GA) og abscisinsyre (ABA) til længe etablerede medium 14. I dette tilfælde GA og ABA virker synergistisk, hvilket er usædvanligt, GA og ABA gælder almindeligvis antagonistisk 14. Der er produceret af callus embryoner udvikle sig på overfladen, som tillader den fase af embryogenese til let bestemmes visually og let høstes. Under nær isogene linjer, der er embryogent (2HA) og ikke-embryogenisk (Jemalong) letter undersøgelse af somatisk embryogenese, og som har både in vivo og in vitro-systemer giver forskellige eksperimentelle muligheder.
Forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer i udviklingen embryo er afgørende for forståelsen frø og planter udvikling. I bælgplanter, som i andre tokimbladede, er kimbladene af embryonet at oplagre produkter, som anvendes til human ernæring. Tidlig embryogenese involverer hurtig celledeling, og korrekt embryo mønster. I ca. 8 dage efter befrugtningen, M. truncatula embryo når tidlige cotyledon faser. Den morfologiske karakterisering er ikke ligefrem angivet ved dage efter befrugtningen i drivhusbetingelser. Således en effektiv standardiseret tilgang til at angive den fase af udviklingslandene embryoner er værdifuld i at studere den genetiske regulation af tidlig zygotisk embryogenese.
I dette papir, giver vi to standardiserede protokoller til at indsamle udviklingslandene embryoner til biologiske undersøgelser af embryogenese i bælgplanter model M. truncatula. Den første er at indsamle zygotiske embryoner ved at associere embryogenese og pod morfologi, mens den anden er somatisk embryogenese via dyrkning bladeksplantater at tilvejebringe nemt tilgængelige store embryo tal.
De beskrevne protokoller er relativt ligetil og tillade undersøgelse af bælgplante embryogenese med alle moderne celle og molekylære teknikker. Vi anerkender, at der er fordele og ulemper ved både in vivo og in vitro metoder. Begge tillade mere fokus på tidlig embryogenese i forhold til kultur af umodne frø 19.
I tilfælde af in vivo-undersøgelser, der er beskrevet overvejende isoleringen af ovule fra bælgen som er egnet til mange embryo studier. Det er n…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
Major salts | |||
Minor salts | |||
Vitamins | |||
Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
Plant hormones | |||
1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
Equipment | |||
Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
Sterilising leaves | |||
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |