Abstract
Tek bir hücre zigot başlayarak Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve morfogenez geçer ve morfolojik öncesi küresel, küresel, kalp, torpido ve kotiledon aşamalarında ile karakterizedir. Bu ilerici gelişme karmaşık bir moleküler ağ sıkı yönetmelik altındadır. Benzer bir gelişme aşamasında yeterli bir erken embriyolar Hasat erken embriyogenez hücresel ve moleküler düzenleme incelemek için gereklidir. Medicago'dan örneğin 8 gün erken kotiledon aşamaya ulaşmak için truncatula ise erken embriyogenez kısa hızlı morfolojilerinden uğrar çünkü bu kolay değildir. Burada, iki yaklaşımlarla sorunu gidermek. İlki zigotik embriyo aşamasına işaret yardımcı embriyo gelişimi ve bakla morfolojisi arasında bir bağlantı kurar. Bu, özellikle bakla spiraller ve dikenler geliştirilmesi sayısına dayanır. In vivo s tamamlayacak alternatif bir yoltudies somatik embriyoların üretilmesi için kültür yaprak eksplantlarından yoluyladır. Orta sıra dışı bir hormon kombinasyonu içeren - bir oksin (1-naftalenasetik asit), bir sitokinin (6-benzilaminopurin), absisik asit ve gibberellik asit. farklı aşamalarında diseksiyon olmadan kallus dışında büyüyen ayırt edilebilir.
Introduction
Hasat alan ve toplam üretim 1'de hububat ikinci baklagiller, yaklaşık 20.000 tür ve Leguminosae (Fabaceae veya) ailesi ile yüksek bitkilerin üçüncü büyük aileyiz vardır. Soya üçüncü büyük kültür bitkisidir. Tahıl baklagiller diyet proteini üçte biri ve insan tüketimine 2 bitkisel yağ üçte biri ile ilgili sağlar. Onların N 2 sabitleme kapasitesi ile Baklagiller ayrıca tohum kotiledonlarında soya, mağazalar protein ve yağ gibi. Sürdürülebilir tarımsal sistemlere Medicago truncatula katkıda önemli genetik ve genomik kaynakların 3,4 ile genetik ve genomik baklagil modelidir. M. iken truncatula giderek baklagil tohum biyolojisi 5-7 ve embriyojenezi 8,9 incelemek için istihdam edilmiştir baklagil-rhizobium simbiyoz 4 anlamada ilerlemeler sağladı. Arabidopsis embryogenesis yoğun 10,11 okudu ama ben olmuştursa olmayan baklagil ve embriyogenez ayrıntıları Medicago'dan 8,10 özdeş değildir. M'de zigotik embryogenesis truncatula farklı bir çok hücreli hipofiz, bir endoployploid uyutucuya ve bazal transferi hücresinin 8, ilginç özelliklere sahiptir.
Somatik embriyojenez (SE), yaygın olarak bitkiler 12 rejenerasyonu için kullanılır. Baklagil modelinde M. In truncatula, ebeveyn Jemalong dan geliştirilmiştir tohum çizgisi Jemalong 2HA (2HA) somatik embriyogenez 13 yüksek oranlarına sahip. üretilen embriyoların sayısı son zamanlarda önemli ölçüde köklü orta 14 hem gibberelik asit (GA) ve absisik asit (ABA) eklenerek artış olmuştur. GA ve ABA genellikle antagonistik 14 hareket verilen sıradışı sinerjik bu durumda GA ve ABA hareket içinde. kallustan embriyoların embriyogenez evresi hali hazırda visuall saptanmasına olanak sağlamaktadır yüzeyi üzerinde gelişebiliry ve kolaylıkla hasat edildi. Somatik embriyojenez incelenmesi (Jemalong) (2HA) embriyonik ve embriyonik olmayan olan izojenik hatlarının yakınında kolaylaştırır olması ve in vivo ve farklı deneysel olanaklar sağlar in vitro sistemlerde de sahip.
Embriyo gelişimi hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması anlayış tohum ve bitki gelişimi için gereklidir. Baklagiller, diğer çeneklilere olduğu gibi, insan beslenmesi için kullanılan ürünler depolamak embriyo kotiledonları olduğunu. Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve doğru embriyo desenlendirme içerir. 8 gün sonra gübreleme, M'de truncatula embriyo erken kotiledon aşamaları ulaşır. morfolojik karakterizasyon tam sera koşullarında döllenme sonrasında gün gösterilmez. Böylece, gelişmekte olan embriyo aşamasına belirtmek için verimli bir standart yaklaşım, genetik REGUL okuyan değerlidirErken zigotik embriyojenezin tirme.
Bu yazıda, baklagil modelde M. de embriyogenezin biyolojik çalışmalar için gelişen embriyolar toplamak için iki standart protokolleri sağlamak truncatula. İlki ikinci kolayca erişilen büyük embriyo sayıları sağlamak için kültür yaprak eksplantlarından yoluyla somatik embriyogenesis ise embriyogenez ve pod morfolojisi ilişkilendirerek Zigotik embriyolar toplamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zigotik Embriyo Gelişimi
- Bitki Materyali
- Büyüme Medicago, bir 14 saatlik aydınlık periyoduyla serada 23 ° C / 19 ° C gündüz / gece sıcaklığı yabani tip Jemalong ya da yüksek oranda yeniden generable onun yakınındaki izogenik, (2HA olarak da bilinir) genotip Jemalong 2HA 13 truncatula.
- Suyun tohumu girin ve bir gece suda bekletin izin, böylece tohumun ekim önce Pierce (23 G iğne ile), tohum kaplama yüzeyi. Tam tohum örtecek kadar su ekleyin.
- Saksı karışımı içinde her 15 cm çapında pota 3 tohum ekmek (10 kapların toplam) (kaba kum, perlit, lif-turba (1: 1: 1) artı Osmocote Exact Standardı 5 g: Yavaş salimli gübre) ve aktarma sera. Bitki tırmanmak sapları için pot ve çevre başına 1 bitki bir kafes tarafından var bu yüzden çimlenme sonrası sağlıklı fide saklayın.
- Büyüme Medicago, bir 14 saatlik aydınlık periyoduyla serada 23 ° C / 19 ° C gündüz / gece sıcaklığı yabani tip Jemalong ya da yüksek oranda yeniden generable onun yakınındaki izogenik, (2HA olarak da bilinir) genotip Jemalong 2HA 13 truncatula.
- Hasat Bölmeler
- W gelen bakla toplayınJemalong veya 2HA uygun erken embriyo aşamalarında elde etmek ild türü olarak ilk 9 nitelendirdi.
Not: Farklı bölme aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir ve karşılık gelen embriyo aşamaları, Şekil 2'de gösterilmiştir. - Ayrı aşamaları 6 ve 7 (Tablo 2) yardım etmek için sahneye 6 geçen süreyi. Tablo 1 gereğince kriterleri kullanılarak hasat farklı pod aşamalarını kontrol ölçün.
- W gelen bakla toplayınJemalong veya 2HA uygun erken embriyo aşamalarında elde etmek ild türü olarak ilk 9 nitelendirdi.
- Bölmelerinden ovüllerin Kesme ve embriyo aşaması kontrol
- Gerekirse tek başına ince forseps kullanarak bakla veya stereo mikroskop ve forseps gelen ovüllerin izole edin. Gerekirse embriyo aşaması hızla standart bileşik mikroskobu (Şekil 3B) kullanılarak kontrol edilebilir.
- Arabic 7.5 g sakız, 100 g klor hidrat, 5 ml gliserol, damıtılmış deiyonize su 60 ml su ihtiva eden Hoyer çözeltisi modifiye hazırlayın. 3-5 saat veya gece boyunca karıştırılarak çözülür.
- Daha fazla rafine içind mikroskopi modifiye Hoyer çözümü 15,16 disseke ovüllerin temizleyin. Dikkatle berrak olana kadar oda sıcaklığında (ovül karşılamak için yeterli) Hoyer çözeltisi, küçük bir hacim içinde sağlam ovüllerin ve yeri al.
- Diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ile örnekleri görüntüleyin. Bir dijital fotoğraf makinesi 9 (Şekil 2) iwth görüntüler çekin.
- Pod merkezi bölgesinde en üniforma ovüllerin edinin ve gerekli sayıda birikir. Bir örnek, Şekil 3A'da gösterilmiştir. Daha fazla analiz için gerekli sıcaklıkta buz ve mağaza ovüllerin (-80 ° C için nükleik asitler) toplayın.
NOT: histolojik kesitlerin analizi, transmisyon elektron mikroskobu ile ilgili detaylar için, ve in situ melezleme kağıtları 8,9 bakınız.
İn Vitro 2. Somatik Embriyo Gelişimi
- Bir M. kullanın truncatula çeşidi tŞapka kolaylıkla kültür embriyoları meydana edebilmektedir. Yaprak eksplantlarından için bu protokol için 2-4 aylık olduklarında 2HA bitkiler 13,17 kullanın.
- Bir uzatma kök son neredeyse tamamen genişletilmiş üç yapraklı yapraktan broşürler alın.
- Dehidratasyonu önlemek için bir kültür tencerede nemli kağıt havlu üzerinde üç yapraklı yaprakları tutun.
NOT: üç yapraklı yaprak hasat edilir sonra da en az gecikmeyle kullanılabilir olması gerekir. - Kültür ortamının hazırlanması
- 4: 1: agar 5 orta (ağırlık% 0,8: hacim) içinde 9 cm Petri kapları P4 10 kullanın.
Not: P4 10: 4: 1: 5, orta P4 bazal ortamı 18 artı 10 uM 1-naftalenasetik asit (NAA), 4 uM 6-benzilaminopurin (BAP), 1 uM absisik asit (ABA) ve 5 uM gibberellik oluşmaktadır asit (GA). GA + ABA kullanımı embriyo oluşumunu hızlandırır ve embriyo sayısı 14 maddi artışlara neden olmaktadır. - 1 L P4 bazal ortamı Makyaj; (calciu yaptığı büyük tuzlarından oluşan,) ayrı ayrı m minör tuzları ve vitaminler (Tablo 3), şelatlanmış demir (ayrı makyaj), kazamino asitler (kasein hidrolizat), 30 g sakroz, 8 g agar.
- Uygun parçalar halinde -20 ° C'de ana tuzlar, kalsiyum, kazamino asitler, minör tuzları ve vitaminler mağazası stok çözeltileri. 4 ° C'de şelatlı demir saklayın.
- • 7H FeSO 4 1,853 g eklenirken karıştırılırken iyonu giderilmiş damıtma suyu yaklaşık 900 ml Na2EDTA • 7.44 g 2H 2 O çözündürülmesiyle şelatlı demir (200x) makyaj, daha sonra 98-99 ° C'ye kadar bir çözüm getirmek 2 O. Terkip maddeleri, çözündüğü zaman son olarak 1 L tamamlanır. Amber içinde saklayın 4 ° C'de şişe renkli.
- Tablo 4'de olduğu gibi hisse senedi çözümleri ile P4 bazal ortamı Makyaj. Ortamda hormonlar 10 uM NAA, 4 iM BAP, 1 uM ABA, 5 mcM GA (Tablo 4 ve Tablo Spesifik Malzeme bakınız). NAA Ekleve önceki BAP otoklavda bir şınngaya bağlanmış bir 0.22 um filtre ile filtre sterilizasyonu, otoklav yaklaşık 55 ° C'ye kadar soğutulduktan sonra, ABA ve GA ekleyin. Nazik dönen ile iyice karıştırın.
- Otoklav öncesinde 1 M KOH ile pH 5.8 medyayı ayarlayın. 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav.
- Filtre sterilize ABA ve GA, ekleme ve bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine steril 9 cm Petri kapları içine medya yaklaşık 25 ml dökün otoklav sonra. Serin ve ağar kapaklı kapalı olarak ayarlamanıza olanak tanır. Sonra kapağı üzerine koymak ve kapağın üzerinde hiçbir yoğuşma olmadığından emin olun. (Kapak kondens önlemek için bir karton kutu içinde) 4 ° C'de gerekli ve mağaza gibi etiket.
- 4: 1: agar 5 orta (ağırlık% 0,8: hacim) içinde 9 cm Petri kapları P4 10 kullanın.
- Yaprak dokusu sterilizasyonu
- UV-sterilize laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine çalışın.
- Yeri önceden otoklavlanmış yay çay demlik mesh topun içine bırakır.
- Bir cul etanol:% 70 (v v) yaprakları içeren çay demliği daldırın30 saniye boyunca Ture pot.
NOT: Bu prosedürde tüm adımları kullanın 250 ml otoklavlanırlar kapak polikarbonat kültür tencere vida. - Boşaltın ve daha sonra transferi ve 1 yaprak dokusu sokmak: 8 (hac: hac) ile seyreltilmiş ağartma maddesi (% 0.5 klorin), 10 dakika boyunca karıştırılır. Zaman zaman hafifçe karıştırılır.
- Çamaşır suyu boşaltın ve steril deiyonize distile su içeren bir kültür tencerede çay demliği aktarın. Yavaşça girdap ve fazla suyu boşaltın. Steril deiyonize distile su taze kültür pot ile bir kez daha tekrarlayın.
- Steril deiyonize damıtılmış su, taze kültür kap steril forseps çay infüzyon edicinin yaprakları çıkarın. Steril kapağını tekrar ve tersini ve dönen tarafından durulayın. Eksplantlar hazırlamak için hazır olana kadar steril su üzerinde yüzen yapraklar bırakın.
- Eksplantlarındaki hazırlanması ve Kaplama
- Steril teknikleri kullanarak, bir neşter ile kenarından bireysel sterilize broşürler Döşeme ve iki ya da thr içine kalan dikdörtgen kesilmişdikdörtgen eksplantlar her eksplant (Şekil 5A) merkezinde orta damar ile (8-10 x 3-5 mm) ee.
NOT: eksplant büyüklüğü ilk Kalluslaştırma başlatılması oldukça önemlidir. Take-away gıda kapları steril kapaklarındaki kesme yürütmek. - Plaka 9 cm çapında Petri kapları (Şekil 5B) agar-katılaşmış kültür ortamında 6 eksplantlar. Her zamanki yaprak yönünü korumak için aşağı eksplantlar abaxial tarafı Plate.
- Yemeğin etrafında gergin Parafilm (Şekil 5C) ile Petri kapları mühür. Doku şimdi inkübasyon için hazırdır.
- Steril teknikleri kullanarak, bir neşter ile kenarından bireysel sterilize broşürler Döşeme ve iki ya da thr içine kalan dikdörtgen kesilmişdikdörtgen eksplantlar her eksplant (Şekil 5A) merkezinde orta damar ile (8-10 x 3-5 mm) ee.
- Doku Kuluçka
- Kültür süresi boyunca sıcaklığı kontrol edilen bir oda ya da büyüme odasında 28 ° C'de karanlıkta inkübe edin.
NOT: eksplantlar, dediferansiyonunu başlatmak hücre bölünmesi, çoğalması (kallus oluşumu) ve embriyogenez (farklılaşma) uğrayacaktır. - Farklılaştırarak expla altkültürütaze ortama 3 hafta sonra NTS. Bu altkültür bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabinede, steril paslanmaz çelik spatula ve forseps kullanılarak tüm eksplant aktarın. Kalluslu oluşur ve kallus Şekil 5C büyük bir boyutunu aşıyor gibi taze ortama alt kültüre zaman bireysel yara dokusunun% 50 transfer.
- Yaklaşık 4 hafta içinde ilk embriyoların uyun. Senkronize bir derece olsa da, 4-8 haftalık kuluçka dönemi boyunca farklı embriyo aşamalarını toplamak (Şekil 6A, B). Deneysel hedefleri doğrultusunda bir mikroskop ve işlem altında toplayın.
- Eksplantlar 3 ay boyunca embriyo üretmeye devam edeceğiz, böylece her 3 haftada bir altkültürü ve periyodik embriyolar kaldırmak.
- Kültür süresi boyunca sıcaklığı kontrol edilen bir oda ya da büyüme odasında 28 ° C'de karanlıkta inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F - Farklı embriyo aşamaları Şekil 2A gösterilmiştir ise F - Farklı embriyo aşamalarına karşılık gelen zigotik embryogenesis farklı pod yapılarda Şekil 1A gösterilmiştir. Aynı aşamada bakla seçerek, Yumurtacığa örnekleri oldukça tekdüze (Şekil 3A) elde edilebilir ki. RT-qPCR embriyoyu kullanarak belirli genler kolayca algılanır ve zaman derste 9 değerlendirilebilir. Bazı ek diseksiyon embriyo (Şekil 3B) daha da zenginleştirilmesi için izin verir. İşleme in situ hibridizasyon stratejileri kolaylıkla herhangi bir tamamlayıcı bir ışık içeren çalışmalar (Şekil 4A, B) ve elektron mikroskopisi 8 yanı sıra yapılabilir için. Bu sistemde özel değer taşıyan, hipofiz ve suspensor (Şekil 4a, b) bir açıklık olduğunu.
Somatik embriyogenesis c İçinBireysel folioles gelen ilk eksplant Utting Şekil 5A'da gösterilmiştir. Sonra, eksplantlar agar (Şekil 5B) ile yakın temas içinde eksen dışı tarafı yerleştirilir. Kallus sonra oluşum embriyolar kotiledon aşamasında (Şekil 5C) çok sayıda embriyolar vardır 3-4 hafta sonra ve 7 hafta görünmeye başlar. Ayrı safhada 4 hafta ila 7 embriyolar ile plakaları izleyerek yer alabilir (Şekil 6A, B). Farklı embriyo aşamaları kolayca gözlenir ve sadece analiz için kapalı alınabilir. Bu bilgilerin belirli türde kazanmak için oldukça hızlı bir yol olabilir. Örneğin Şekil 7 erken kotiledon aşamasında embriyolar tek MtOLEOSIN geninin türü değil, başka ifadesi gösterdi nasıl göstermektedir. Ilgilenilen genin Zaman kursları çalışmaları daha sonra zigotik veya somatik embriyolar kullanılarak incelenebilir. Somatik embriyo sisteminin özel bir avantajı, callu bu dönüşümüs GUS (β-glukuronidaz) veya floresan etiketler ile görüntülenmiştir embriyojenez farklı safhalarında, bir bütün bitki ve gen ekspresyonunu rejenere olmadan gerçekleştirilebilir. Bir örnek, Şekil 6C'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Pod morfolojisi ve embriyo gelişim aşamaları Bölmeleri ayrı aşamalarda embriyolar farklı gelişim aşamalarında.. Aşamalar 2-7 göstermiştir. (A) ve (B) aşama 2 ve 3 çok erken ve pre-küresel (C) evre 4 erken küresel (D) evre 5 Geç küresel (E) aşama 6 kalp ve (F) evre 7 Geç torpido erken vardır. Bar 2 mm'dir. Evre I çiçekli (gösterilmemiştir).
Şekil 2: Embriyo gelişim aşamaları. </ Farklı gelişim aşamalarında strong> Temizlendi embriyolar. (A) evre 3, erken pre-küresel, (B), evre 4 erken küresel, (C) evre 5 Geç küresel, (D) evre 6 kalp ve (E) aşama 7 Geç torpido. Bar 60 mm.
Şekil 3: İzole ovules evre 5 embriyolar ile ovüllerin (A) Grubu.. (B) Ovul "kanca" sonunda eksize edilebilir embriyo göstermek için standart bileşik mikroskop altında inceledi. Bar 1 mm (A) ve 200 um (B) 'dir.
Şekil 4:. Çok erken embriyo gösterisi ile erken embriyo morfolojisi (A) Bölümüovule dokulara uygun embriyo (dört hücreleri), hipofiz (gelecek dört hücreleri), suspensor (büyük vakuoller var önümüzdeki dört hücreleri) ve ilişki ing. Belirgin uyutucuya (S), erken torpido aşamalı bir embriyoya (E) ile (B) bölümü. Toluidin mavisi ile lekelenmiştir. Bar 10 um (A) ve 50 um (B) 'dir.
Şekil 5:. Somatik embriyoların üretilmesi için kültür eksplantlar (A) 'foliole eksplantlar alınır üç yapraklı yaprak gösteren. (B) eksplantlar agar üzerine kaplanmıştır. (C), 7 hafta kültürden sonra, eksplantlar üretilen somatik embriyolar. IS10 mm Bar
Şekil 6: Somatik embriyo aşamaları ve gen expressio yerini belirlemen, dönüşüm ve GUS (A). somatik embriyolar küresel (G) 'de, kalp (H) ve torpido (T) aşamalarında kullanılmıştır. (B) erken kotiledon aşamasında somatik embriyolar. (C), (D) uygun bir embriyoda MtWOX9 geni için güçlü GUS ekspresyonu gösterir Küresel safhasındaki somatik embriyo ve hipofiz (H) ve uyutucuya, (S) azalan lekeleme. Bar (A, B), 100 mm. Bar (C) 50 mikron olduğunu.
Şekil 7:. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) embriyojenik yara dokusundan embriyo eksize erken, nüve yaprağı aşamasına embriyolar OLEOSIN3 (A) ve OLEOSIN4 (B) gen ifadesi kullanılarak in vitro embriyojenez duing gen ekspresyonu. İfade görece t,o yaprağı. Standart hatalar gösterilir.
| Sahne numarası | Embriyo evresi | Pod sahne |
| Aşama 1 | Anthesis'e Çiçek | |
| Aşama 2 | Çok erken pre-küresel embriyo | Bir ya da iki spiral ile Bölme |
| Aşama 3 | Ön-küresel embriyo | Üç tam spiraller ile pod |
| Aşama 4 | Erken globüler | Beş tam spiraller ve dikenler görünmez olan Pod |
| Aşama 5 | Geç küresel | Pod genişliğini aşmayan altı spiraller ve olgunlaşmamış dikenler ile pod |
| Aşama 6 | Kalp aşaması | Pod genişliğini aşan altı spiraller ile pod ve olgunlaşan uzatılıp dikenler |
| Aşama 7 | Torpidosahne | Altı spiraller ile pod, kalın uzun dikenleri ve artan çevresi olgun |
Tablo 1: pod aşamaları hasat kriterleri tanımlanmış embriyo aşamalarına karşılık gelen pod aşamalarını tanımlamada kullanılan morfolojik kriterler..
| Çiçek Aşama 1 (S1) | Pod Aşama 2 (S2) | Pod Aşama 3 (S3) | Pod Aşama 4 (S4) | Pod Stage 5 (S5) | Pod Aşama 6 (S6) | Pod Sahne 7 (S7) | |
| Günler | 0 | 1.5-2 | 0.5-1 | 0.5 | 0.5-1 | 1 | 1-1.5 |
Pod toplama Tablo 2. Zaman kurs. T zamano önceki embriyo geliştirme aşamasında günlerde belirtti.
| Üretilen tuzlar / L | Küçük edilebilir tuzları / L | Vitaminler / L | |||
| mg | mg | mg | |||
| 3. KNO | 1875 | MnSO 4 • H2O | 10 | Miyo-inositol | 100 |
| NH 4 NO 3 | 600 | H 3 BO 3 | 3 | Tiamin HCl | 10 |
| KH 2 PO 4 | 131 | ZnSO 4 • 7H 2 O | 2 | Nikotinik asit | 1 |
| KCL | 225 | <td> KI0.75 | Piridoksin HCl | 1 | |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 225 | Na 2 MoO 4 • 2H 2 O | 0.25 | ||
| Ayrı Kalsiyum | CuSO 4 • 5H 2 O | 0.025 | |||
| CaCl2 • 2H 2 O | 300 | CoCl2 • 6H 2 O | 0.025 | ||
| Şelatlı demir ayrı | |||||
| FeSO 4 • 7H 2 O | 9,267 | ||||
| Na2EDTA • 2H 2 O | 37.2 | ||||
Tablo 3: P4 Orta P4 ortamı bileşenleri..
| Bileşen | Tutar / L |
| 10 x ana tuzlan | 100 mi |
| 100 x Kalsiyum | 10 mi |
| 1000 x minör tuzlarını | 1 mi |
| 200 x demir | 5 mi |
| 100 x asitler kasamino | 10 mi |
| 1000 x vitaminler | 1 mi |
| Sakaroz | 30 g |
| Agar | 8 g |
| Hormonlar | |
| 1.000 uM NAA | 10 mi |
| 1.000 uM BAP | 4 mi |
| 1.000 uM ABA | 1 mi | </ Tr>
| 1.000 uM GA | 5 mi |
Tablo 4:. Hormonları ile P4 orta yukarı yapma stok çözümleri hormonlar P4 orta kadar yapma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
açıklanan protokoller oldukça yalındır ve tüm çağdaş hücre ve moleküler teknikler ile baklagil embriyogenezde soruşturma izin verir. Bu avantaj ve in vivo ve in vitro yaklaşımlar hem de dezavantajları vardır tanır. Hem olgunlaşmamış tohumlar 19 kültürüne göre erken embriyogenez daha fazla odaklanmak sağlar.
In vivo çalışmalarda durumunda neler açıklanan ağırlıklı birçok embriyo çalışmaları için uygundur bölmesinden ovülde izolasyonu olduğunu. Ayrıca "kanca" alanına (Şekil 3B) kapalı dilimleme embriyo doku için zenginleştirmek için elbette mümkündür. Bu de avantajlı ovüller yararlanarak, bitişik dokuya bağlı değil gibi diseksiyon sırasında embriyonun genellikle kaybolur embriyo gelişiminin en erken evre izole etmek güçtür. Çiçek etiketleme pod morfolojisi ortadan kaldırır kullanma ve bir zaman c sahipHer çiçek için ourse rejim. Ortam çok sıkı kontrol sürece ek olarak potansiyel değişkenlik gelişimsel zamanlama yöntemleri vardır. O pod oluşum stres koşullarında oluşmaz, böylece optimum bitki büyümesi önemlidir. Pod gelişimi aşina ol ve hafif ayarlamaları belirli embriyo geliştirme aşamalarını maç morfolojik aşamalarını tanımlamak için yapılabilir.
Somatik embriyojenez durumunda, bu embriyolar bir zigot gelen eşeysiz olup türetilen kabul edilmesi gerekir. Ayrıca, beslenme kaynağı zigotik embriyo farklıdır. Somatik embriyo durumunda, kültür ortamı ve çevresindeki kalus ve zigotik embriyo durumda, endosperm olan. Bu suspensor çok daha iyi zigotik embriyo halinde geliştirilmiştir anlamına gelir (Şekil 4a, b). M. özel değeri truncatula sistemi dışı dört hormon yanıt olarak embriyo çok sayıdakiE rejimi. Çok sayıda sonra hormonlar ve orta onların eklenmesini oluşturan ayrıntılarını kontrol meydana yoksa kontrol edilmelidir. Zarar vermeden eksplant dokusunun herhangi bir kültür metodolojisi sterilite gibi (etanol ve bu bir sorun olup olmadığını hipoklorit sterilizasyon süreleri zamanlaması küçük ayarlamalar yapmak) Tüm hazırlayıcı adımları sırasında sterilite korumak özenle bir araya önemlidir.
Ne bulduk in vivo ve in vitro işlemlerde güzelleştirmek için önemli olmasıdır. Kendi çalışmalardan bir örnek etilen tepki transkripsiyon faktörü geni olan transkripsiyon faktörü MtSERF1 (somatik embriyo İLGİLİ FAKTÖR 1) incelenmesidir. MtSERF1 ilk RNAi, hızlandırıcı-GUS füzyonu ve in situ hibridizasyonlar kullanılarak somatik embriyolar tespit edilmiştir; ve zigotik embriyojenez 20 olarak ifade gösterilmiştir.
baklagil embriyogenezde çalışma saat önemlidirUman beslenme ve M. kullanarak truncatula bu alanda artırabilir artık hücresel ve moleküler teknolojiler ile birlikte embriyolar. Insight embriyo boyutu ve dolayısıyla verimi gerekli karbohidrat, yağ ve protein bileşimi ile birlikte optimize edilebilir içine nasıl elde edilebilir. Bu belirleyici ölçüde erken embriyogenez 8,9 tren ayarlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
