Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मॉडल फली में जल्दी भ्रूण के विकास के नियमन के अध्ययन के लिए युग्मज और दैहिक भ्रूणों प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल Published: June 9, 2015 doi: 10.3791/52635
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia

Abstract

एक एकल कोशिका युग्मनज से शुरू जल्दी embryogenesis तेजी से कोशिका विभाजन और morphogenesis के माध्यम से चला जाता है, और आकृति विज्ञान के पूर्व गोलाकार, गोलाकार, हृदय, टारपीडो और अंकुर चरणों की विशेषता है। यह क्रमिक विकास एक जटिल आणविक नेटवर्क की तंग विनियमन के अधीन है। विकास के एक समान स्तर पर पर्याप्त जल्दी भ्रूण कटाई जल्दी embryogenesis के सेलुलर और आणविक विनियमन की जांच के लिए आवश्यक है। Medicago के लिए उदाहरण के 8 दिन जल्दी अंकुर चरण तक पहुंचने के लिए truncatula जबकि जल्दी embryogenesis एक संक्षेप में तेजी morphogenesis से होकर गुजरती है के बाद से यह स्पष्ट नहीं है। यहाँ, हम दोनों के दृष्टिकोण से मुद्दे के समाधान। पहले एक युग्मज भ्रूण के मंच से संकेत मिलता है की मदद करने में भ्रूण के विकास और फली आकृति विज्ञान के बीच एक संबंध स्थापित करता है। यह विशेष रूप से फली बढ़ता और कांटा के विकास की संख्या पर आधारित है। इन विवो के पूरक करने के लिए एक वैकल्पिक तरीकाtudies दैहिक भ्रूण का निर्माण करने के संवर्धन पत्ती explants के माध्यम से होता है। मध्यम एक असामान्य हार्मोन संयोजन शामिल है - एक auxin (1-naphthaleneacetic एसिड), एक cytokinin (6 benzylaminopurine), abscisic एसिड और gibberellic एसिड। विभिन्न चरणों विच्छेदन के बिना घट्टा के बाहर से बढ़ पहचाना जा सकता है।

Introduction

काटा क्षेत्र और कुल उत्पादन 1 में अनाज के लिए दूसरा फलियां लगभग 20,000 प्रजातियों और Leguminosae (या Fabaceae) परिवार के साथ उच्च पौधों का तीसरा सबसे बड़ा परिवार हैं। सोयाबीन की खेती की तीसरी सबसे बड़ी फसल है। अनाज फलियां आहार प्रोटीन का एक-तिहाई और मानव उपभोग के लिए 2 वनस्पति तेल का एक तिहाई के बारे में प्रदान करते हैं। उनके 2 एन फिक्सिंग क्षमता के साथ फलियां भी इसके बीज की बीजपत्र में सोयाबीन, दुकानों प्रोटीन और तेल की तरह,। टिकाऊ कृषि प्रणालियों को Medicago truncatula योगदान और काफी आनुवंशिक और जीनोमिक संसाधनों 3,4 के साथ एक आनुवंशिक और जीनोमिक फली मॉडल है। एम जबकि truncatula यह तेजी से फली के बीज जीव विज्ञान 5-7 और embryogenesis 8,9 अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है फली-र्हिज़ोबियम सहजीवन 4 को समझने के क्षेत्र में प्रगति के लिए सक्षम है। एराबिडोप्सिस embryogenesis के बड़े पैमाने पर 10,11 का अध्ययन किया, लेकिन यह मैं कर दिया गया हैSA गैर-फली और embryogenesis के विवरण Medicago 8,10 करने के लिए समान नहीं हैं। एम में युग्मज embryogenesis truncatula एक विशिष्ट बहुकोशिकीय hypophysis, एक endoployploid suspensor और बेसल स्थानांतरण सेल 8 के साथ, दिलचस्प सुविधाओं है।

दैहिक embryogenesis (एसई) आमतौर पर पौधों 12 regenerating के लिए प्रयोग किया जाता है। फली मॉडल एम में truncatula, माता पिता Jemalong से विकसित किया गया है बीज लाइन Jemalong 2HA (2HA) दैहिक embryogenesis 13 की उच्च दर है। उत्पादित भ्रूण की संख्या हाल ही में स्वतंत्र लंबे समय की स्थापना मध्यम से 14 दोनों gibberellic एसिड (जीए) और abscisic एसिड (ए.बी.ए.) जोड़कर बढ़ा दी गई है। जीए और ए.बी.ए. आमतौर पर विरोधी 14 में कार्य दिया है कि जो असामान्य है synergistically के इस मामले जीए और ए.बी.ए. अधिनियम में। घट्टा से उत्पादित भ्रूण embryogenesis के चरण आसानी से visuall निर्धारित करने की अनुमति देता है, जो सतह पर विकसितY और आसानी से काटा। दैहिक embryogenesis की जांच (Jemalong) (2HA) embryogenic और गैर embryogenic हैं कि isogenic लाइनों के पास की सुविधा होने और vivo में और विभिन्न प्रयोगात्मक संभावनाएं प्रदान करता है इन विट्रो प्रणालियों में दोनों कर रही है।

भ्रूण के विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना समझ बीज और संयंत्र के विकास के लिए आवश्यक है। फलियां में, अन्य dicotyledons में के रूप में, यह मानव पोषण के लिए उपयोग किया जाता है कि उत्पादों की दुकान है कि भ्रूण के बीजपत्र है। जल्दी embryogenesis तेजी से कोशिका विभाजन, और सही भ्रूण patterning के शामिल है। लगभग 8 दिनों के निषेचन के बाद, एम में truncatula भ्रूण जल्दी अंकुर चरणों तक पहुँचता है। रूपात्मक लक्षण वर्णन बिल्कुल Glasshouse परिस्थितियों में निषेचन के बाद दिन के द्वारा संकेत नहीं है। इस प्रकार, विकासशील भ्रूण के मंच से संकेत मिलता है एक कुशल मानकीकृत दृष्टिकोण आनुवंशिक regul का अध्ययन करने में मूल्यवान हैजल्दी युग्मज embryogenesis की समझना।

इस पत्र में, हम फली मॉडल एम में embryogenesis के जैविक अध्ययन के लिए विकासशील भ्रूण एकत्र करने के लिए दो मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान truncatula। पहले एक दूसरे को आसानी से पहुँचा बड़े भ्रूण संख्या प्रदान करने के लिए संवर्धन पत्ती explants के माध्यम से दैहिक embryogenesis है, जबकि embryogenesis और फली आकृति विज्ञान जोड़ से युग्मज भ्रूण एकत्र करने के लिए है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. युग्मज भ्रूण के विकास

  1. संयंत्र की सामग्री
    1. बढ़ो Medicago एक एक 14 घंटा photoperiod साथ Glasshouse और 23 डिग्री सेल्सियस / 19 डिग्री सेल्सियस दिन / रात के तापमान में जंगली प्रकार Jemalong या अत्यधिक फिर से generable अपने पास isogenic, (2HA के रूप में जाना जाता है) जीनोटाइप Jemalong 2HA 13 truncatula।
      1. पानी है कि बीज भरिये और रात भर पानी में भिगोना करने के लिए अनुमति दी है ताकि बीज बुवाई करने से पहले पियर्स (एक 23 जी सुई के साथ) बीज कोट की सतह। पूरी तरह से बीज को कवर करने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें।
      2. Potting के मिश्रण में प्रत्येक 15 सेमी व्यास के बर्तन में 3 बीज बोना (10 बर्तन की कुल) (मोटे रेत, perlite, कॉयर-पीट (1: 1: 1) प्लस Osmocote सटीक मानक के 5 ग्राम: धीमी गति से जारी उर्वरक) और स्थानांतरण Glasshouse। संयंत्र पर चढ़ने के लिए उपजा के लिए बर्तन और चारों ओर प्रति 1 संयंत्र एक जाली से है तो वहाँ अंकुरण के बाद स्वास्थ्यप्रद अंकुर को बनाये रखें।
  2. फसल काटने वाले फली
    1. W से फली लीजिएJemalong या 2HA उपयुक्त जल्दी भ्रूण चरणों प्राप्त करने के लिए आईएलडी प्रकार के रूप में पहले 9 वर्णित है।
      नोट: विभिन्न फली चरणों चित्र 1 में दिखाया जाता है और इसी भ्रूण चरणों चित्रा 2 में दिखाया जाता है।
    2. अलग चरणों के 6 और 7 (तालिका 2) मदद करने के लिए स्टेज 6 से गुजरे समय। 1 टेबल के अनुसार मापदंड का उपयोग कर फसल में फली अलग चरणों की जाँच करें उपाय।
  3. फली से बीजाणु विदारक और भ्रूण चरण की जाँच
    1. आवश्यक के रूप में अकेले ठीक संदंश का उपयोग फली या एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप और संदंश से बीजाणु पृथक। यदि आवश्यक हो भ्रूण अवस्था जल्दी से एक मानक यौगिक सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 3 बी) का उपयोग कर जाँच की जा सकती।
    2. अरबी 7.5 जी गोंद, 100 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट, 5 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, आसुत जल विआयनीकृत 60 मिलीग्राम से युक्त होयर के समाधान संशोधित तैयार करते हैं। 3-5 घंटे या रात भर के लिए सरगर्मी से भंग।
    3. अधिक परिष्कृत के लिएडी माइक्रोस्कोपी संशोधित होयर के समाधान 15,16 में विच्छेदित बीजाणु साफ है। ध्यान से स्पष्ट जब तक कमरे के तापमान पर (बीजाणु कवर करने के लिए पर्याप्त) होयर के समाधान की एक छोटी मात्रा में बरकरार बीजाणु और जगह लेने के लिए।
    4. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) प्रकाशिकी के साथ नमूने देखें। एक डिजिटल कैमरा 9 (चित्रा 2) iwth छवियों पर कब्जा।
    5. फली के मध्य क्षेत्र से सबसे वर्दी बीजाणु प्राप्त करें और अपेक्षित संख्या संचित। एक उदाहरण चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक तापमान पर बर्फ और दुकान पर बीजाणु (-80 डिग्री सेल्सियस के लिए न्यूक्लिक एसिड) ले लीजिए।
      नोट: histological वर्गों का विश्लेषण, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पर जानकारी के लिए, और स्वस्थानी संकरण में कागजात 8,9 देखें।

इन विट्रो में 2. दैहिक भ्रूण के विकास

  1. एक एम का प्रयोग करें truncatula किस्म टीटोपी आसानी से संस्कृति में भ्रूण के रूप में सक्षम है। पत्ती explants के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए 2-4 महीने पुरानी हैं कि 2HA पौधों 13,17 का उपयोग करें।
  2. एक elongating स्टेम के नवीनतम लगभग पूरी तरह से विस्तार trifoliate पत्ती से पत्रक ले लो।
  3. निर्जलीकरण से बचने के लिए एक संस्कृति बर्तन में नम कागज ताड़ना पर trifoliate पत्तियों रखें।
    नोट: trifoliate पत्तियों खेती कर रहे हैं एक बार वे कम से कम देरी के साथ उपयोग करने की आवश्यकता है।
  4. संस्कृति के माध्यम से तैयारी
    1. 4: 1: अगर में 5 मध्यम (डब्ल्यू 0.8%: V) में 9 सेमी पेट्री डिश पी 4 10 का प्रयोग करें।
      नोट: पी 4 10: 4: 1: 5 मध्यम पी 4 बेसल मध्यम 18 प्लस 10 माइक्रोन 1-naphthaleneacetic एसिड (NAA), 4 माइक्रोन 6-benzylaminopurine (BAP), 1 माइक्रोन abscisic एसिड (ए.बी.ए.) और 5 माइक्रोन gibberellic के होते हैं एसिड (जीए)। जीए + ए.बी.ए. का उपयोग भ्रूण गठन accelerates और भ्रूण संख्या 14 में मूल बढ़ जाती है का कारण बनता है।
    2. 1 एल में पी 4 बेसल मध्यम करें; (calciu बनाने के प्रमुख लवण से मिलकर,) अलग से मीटर नाबालिग लवण और विटामिन (3 टेबल), chelated लोहा (अलग से श्रृंगार), casamino एसिड (कैसिइन hydrolyzate), 30 ग्राम सुक्रोज, 8 ग्राम अगर।
    3. उपयुक्त aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रमुख लवण, कैल्शियम, casamino एसिड, नाबालिग लवण और विटामिन के स्टोर स्टॉक समाधान। 4 डिग्री सेल्सियस पर chelated लोहे की दुकान।
    4. • 7H FeSO 4 की 1.853 जी को जोड़ते समय सरगर्मी जबकि विआयनीकृत आसुत जल के लगभग 900 मिलीलीटर में 2 ना EDTA • के 7.44 छ 2H 2 हे भंग करके chelated लोहा (200x) बना है, तो 98-99 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान लाने के 2 ओ सामग्री भंग कर रहे हैं जब अंत में 1 एल अप करने के लिए बनाते हैं। एम्बर में स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर बोतलें रंग का।
    5. तालिका 4 में के रूप में शेयर समाधान के साथ पी 4 बेसल मध्यम अप करें। माध्यम में हार्मोन हैं 10 माइक्रोन NAA, 4 माइक्रोन BAP, 1 माइक्रोन ए.बी.ए., 5 माइक्रोन जीए (तालिका 4 और विशिष्ट सामग्री तालिका देखें)। NAA जोड़ेंऔर पूर्व BAP autoclaving और एक सिरिंज से जुड़ी 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ फिल्टर नसबंदी का उपयोग कर, autoclaving और के बारे में 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद ए.बी.ए. और जीए जोड़ने के लिए। कोमल घूमता द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. वाष्पदावी करने से पहले 1 एम KOH के साथ पीएच 5.8 करने के लिए मीडिया को समायोजित करें। 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव।
    7. फिल्टर निष्फल ए.बी.ए. और जीए, जोड़ सकते हैं और एक लामिना का प्रवाह हुड या Biohazard कैबिनेट में बाँझ 9 सेमी पेट्री डिश में मीडिया के लगभग 25 मिलीलीटर डालना autoclaving के बाद। कूल और अगर ढक्कन के साथ बंद सेट। तब ढक्कन पर रख दिया और ढक्कन पर कोई घनीभूत होती है सुनिश्चित करें। (ढक्कन घनीभूत को रोकने के लिए एक गत्ता बॉक्स में) 4 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक और दुकान के रूप में लेबल।
  5. पत्ता ऊतक की नसबंदी
    1. एक यूवी निष्फल लामिना का प्रवाह हुड या Biohazard कैबिनेट में कार्य करें।
    2. नौकरी का पहले से autoclaved वसंत चाय infuser के जाल गेंद में छोड़ देता है।
    3. एक संस्कृति में इथेनॉल: 70% में (V v) पत्तियों से युक्त चाय infuser विसर्जित30 सेकंड के लिए संरचना बर्तन।
      नोट: इस प्रक्रिया में सभी चरणों का उपयोग के लिए 250 मिलीलीटर autoclaved रहे हैं कि टोपी पॉली कार्बोनेट संस्कृति बर्तन पेंच।
    4. नाली और फिर हस्तांतरण और 1 में पत्ता ऊतक विसर्जित: 8 (V: V) पतला ब्लीच (0.5% क्लोरीन) 10 मिनट के लिए। समय-समय पर धीरे भंवर।
    5. ब्लीच नाली और बाँझ विआयनीकृत आसुत जल से युक्त एक संस्कृति बर्तन में चाय infuser हस्तांतरण। धीरे घुमाना और अतिरिक्त पानी के निकास। बाँझ विआयनीकृत आसुत पानी की एक ताजा संस्कृति के बर्तन के साथ एक और बार दोहराएँ।
    6. बाँझ विआयनीकृत आसुत पानी की एक ताजा संस्कृति पॉट करने के लिए बाँझ संदंश के साथ चाय infuser से पत्ते निकालें। बाँझ टोपी पर पेंच और inverting और घूमता से कुल्ला। Explants तैयार करने के लिए तैयार है जब तक बाँझ पानी पर तैर पत्ते छोड़ दें।
  6. Explants की तैयारी और चढ़ाना
    1. बाँझ तकनीकों का प्रयोग, एक स्केलपेल के साथ किनारे से व्यक्तिगत निष्फल पत्रक ट्रिम, और दो या thr में शेष आयत में कटौतीआयताकार explants के प्रत्येक explant (चित्रा 5 ए) के केंद्र में मध्य शिरा के साथ (8-10 एक्स 3-5 मिमी) ee।
      नोट: explant के आकार पहले callusing की शुरुआत में काफी महत्वपूर्ण है। दूर ले खाद्य कंटेनर से बाँझ lids पर काटने बाहर ले।
    2. प्लेट 9 सेमी व्यास पेट्री डिश (चित्रा 5 ब) में अगर-जम संस्कृति के माध्यम पर 6 explants। हमेशा की पत्ती अभिविन्यास बनाए रखने के लिए नीचे explants abaxial पक्ष थाली।
    3. डिश चारों ओर फैला Parafilm (चित्रा 5C) के साथ पेट्री डिश सील। ऊतक अब ऊष्मायन के लिए तैयार है।
  7. ऊतक ऊष्मायन
    1. संस्कृति अवधि के दौरान एक नियंत्रित तापमान कमरे या विकास कैबिनेट में 28 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में प्लेटें सेते हैं।
      नोट: explants, dedifferentiation आरंभ कोशिका विभाजन, प्रसार (घट्टा गठन) और embryogenesis (भेदभाव) से गुजरना होगा।
    2. फर्क expla उपसंस्कृतिताजा मध्यम करने पर 3 हफ्तों के बाद एनटीएस। इस उप-संस्कृति में एक लामिना का प्रवाह हुड या एक biohazard कैबिनेट में, एक बाँझ स्टेनलेस स्टील रंग और संदंश का उपयोग पूरे explant हस्तांतरण। Callusing होता है और घट्टा चित्रा 5C में सबसे बड़ा एक के आकार से अधिक के रूप में नए सिरे से मध्यम करने के लिए subculturing है, जब व्यक्ति घट्टा के 50% के हस्तांतरण।
    3. के बारे में 4 हफ्तों में पहली भ्रूण को ध्यान से देखें। Synchrony के एक डिग्री नहीं है, एक 4-8 सप्ताह ऊष्मायन अवधि में विभिन्न भ्रूण चरणों इकट्ठा (चित्रा 6A, बी)। प्रायोगिक उद्देश्यों के अनुसार एक विदारक माइक्रोस्कोप और प्रक्रिया के तहत लीजिए।
    4. Explants के 3 महीने के लिए भ्रूण का उत्पादन जारी रहेगा तो यह है कि हर 3 सप्ताह उपसंस्कृति और समय-समय पर भ्रूण को हटा दें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एफ - अलग भ्रूण चरणों 2A चित्रा में दिखाए जाते हैं, जबकि एफ - अलग भ्रूण चरणों के लिए इसी युग्मज embryogenesis के विभिन्न फली संरचनाओं के लिए चित्रा 1 ए में दिखाया जाता है। एक ही चरण में फली का चयन करके, बीजाणु के नमूने काफी वर्दी (चित्रा 3) प्राप्त की जा सकती हैं। आर टी-qPCR के भ्रूण का उपयोग करके विशिष्ट जीन आसानी से पता लगाया है और समय के पाठ्यक्रम के अध्ययन के 9 का मूल्यांकन किया जा सकता है। कुछ अतिरिक्त विच्छेदन भ्रूण (3B चित्रा) के आगे संवर्धन के लिए अनुमति देगा। प्रसंस्करण बगल में संकरण रणनीतियों आसानी से किसी भी पूरक प्रकाश शामिल अध्ययन (चित्रा -4 ए, बी) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में 8 के रूप में अच्छी तरह से बाहर किया जा सकता है। इस प्रणाली में विशेष मूल्य के hypophysis और suspensor (चित्रा -4 ए, बी) की विशिष्टता है।

दैहिक embryogenesis ग के लिएव्यक्तिगत folioles से प्रारंभिक explant के utting चित्रा 5 ए में दिखाया गया है। explants तो अगर (चित्रा 5 ब) के साथ निकट संपर्क में abaxial तरफ ऊपर रखा जाता है। घट्टा के बाद गठन भ्रूण अंकुर चरण (चित्रा 5C) में कई भ्रूण कर रहे हैं 3-4 सप्ताह के बाद और 7 सप्ताह से प्रदर्शित करने के लिए शुरू करते हैं। असतत चरणों में 4 हफ्तों और 7 के बीच भ्रूण के माध्यम से प्लेटों का अनुसरण करके ढूँढा जा सकता है (चित्रा 6A, बी)। अलग भ्रूण चरणों आसानी से मनाया जाता है और बस के विश्लेषण के लिए उठाया जा सकता है। इस जानकारी के कुछ प्रकार हासिल करने के लिए काफी एक त्वरित तरीका हो सकता है। उदाहरण के लिए यह आंकड़ा 7 जल्दी अंकुर चरण में भ्रूण एक MtOLEOSIN जीन के प्रकार के नहीं, बल्कि दूसरे की अभिव्यक्ति से पता चला है कि कैसे दिखाता है। ब्याज की जीन के समय पाठ्यक्रम के अध्ययन तो युग्मज या दैहिक भ्रूण का उपयोग कर जांच की जा सकती। दैहिक भ्रूण प्रणाली का एक विशेष लाभ callu की है कि परिवर्तन हैएस गस (β-glucuronidase) या फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग कल्पना embryogenesis के विभिन्न चरणों में एक पूरे संयंत्र और जीन अभिव्यक्ति regenerating के बिना किया जा सकता है। एक उदाहरण चित्रा 6C में दिखाया गया है।

चित्र 1
चित्रा 1: फली आकृति विज्ञान और भ्रूण विकास के चरणों फली असतत चरणों में भ्रूण के साथ विकास के विभिन्न चरणों में।। चरणों 2-7 संकेत दिया। (ए) और (बी) के चरणों में 2 और 3 बहुत जल्दी और पूर्व गोलाकार (सी) स्टेज 4 जल्दी गोलाकार (डी) 5 चरण देर गोलाकार (ई) स्टेज 6 दिल और (च) चरण 7 देर टारपीडो जल्दी कर रहे हैं। बार 2 मिमी है। मैं स्टेज फूल है () नहीं दिखाया।

चित्र 2
चित्रा 2: भ्रूण के विकास के चरणों। </ विभिन्न विकास के चरणों में मजबूत> मंजूरी भ्रूण। (ए) 3 चरण जल्दी पूर्व गोलाकार, (बी) के स्टेज 4 जल्दी गोलाकार, (सी) चरण 5 देर गोलाकार, (डी) स्टेज 6 दिल, और (ई) चरण 7 देर टारपीडो। बार 60 माइक्रोन है।

चित्र तीन
चित्रा 3: पृथक बीजाणु चरण 5 भ्रूण के साथ बीजाणु (ए) समूह।। (बी) बीजांड "हुक" अंत में excised किया जा सकता है, जो भ्रूण को दिखाने के लिए मानक यौगिक खुर्दबीन के नीचे देखा। बार 1 मिमी (ए) और 200 माइक्रोन (बी) है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। बहुत जल्दी भ्रूण शो के माध्यम से जल्दी भ्रूण की आकृति विज्ञान (ए) धाराबीजाणु ऊतकों को उचित भ्रूण (चार कोशिकाओं), hypophysis (अगले चार कोशिकाओं), suspensor (बड़े रिक्तिकाएं है जो अगले चार कोशिकाओं) और रिश्ते हैैं। प्रमुख suspensor (एस) के साथ जल्दी टारपीडो चरण भ्रूण (ई) के माध्यम से (बी) की धारा। Toluidine नीले रंग के साथ दाग। बार 10 माइक्रोन (ए) और 50 माइक्रोन (बी) है।

चित्रा 5
चित्रा 5:। दैहिक भ्रूण का निर्माण करने के explants के संवर्धन (ए) foliole से explants लिया जाता है, जहां Trifoliate पत्ती दिखा। (बी) Explants अगर पर चढ़ाया। (सी) 7 सप्ताह संस्कृति के बाद explants से उत्पादित दैहिक भ्रूणों। IS10 मिमी बार

चित्रा 6
चित्रा 6: दैहिक भ्रूण चरणों और जीन expressio के स्थान की पहचानएन परिवर्तन और गस। (ए) दैहिक भ्रूण गोलाकार (जी) में, दिल (एच) और टारपीडो (टी) के चरणों का उपयोग कर। (बी) के जल्दी अंकुर चरण में दैहिक भ्रूणों। (सी) (ई) उचित भ्रूण में MtWOX9 जीन के लिए मजबूत गस अभिव्यक्ति दिखा गोलाकार चरण दैहिक भ्रूण और hypophysis (एच) और suspensor (एस) में घटते धुंधला हो जाना। बार (ए, बी) 100 माइक्रोन है। बार (सी) 50 माइक्रोन है।

चित्रा 7
चित्रा 7:। मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) embryogenic घट्टा से भ्रूण से excised जल्दी अंकुर चरण भ्रूण में OLEOSIN3 (ए) और OLEOSIN4 (बी) के जीन की अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए इन विट्रो में embryogenesis duing जीन अभिव्यक्ति। अभिव्यक्ति रिश्तेदार टी हैओ पत्ती। मानक त्रुटियों का संकेत दिया।

स्टेज नंबर भ्रूण अवस्था फली मंच
प्रथम चरण Anthesis पर फूल
चरण 2 बहुत जल्दी पूर्व गोलाकार भ्रूण एक या दो बढ़ता साथ फली
स्टेज 3 जल्दी पूर्व गोलाकार भ्रूण तीन पूर्ण बढ़ता साथ फली
स्टेज 4 प्रारंभिक गोलाकार पांच पूरा बढ़ता और कांटा दिखाई नहीं के साथ फली
स्टेज 5 देर गोलाकार फली चौड़ाई से अधिक नहीं छह बढ़ता है और अपरिपक्व कांटा के साथ फली
स्टेज 6 हार्ट मंच फली चौड़ाई से अधिक छह बढ़ता साथ फली और परिपक्व लम्बी कांटा
स्टेज 7 टारपीडोमंच छह बढ़ता साथ फली, मोटा अब कांटा और वृद्धि की परिधि परिपक्व

तालिका 1: फली चरणों की फसल के लिए मापदंड परिभाषित भ्रूण चरणों के लिए इसी फली चरणों की पहचान करने में इस्तेमाल के morphological मापदंड।।

फूल चरण 1 (एस 1) फली स्टेज 2 (एस 2) फली स्टेज 3 (S3) फली स्टेज 4 (S4) फली स्टेज 5 (S5) फली स्टेज 6 (S6) फली स्टेज 7 (एस 7)
दिन 0 1.5-2 0.5-1 0.5 0.5-1 1 1-1.5

फली संग्रह के लिए तालिका 2 टाइम कोर्स। टी से समयवह पिछले भ्रूण के विकास के चरण के दिनों में संकेत दिया।

<टीडी> केआई
मेजर लवण / एल माइनर लवण / एल विटामिन / एल
मिलीग्राम मिलीग्राम मिलीग्राम
3 kno 1875 MnSO 4 • एच 2 ओ 10 म्यो-Inositol 100
एनएच 4 कोई 3 600 एच 3 बो 3 3 Thiamine एचसीएल 10
के.एच. 2 पीओ 4 131 ZnSO 4 • 7H 2 हे 2 निकोटिनिक एसिड 1
KCL 225 0.75 Pyridoxine एचसीएल 1
MgSO 4 • 7H 2 हे 225 2 ना मू 4 • 2H 2 हे 0.25
अलग कैल्शियम CuSO 4 • 5H 2 हे 0.025
2 CaCl • 2H 2 हे 300 CoCl 2 • 6H 2 हे 0.025
Chelated लोहा अलग
FeSO 4 • 7H 2 हे 9.267
ना 2 EDTA • 2H 2 हे 37.2

तालिका 3: पी 4 मध्यम पी 4 मध्यम के घटकों।।

<Tr />
अवयव राशि / एल
10 एक्स प्रमुख लवण 100 मिलीलीटर
100 X कैल्शियम 10 मिलीलीटर
1,000 एक्स नाबालिग लवण 1 मिलीलीटर
200 X लोहा 5 मिलीलीटर
100 X एसिड casamino 10 मिलीलीटर
1,000 एक्स विटामिन 1 मिलीलीटर
सुक्रोज 30 ग्राम
अग्रवाल जी 8
हार्मोन
1,000 माइक्रोन NAA 10 मिलीलीटर
1,000 माइक्रोन BAP 4 मिलीलीटर
1,000 माइक्रोन ए.बी.ए. 1 मिलीलीटर
1,000 माइक्रोन जीए 5 मिलीलीटर

सारणी 4:। हार्मोन के साथ पी 4 मध्यम बना शेयर समाधान से हार्मोन के साथ पी 4 मध्यम ऊपर बना रहे हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सीधे आगे रहे हैं और सभी समकालीन सेल और आणविक तकनीक के साथ फली embryogenesis की जांच की अनुमति देते हैं। हम फायदे और vivo में इन विट्रो दृष्टिकोण में दोनों का नुकसान कर रहे हैं कि पहचान। दोनों अपरिपक्व बीज 19 की संस्कृति की तुलना में जल्दी embryogenesis पर अधिक ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देते हैं।

इन विवो पढ़ाई के मामले में क्या वर्णन किया गया है मुख्य रूप से कई भ्रूण के अध्ययन के लिए उपयुक्त है जो फली से बीजाणु के अलगाव है। यह आगे "हुक" क्षेत्र (3B चित्रा) बंद करने की क्रिया द्वारा भ्रूण ऊतक के लिए समृद्ध करने के लिए बिल्कुल संभव है। यह अच्छी तरह से फायदेमंद बीजाणु का इस्तेमाल कर रही है, आसन्न ऊतक से जुड़ी नहीं है के रूप में disection दौरान भ्रूण अक्सर खो दिया है के रूप में भ्रूण के विकास की बहुत जल्द से जल्द चरण को अलग करना मुश्किल है। फूलों की टैगिंग फली आकृति विज्ञान समाप्त का उपयोग करना और एक समय सी होनेएक फूल के लिए ourse शासन। वातावरण बहुत कसकर नियंत्रित किया जाता है, जब तक कि इसके अलावा संभावित परिवर्तनशीलता विकासात्मक समय के तरीकों में है। कि फली गठन तनाव की शर्तों के तहत नहीं होती है इसलिए इष्टतम संयंत्र के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। फली विकास के साथ परिचित हो और मामूली समायोजन विशिष्ट भ्रूण विकास के चरणों से मिलान करने के रूपात्मक चरणों को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है।

दैहिक embryogenesis के मामले में, यह भ्रूण एक युग्मनज से अलैंगिक और नहीं प्राप्त कर रहे हैं कि मान्यता प्राप्त हो गया है। इसके अलावा, पोषण स्रोत युग्मज भ्रूण को अलग है। दैहिक भ्रूण के मामले में, यह संस्कृति के माध्यम से और आसपास के घट्टा है, और युग्मज भ्रूण के मामले में यह एण्डोस्पर्म है। इस suspensor ज्यादा बेहतर युग्मज भ्रूण के मामले में विकसित किया गया है इसका मतलब है (चित्रा -4 ए, बी)। एम का विशेष महत्व truncatula प्रणाली असामान्य चार Hormon के जवाब में भ्रूण की बड़ी संख्या हैई शासन। बड़ी संख्या में तो हार्मोन और मध्यम करने के लिए उनके अलावा ऊपर बनाने के विवरण की जाँच नहीं होती है, तो जाँच की जानी चाहिए। क्षति के बिना explant ऊतक के किसी भी संस्कृति कार्यप्रणाली बाँझपन साथ के रूप में (इथेनॉल और यह एक समस्या है अगर हाइपोक्लोराइट नसबंदी टाइम्स के समय से छोटे समायोजन करना) सभी प्रारंभिक चरणों के दौरान बाँझपन बनाए रखने में देखभाल के साथ साथ महत्वपूर्ण है।

क्या हमने पाया है कि यह vivo में इन विट्रो प्रक्रियाओं में पूरक करने के लिए मूल्यवान है। अपने स्वयं के अध्ययन से एक उदाहरण के एक इथाइलीन प्रतिक्रिया प्रतिलेखन कारक जीन है जो प्रतिलेखन कारक MtSERF1 (दैहिक भ्रूण से संबंधित कारक 1) की जांच है। MtSERF1 पहले आरएनएआई, प्रवर्तक-गस fusions और में सीटू hybridisations का उपयोग कर दैहिक भ्रूण में पता चला था; और फिर युग्मज embryogenesis के 20 में व्यक्त किया जा करने के लिए दिखाया गया है।

फली embryogenesis के अध्ययन घंटे के लिए महत्वपूर्ण हैउमान पोषण, और एम का उपयोग कर truncatula इस क्षेत्र में वृद्धि कर सकते अब उपलब्ध सेलुलर और आणविक प्रौद्योगिकियों के साथ मिलकर भ्रूण। इनसाइट भ्रूण आकार और इसलिए उपज आवश्यक कार्बोहाइड्रेट, तेल और प्रोटीन संरचना के साथ एक साथ अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे में प्राप्त किया जा सकता है। ये निर्धारकों मोटे तौर पर जल्दी embryogenesis 8,9 गाड़ी में स्थापित कर रहे हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
P4 medium Sigma-Aldrich Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar Bacto Laboratories 214010 Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid Sigma-Aldrich N0640 Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid Sigma-Aldrich A1049 Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine Sigma-Aldrich B3274 Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid Sigma-Aldrich G7645 Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope Leica MZFLIII Or similar
Light microscope Zeiss Axiophot Or similar, with suitable optics
Digital camera Zeiss AxioCam HRc Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid SARSTEDT 75.9922.519 Autoclavable

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
  2. Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
  3. Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
  4. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  5. Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
  6. Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
  7. Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
  8. Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
  9. Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
  10. Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
  11. Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
  12. Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
  13. Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
  14. Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
  15. Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
  16. Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
  17. Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. Mathesius, U. , Available from: http://www.noble.org/MedicagoHandbook (2006).
  18. Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
  19. Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).
  20. Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक 100 युग्मज embryogenesis दैहिक embryogenesis विकासात्मक जीव विज्ञान टिशू कल्चर, संयंत्र embryogenesis फलियां embryogenesis संयंत्र विकास प्लान्ट टिशू कल्चर
मॉडल फली में जल्दी भ्रूण के विकास के नियमन के अध्ययन के लिए युग्मज और दैहिक भ्रूणों प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल<em&gt; Medicago truncatula</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kurdyukov, S., Song, Y., Tiew, T. W. … More

Kurdyukov, S., Song, Y., Tiew, T. W. Y., Wang, X. D., Nolan, K. E., Rose, R. J. Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula. J. Vis. Exp. (100), e52635, doi:10.3791/52635 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter