Introduction
Typene I og III-interferoner (IFN) er kritiske i immunresponsen mot virus og andre sykdomsfremkallende stimuli og er til stede i alle virveldyr 1. Immune og ikke-immunceller uttrykker og utskiller, samt svare til, IFN 2. Medfødte immun sensorer, for eksempel toll-like reseptorer (TLR), STING, og RIG-I, indusere type I og III IFN uttrykk ved deteksjon av patogen assosiert molekylære mønstre (pamp) 3,4. Hos mennesker, type I IFN inkluderer IFN-β, -ω, -κ, og 12 undergrupper av IFN-α, og binder seg til IFNAR1 / IFNAR2 reseptor kompleks 2,5. Type III IFN inkluderer IFN-λ1, -λ2, og -λ3 og binde til IL10RB / IL28RA reseptor kompleks 2. Klassisk, type I og III IFN binder seg til sine respektive reseptor komplekser som deretter rekruttere STAT1 / STAT2 heterodimerer og initiere transkripsjon av interferon stimulert gener (ISG) 6. ISG er involvert i en rekke ulike funksjoner, fra antiviral og antiproliferativ aktivitet til aktivering av den adaptive immunrespons 7.
De mange mekanismer patogener har utviklet seg til å lure seg unna, styrte, og kapre elementer av IFN signalveien vise betydningen av IFN i det medfødte immunrespons 8. For eksempel uttrykker vacciniavirus en lokkedue reseptor med IFNAR1 homologi som sequesters type I IFN 9 mens en Yaba-lignende sykdom virus utskiller et glykoprotein som hemmer Type I og III IFN proteiner 10. I tillegg til sin rolle i vertens forsvar, er IFN også implisert i kreft overvåking og et antall auto inflammatoriske sykdommer: lyddemping av IFN-ekspresjon i brystkreftceller begrenser immunosurveillance 11, er overproduksjon av IFN-α en mekanisme i utviklingen av systemisk lupus erythematosus 12, og villfaren aktivering av STING fører til systemisk betennelse forårsaket av overdreven mengder IFN i STING-assosiert vaskulopati13. Terapeutisk, IFN brukes til å behandle multippel sklerose 14, kroniske virale infeksjoner som HBV 15 og HCV 16,17, og kreftformer som hårcelleleukemi 18 og kronisk myelogen leukemi 19. Spørsmål om relevansen av IFN i en bestemt fysiologisk prosess kontinuerlig avsløre den allestedsnærværende natur av denne cytokin familien.
Type I IFN, spesielt IFN-α subtyper, blir ofte betraktet som en enhet 20 til 23, i stedet for som en gruppe av nært beslektede, men distinkte, proteiner. Eksistensen og utholdenhet av flere IFN arter inkludert IFN-α subtyper, hele virveldyr evolusjon 24 antyder at minst en undergruppe av disse undertypene har spesielle eller unike funksjoner. Det er mulig at definerende mønstre av IFN uttrykket vil tyde og hjelpe karakteriserer de spesifikke funksjoner av en eller flere av de undertyper 17. Utfordringen med å studere tHan type I og III IFN-subtyper er basert på deres felles sekvensidentitet: de tolv IFN-α subtyper har> 50% 25 og IFN-λ subtyper dele 81-96% 26 av deres aminosyresekvenser. I den beskrevne QRT-PCR-analyse, molekyl radiofyr (MB) og låst nukleinsyre (LNA) fluorescerende prober diskriminere enkle basepar forskjeller mellom de tilsvarende høyt IFN-undertype-sekvenser og tillate karakterisering av IFN-ekspresjon signatur. Analysen er 384-brønns plate format omfatter både kvantitative (transkripsjon standarder) og semi-kvantitative (housekeeping gener (HKG)) tiltak, noe som åpner for analyse av transkripsjon kopi nummer og ΔCq hhv. Batch montering, tilrettelagt av automatiserte multikanal pipettering, og langtidslagring, mulig gjennom tørking av primer / probe (Pr / Pb) setter på platene, forbedre reproduserbarhet, verktøyet, og praktisk bruk av analysen.
Denne protokollen beskriver prosessenfor fremstilling av 384-brønners QRT-PCR-assay-plater (figur 1) med opp til sytten forskjellige Pr / Pb sett rettet mot humant IFN-subtyper (tabell 1). Pr / Pb innstilte lager kildeplater (figur 2) brukes til å forberede flere 384-godt analyseplatene i en prosess som kan automatiseres ved hjelp av en robot multikanalpipette. Når det første fokusert på å skape en protokoll for å studere humane IFN uttrykk signaturer har denne metoden er anvendt på rhesus-aper i tillegg. Selv om plate oppsett er litt annerledes og Pr / Pb sett (Tabell 2) er tydelig, er den samlede forberedelse metode for å lage de menneskelige og rhesus plater identiske. Med minimale modifikasjoner av protokollen, kan fremgangsmåten bli utført for å tillate utvikling av analyser for å studere andre grupper av nært beslektede gener.
Se figurene 1 og 2. Her
Se tabellene 1 og 2 Below
Protocol
1. Utarbeidelse av Standard seriefortynninger (figur 3A)
MERK: Serie fortynningsserier linearisert plasmider inneholder sekvensene målrettet av en Pr / Pb sett blir brukt som kvantitative standarder for QRT-PCR-analyse. Hver standard serie fortynning satt for IFN subtypene inneholder nok volum til å kjøre 90 analyseplater. De fire punktene i standard fortynning kurve som brukes for assayet er valgt for å dekke Ct-verdier fra et område på 20 til 32 (tabell 3).
- Tine, vortex, og kort Sentrifuger standard (50 pM), og laksesperm-DNA (ssDNA, 10 mg / ml) stamløsninger.
- Forberede ssDNA / vann miks for de 17 standardutvannings sett ved å blande 51 mL av ssDNA med 20,3 ml vann.
- Merk av et 8-tube PCR stripe for en standard fortynning sett.
MERK: Utarbeidelse av standard seriefortynninger fra lagerløsninger vil ta 2-3 timer. - Dispensere 190 mL av ssDNA / vann blanding til first tube i stripen og 180 mikroliter av ssDNA / vann blanding til de fem gjenværende rørene.
- Utfør en 1:20 fortynning ved å overføre 10 pl fra 50 pM standard lager til røret med 190 mL av ssDNA / vann, bland; vortex og raskt Sentrifuger PCR-stripen.
- Utføre en 1:10 fortynning ved å overføre 20 ul fra den sist fortynnes rør til det neste rør i rekken; vortex og raskt Sentrifuger PCR-stripen.
- Gjenta trinn 1.6 til siste rør i fortynningsserie har fått standard.
- Gjenta trinn 1,3-1,7 for hver standard.
Se tabell 3 nedenfor
2. Utarbeidelse av Primer / Probe (Pr / Pb) og No Mal Control (NTC) Arbeids Stock Mixes (figur 3B)
MERK: Hver 1,7 ml Pr / Pb innstilte lager og 128,6 mL Ingen mal kontroll (NTC) arbeider lager mix vil gjøre 30 analyseplater.
- Forberede Pr / Pb satt arbeids lager mikser.
IKKEE: Utarbeidelse av Pr / Pb sett og NTC arbeider lager blander fra lagerløsninger vil ta 2-3 timer.- Resuspender primere og prober på 100 mikrometer med ultrarent vann for utarbeidelse av stamløsninger.
- Merke opp til sytten 2 ml rør; en for hver Pr / Pb sett inkludert i analysen.
- Tine, vortex, og kort sentrifugere primere (100 pm), sonder (100 pm), og ssDNA (10 mg / ml) stamløsninger.
- Tilsett 2 mL av ssDNA til hver tube med 12,5 mL elektronisk multikanalspipette. Legg riktig fremover primer, revers primer, og sondere til hver Pr / Pb innstilte lager tube. Se tabell 1 for de Pr / Pb sett rettet mot menneskelige IFN subtyper og tabell 2 for rhesus macaque Pr / Pb sett. Tilsett vann for å bringe volumet av hver Pr / Pb innstilte lagerrøret til 200 pl.
MERK: Volumet av primere, sonde, og vann for å legge an på den nødvendige endelige reaksjon konsentrasjon av en Pr / Pbinnstilt.
- Forberede NTC arbeids lager mikser.
- Label to 5-tube PCR strips for NTC arbeids bestandene blander.
- Overfør 14,3 ul av hver Pr / Pb innstilt på riktig NTC arbeidslagerblandingsrøret. Se tabell 4 for de Pr / Pb sett kombinasjoner for NTC brønner. Tilsett vann til hver av NTC arbeidslager blander for å bringe det endelige volumet til 128,6 mL.
- Vortex, kort sentrifuge, og plassere rørene i mørket på is eller ved -20 ° C for langtidslagring.
Se tabell 4 nedenfor
- Fortynne Pr / Pb satt arbeider aksjer.
- Etter fjerning av en alikvot av de Pr / Pb sett som kreves for NTC arbeidslager mikser, tilsett 1,5 ml vann for å bringe det endelige volum på hver Pr / Pb innstilte lagerrøret til 1,7 ml.
- Vortex, kort sentrifuge, og plassere rørene i mørke på is eller ved -20 ° C i lengre tids lagring.
- Forberede en 96-brønns kilde plate av Pr / Pb sett og NTC mikser for alikvoteringsprosessen til 384-brønnen analyseplatene.
MERK: Utarbeidelse av kildeplaten fra Pr / Pb hjemkomsten lager mikser vil ta mindre enn en time. Hver 96-brønns kilde plate er nok til å gjøre seks 384-brønners analyseplater (Figur 3C).- Vortex og kort Sentrifuger Pr / Pb satt arbeider aksjer og NTC arbeids lager mikser.
- Plasser en ny 96-brønners plate i en avkjølt 96-brønners kjøleblokk og utpeke brønnene for hver Pr / Pb-apparatet eller NTC blande brønnene mottar (se figur 2).
- Tilsett vann til den 96-brønns plate ved anvendelse av en 250 ul elektronisk multikanal pipette: Tilsett 66 pl vann til hver Pr / Pb satt godt (bortsett fra de fire brønner for Target 17). Dispensere 82,5 mL av vann til de fire Target 17 brønner. Dispensere 27,5 mL av vann til hver NTC mix godt. Tilsett riktig Pr / Pb innstilte lager til de utpekte brønnene i 96-brønns plate: Tilsett 54 mL av riktig Pr / Pb innstilte lager til de utpekte Pr / Pb sett brønner (unntatt de fire brønner for Target 17). Dispensere 67,5 mL av Target 17 Pr / Pb innstilte lager til de utpekte Target 17 Pr / Pb sett brønner. Legg 22,5 mL av riktig NTC arbeider lager mix til de utpekte brønnene.
- Forsegl 96-brønn plate med en klebeplate tetning og sentrifuger i 1 min ved 700 x g for å sikre at innholdet er på bunnen av brønnene.
- Plasser 96-brønners plate i virvelblanderen ved hjelp av en 96-brønns plate adapter og bland i 1 min ved 1000 rpm. Sentrifuger 96-brønns plate i 5 min ved 700 x g.
- Lagre 96-brønners plate kilde i mørket ved 4 ° C ved bruk i samme dag, ellers lagres ved -20 ° C inntil bruk.
- Forberede 384-godt analyseplatene ved å legge til Pr / Pb sett ved å bruke den automatiserte multikanalpipette.
MERK: Utarbeidelse av seks analyseplater fra 96-brønnen kilde plate vil ta 3-4 timer.- Før å gjøre platene, pre-kjøle kjøle reir til 4 ° C og forvarmer platefordamper til 125 ° C, og den nederste varmeblokk til 80 ° C med luftstrøm blåser mellom 20 til 25 liter per minutt (LPM).
- Slå på den automatiserte multikanalpipette og åpner protokollen for å gjøre IFN analyseplatene ved å dobbeltklikke på ikonet for Programvaren.
- For å sette opp plattformen, plasserer en helt full pipette tips boksen i plattformens posisjon 1, den 96-brønnen kilde plate i posisjon 4, og en ny 384-brønners plate i posisjon 6. Begynn å løpe ved å trykke på play-knappen.
MERK: Ved ferdigstillelse av et løp, hver brønn vil inneholde 5 ul Pr / Pb mix.
MERK: Det endelige beløpet av ssDNA tilsatt per brønn av 384-brønnen analyseplaten er 0,025 mikrogram. - Banke forsiktig på 384-brønnen analyseplaten på en flat overflate for å sikre væske er på bunnen av brønnene og bruke et limplate segl.
- Sentrifuger plate i 1 min ved 700 x g. Fjern den selvklebende plate segl, plasserer 384-brønnen analyseplaten inn i platen tørketrommel og plassere 384-brønnen manifold direkte over brønnene.
- Når 384-brønnen analyse plate innholdet tørr, påfør en ny selvklebende plate segl, pakk inn i folie, etikett, og oppbevares mørkt ved 4 ° C inntil bruk.
MERK: Platene kan lagres ved 4 ° C i minst 6 måneder. - Gjenta trinnene 3.2.3-3.2.6 til 6 x 384-brønners analyseplater fremstilles, eller væsken i 96-brønns plate kilden er tømt.
- Slå av kjøle reiret, lukker programvaren, og slå av automatiserte multikanalpipette. Slå av platen tørketrommel.
4. lastes og kjøres en 384-vel Analyse Plate
- Forbered to husholdningsgenet (HKG) godt mikser, som består av Pr / Pb sett for en HKG, ssDNA, PCR mester mix, og vann, som skal legges til en tørket 384-godt analyseplaten (
- Merke en 1,5 ml tube for hver HKG mix.
- Fortynn 2 pl ssDNA (10 mg / ml) med 84,9 mL vann. Tilsett 2 mL av den fortynnede ssDNA, 11,8 mL av vann, 23 mL av master-mix, og 9,2 mL av riktig 20x HKG Pr / Pr satt til hvert rør, vortex, og kort sentrifuge.
- Bruk glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og ubiquitin C (UBC) som HKG for human assay (se Materialer tabell). Bruk GAPDH og 18S ribosomalt RNA som HKG for rhesus analysen.
MERK: HKG brukes til å utføre analysen er fleksible og bør gjenspeile de genene som passer for celletype som testes GAPDH, UBC, og 18S er eksempler på brukte HKG;. andre HKG kan være mer hensiktsmessig.
- Forberede prøven og positive kontroll godt blandinger, som består av prøven eller positiv kontroll cDNA, masterblanding, og vann, som skal tilsettes til en tørket 384-brønners analyseplate. Forberede prøven og de positive kontrollmikser i nok mengde til å dispensere til 21 platebrønner (Figur 3D).
- Før cDNA syntese, følger produsentens instruksjoner for å forberede RNA prøver med en DNase fordøyelsen trinn.
- Forberede prøvene og positiv kontroll på forhånd fra cDNA syntese av minst 500 ng av RNA fulgt av behandling med RNase H (sluttvolum på 24 mL for hver prøve) etter produsentens anvisninger. Lagre den forberedte cDNA ved -20 ° C inntil bruk. Tine, vortex, og kort Sentrifuger prøven cDNA.
- Legg 78,8 ul masterblanding og 54,8 ul vann til hver 24 pl prøve og positivt kontrollrør.
- Vortex og kort sentrifugere rørene.
- Forbered standardene og NTC blander godt, conbestående av masterblanding og vann, som skal tilsettes til en tørket 384-brønners analyseplate (figur 3D). For standarder godt blande, tilsett 165 ul vann til 275 mL av masterblanding i en 1,5 ml tube. For NTC godt blande, legge 52,5 mL av vann til 52,5 mL av masterblanding i en 1,5 ml tube. Vortex og kort sentrifugere rørene.
- Forberede en tørket 384-brønn analyseplate for lasting av de mikser og prøver.
- Fjern en tørket 384-brønners analyseplate fra 4 ° C og sentrifugering i 1 minutt ved 700 x g.
- Plassere platen på en kjølt 384-brønners kjøleblokken, fjerne klebeplaten tetning og skissere brønnene av platen for å angi hvor de forskjellige blandinger og prøvene blir pipettert (figur 1).
- Laste 384-brønnen analyse plate med standard vel mix, standarder, NTC godt blande, prøver, positiv kontroll, og HKG mix (Figur 3E). Vortex og kort sentrifuge alle løsninger før det leveres til plate.
- Dispensere 6 mL av standardene godt blande til hver standard godt med 30 pl elektronisk multikanalspipette. Dispensere 1,5 mL av riktig standard serie fortynning til den utpekte godt med 12,5 mL elektronisk multikanalspipette.
- Dispensere 7,5 mL av NTC godt blande til hver NTC godt med 30 pl elektronisk multikanalspipette. Dispensere 7,5 mL av prøven til de utpekte brønnene med 30 pl elektronisk multikanalspipette. Dispensere 2,5 mL av HKG Pr / Pb mikser til de utpekte brønner med 12,5 mL elektronisk multikanalspipette.
- Fyll eventuelle tomme brønner med 7,5 mL av left vann og master mix blanding med 30 pl elektronisk multikanalspipette; 7,5 mL av vann alene vil også fungere.
- Tett 384-brønnen analyseplaten med den optiske selvklebende film og sentrifuger i 1 min på 700 x g. Vortex forseglet 384-brønners plate i virvelblanderen i 2 minutter ved 2600 rpmog sentrifuger i 5 minutter ved 700 x g.
- Plasser forseglet 384-brønnen analyseplaten i QRT-PCR-maskin, åpner du malen for analysen layout og begynne kjøringen.
MERK: Resultatene kan eksporteres som et regneark eller som en tekstfil for analyse. - Bruke følgende optimale termiske cycler reaksjonsbetingelser for analysen: i) 50 ° C i 2 minutter, ii) 95 ° C i 10 minutter, iii) 95 ° C i 25 s, ii) 59 ° C i 1 min. Gjenta trinn III og IV i 40 sykluser.
- Eksportere rådata fra QRT-PCR-plattformen i et regnearkprogram programvare. Plotte hver 4-punkts standard satt som en standardkurve for å observere linearitet. Utføre analyser ved å beregne ΔCq eller ved kopi nummer basert på de fire punkts standardkurver 27.
Se figur 3 nedenfor
Representative Results
Den QRT-PCR-analyse er beskrevet kan implementeres for å analysere uttrykk mønstre av typene I og III IFN i en rekke celletyper og sammenhenger. For eksempel ble human type I og III IFN uttrykk signaturer analysert i perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra seks donorer stimulert med TLR ligander; poly I: C (25 ug / ml) LPS (10 ng / ml), Imiquimod (10 pM), og CpG-oligonukleotider (1 uM) (figur 4). Data ble analysert ved hjelp av et regnearkprogram programvare og presentert som radarkart med IFN-α subtyper arrangert klokken henhold til fylogenetisk tre av deres protein sekvens 27. Radar diagrammer av menneskelig IFN uttrykk er presentert i en log skala beregnet ved hjelp av to ulike metoder for analyse innlemmet i analysen utforming: absolutt Cq verdi normalisert til HKG (ΔCq), og kopiere antall mal per mikrogram (mikrogram) av total RNA . Kopitallverdier er beregnet ut fra resultater o fa avskrift standardkurve. Dataene viser at menneske IFN uttrykk signaturer fremkalt av TLR-agonister er ligand spesifikke.
Se figur 4 nedenfor
Som demonstrert for de menneskelige IFN uttrykk signaturer, uttrykk signaturer av type I og III IFN i rhesus aper var også TLR ligand bestemt. PBMC fra 3 donorer ble stimulert med poly I: C (50 ug / ml) LPS (10 pg / ml), og Imiquimod (10 ug / ml) i 3 timer (figur 5). IFN subtype uttrykk i ustimulerte celler ved baseline var lav. Et begrenset antall av IFN-subtyper ble uttrykt som respons på LPS og poly I: C. I motsetning til dette, IFN-ekspresjon i respons til Imiquimod var høy og subtype ekspresjon var bred. Ekspresjon av IFN-β og IFN-λ1 ble forsterket av alle tre TLR agonister 28.
Se figur 5 nedenfor
alltid ">
Figur 1:. Oppsettet for en 384-brønnen analyseplaten med sytten Pr / Pb sett Target nummer refererer til en Pr / Pb sett. De fire punkts standardkurver (mørk grå trekant) er lagt til kolonner 1-5. De HKG Pr / Pb sett (hvit bakgrunn) blir tilsatt til kolonner 6 og 7. De gjenværende kolonner, 8-24, er bestemt for en av de sytten Pr / Pb sett. Prøvene er lagt til rader AP, fra kolonner 6-24 (svarte piler). De to brønnene (O5, P5) på bunnen av kolonnen fem får bare vann og master mix. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Utformingen av en 96-brønns plate kilde med sytten Pr / Pb sett Target nummer refererer til et Pr / Pbinnstilt. Svarte pilene representerer når en Pr / Pb sett er lagt til flere brønner. NTC mikser er lagt til de utpekte brønnene (mørk grå bakgrunn). De to brønnene (F3, G3) med diagonale linjer er ubrukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av spesifikke trinn i QRT-PCR-analyse protokoll AE diagram velge deler av protokollen.. (A) Trinn 1: Fremstilling av standard serielle fortynninger. (B) Trinn 2: Utarbeidelse av Pr / Pb og NTC arbeider lager mikser. (C) Trinn 3.1: Utarbeidelse av en 96-brønns arbeids aksjer plate av Pr / Pb sett og NTC mikser. (D) Trinn 4,1 til 3: Utarbeidelse av blandinger for lasting av 384-brønnen analyseplaten. (E) Step 4.5: Legge i 384-brønnen analyseplaten. Diagrammer leses fra øverst til venstre til nederst i høyre hjørne. Reagenser for interferon (IFN) analysen er lagret ved -20 ° C og er oppført i venstre kolonne; linjer separate handlinger i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Den humane IFN ekspresjon signatur i perifere mononukleære blodceller (PBMC) skiller seg i respons til det TLR ligander benyttes for stimulering PBMC ble stimulert med TLR ligander og RNA ble høstet for QRT-PCR-analyse.. Den geometriske anordning av de maksimale responser til poly I: C (25 ug / ml) i 8 timer (røde firkanter), LPS (10 ng / ml) ved 4 timers (grønne trekanter), Imiquimod (10 pM) ved 16 timer ( lilla diamanter), CpG (1 mm) på16 timer (svarte sirkler), og ustimulert kontroll på 16 timer (blå sirkler) fra 6 givere er vist i log 10 skala som en funksjon av uttrykk for HKG UBC ΔCq (venstre) eller som kopi nummer per mikrogram av RNA (høyre) . IFN-α subtyper er ordnet i henhold til den fylogenetiske plott av aminosyre-sekvenslikhet. Dette tallet ble opprinnelig publisert i immunologi og cellebiologi 27.
Figur 5:. Den Rhesusape IFN uttrykk signatur i perifere mononukleære blodceller (PBMC) skiller seg i respons til TLR-ligander som brukes for stimulering PBMC fra tre rhesus aper (utpekt av torget, diamant, og trekant) ble isolert fra fullblod og stimulert med lipopolysakkarid (LPS) (10 ug / ml), poly I: C (50 ug / ml) eller Imiquimod (10 ug / ml). Cellene ble høstet ved 0 hr (open figurer) eller etter tre timer av TLR stimulering (lukkede figurer) for måling av IFN uttrykk. Transkripsjonsnivåer av type I, II og III IFN vises i log 10 skala som en funksjon av uttrykk for HKG GAPDH ΔCq (venstre) eller som kopi nummer / mikrogram RNA (til høyre). Dette tallet ble opprinnelig publisert i Journal of Interferon og Cytokine Forskning 28.
Tabell 1:. Menneskelig IFN primer / probe sett sekvenser og reaksjon informasjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2:. Rhesusape IFN primer / probe sett sekvenser og reaksjon informasjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
| Plasmid-konsentrasjon (FM) | ||||
| A | B | C | D | |
| IFN-α1 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α2 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α4 | 2500 | 250 | 25 | 2,5 |
| IFN-α5 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α6 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α7 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α8 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α10 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α14 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α16 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-α17 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-α21 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ1 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ2 | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-λ3 | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
| IFN-β | 25 | 2,5 | 0,25 | 0,025 |
| IFN-ω | 250 | 25 | 2,5 | 0,25 |
Tabell 3: Standard fortynning sett konsentrasjon informasjon.
| IFN Pr / Pb Stiller lagt | Vannmengde lagt (ml) | |
| NTC 1 | IFN-β, -ω, -λ3 | 85.7 |
| NTC 2 | IFN-α1, -α5 | 100,0 |
| NTC 3 | IFN-α2 | 114.3 |
| NTC 4 | IFN-α4 | 114.3 |
| NTC 5 | IFN-α7 | 114.3 |
| NTC 6 | IFN-α6, -α8, -α10 | 85.7 |
| NTC 7 | IFN-α14, -α16 | 100,0 |
| NTC 8 | IFN-α17 | 114.3 |
| NTC 9 | IFN-α21, -λ1 | 100,0 |
| NTC 10 | IFN-λ2 | 114.3 |
Tabell 4: NTC arbeider lager blander informasjon.
Discussion
Rapporten beskriver konstruksjon, satsvis produksjon, og en tilnærming til analyse av en analyse for å måle transkripsjon av et sett av svært lignende gener i et forskningslaboratorium innstilling. Den høy gjennomstrømming QRT-PCR-analysen rapporteres her måler IFN og - λ undergrupper med høy spesifisitet. Denne metoden innebærer to viktige aspekter, utforming av Pr / Pb settene som diskriminerer mellom medlemmer av en homolog genfamilien og utvikling av en produksjonsplattform for etablering av pålitelige og konsistente 384-brønners analyseplater forhåndslastet med Pr / Pb sett. QRT-PCR-sonder innlemme en strukturell (MB) eller kjemisk (LNA) tilnærming for å styrke deres spesifisitet 29. For to av primersettene i rhesus-analysen (Tabell 2), ble amplifikasjon-ildfast mutasjon system (ARMS) innarbeidet i primersekvenser for ytterligere å forbedre spesifisiteten 30. Mens det er vanligvis best å målrette exon-ekson veikryss til enhance spesifisiteten av en QRT-PCR-reaksjon, var dette ikke mulig fordi den type I IFN-gener mangler introner. Derfor vil genomisk DNA amplifiseres i PCR-reaksjonen, og må nedbrytes ved DNase-behandling etter at RNA-ekstraksjon.
Målområdet for Pr / Pb settene var begrenset til de kodende områder i det modne peptid for hver IFN. På grunn av den høye sekvenslikhet mellom IFN-α undertyper, spesielt det modne peptid regionen, var det noen ganger nødvendig å inngå kompromiss sensitivitet for å sikre spesifisitet. Dette var spesielt tilfelle med IFN-α17, hvor modne peptid transkripsjon har bare fire unike baser når sammenlignet mot de andre IFN-α subtyper. Målretting IFN-α17 nødvendig primere som binder transkripsjoner av flere undergrupper, begrenser spesifisitet til sonden. Som en konsekvens, vil PCR-reaksjonen forsterke andre undertyper enn IFN-α17, for derved å forbruke en betydelig prosentandel av PCR-reagenser og lowering amplituden av fluorescens-signalet fra den spesifikke probe for IFN-α17. En ytterligere utfordring mot utforme sensitive og spesifikke Pr / Pb sett for høyt lignende gener slik som IFN, er muligheten for at kommenterte sekvenser i GenBank databasen ikke kan være fullstendig eller fullstendig ved design. Igjen, dette var en utfordring for IFN-α17, der nylig kommenterte sekvenser ikke helt på linje med den versjonen av sekvensen i databasen på tidspunktet for design. Derfor, når du utformer Pr / Pb setter for gener som ikke har vært intensivt studert, er det lurt å regelmessig sjekke siste kommenterte sekvens av et mål genet. Til slutt, er det nødvendig å sikre at de Pr / Pb sett ikke forsterke pseudogener som kan transkriberes men ikke oversatt.
Etter utforme de Pr / Pb sett, er den neste utfordringen å optimalisere PCR betingelser for sytten forskjellige Pr / Pb setter på en 384-brønners plate. Transkripsjon standarder er vik-tant i å teste spesifisitet av en Pr / Pb sett og blitt viktig for å harmonisere QRT-PCR-betingelser for de mange ulike PCR reaksjoner. Teste en Pr / Pb sett mot karakterutskriften standarder etablerer sin effektivitet og følsomhet; plasmider som uttrykker svært lignende pseudogener kan være nødvendig for å sikre at Pr / Pb satt måler selektivt transkripsjon av det funksjonelle genet. Transkripsjonen standardene gir også et middel for kvantitativ analyse (antall transkripter), i tillegg til den semi-kvantitativ analyse i forhold til en husholdningsgenet (ΔCq).
Robotflerkanals pipettering av en 96-brønns plate kilde i flere 384-brønners analyseplater forbedrer presisjon og konsistensen av inter-plate resultater. Laksesperm DNA (ssDNA) blir brukt som en bærer som stabiliserer og bevarer Pr / Pb sett for langtidslagring, som gjør tørking av reagensene dispensert inn i platene. Tørking av platene også reduserer volumet av reaksjonsnødvendig for reproduserbare resultater, som i sin tur bevarer dyreprøver og reduserer bruken av kostbare reagenser. Gjennom disse trinnene, er grupper av plater montert som gir presisjon og konsistens i mer enn seks måneder.
Etter plate forberedelse, kvalitetskontroll tiltak er avgjørende for å kontrollere konsistensen av en bunke med plater. For dette formål er en ytterligere fire sett av standarder kjørt på en plate. Den "5x standard" plate sporer ytelse og skaper et datasett som en enkelt plate standarder sammenlignes. Mens ti 10-gangers fortynninger av hver standard anvendes under analysedesign, plasshensyn krever at fire punkter er benyttet for standardkurven på hver analyseplate, og for 5 x standard plate. I tillegg bør en positiv kontroll være inkludert på hver plate for å sikre gyldigheten av platen.
Vanligvis tar det 3-4 timer å forberede seks analyseplater fra en Pr / Pb source plate; det er mulig å forberede tolv plater på en enkelt dag i et forskningslaboratorium. Siden hvert menneske IFN subtype analyseplaten undersøker sytten Pr / Pb sett og rommer femten eksperimentelle prøver, produserer en dag av forsamlingen en bunke med plater med kapasitet til å generere opp til 3060 eksperimentelle datapunkter. Rådata fra QRT-PCR-plattformen kan behandles og monteres ved hjelp av programmering skript i et regnearkprogram programvare for å fylle en forhåndsutformet analyse mal automatisk. Denne metoden minimerer hands-on dataregistrering, og dermed hindre kopiering feil og lar etterforsker for å fokusere på dataanalyse fremfor data montering. Som beskrevet her, kan denne high-throughput QRT-PCR-analyse anvendes for å måle ekspresjonen av interferon undertyper i menneske eller Rhesusape prøver og kan tilpasses til bruk for andre arter eller homologe gen sett. Fleksibiliteten av platen oppsettet gjør det mulig for brukeren å endre primer / probe-sett for å skreddersy generinteressen mot en bestemt celletype eller modellsystem. Denne analysen kan brukes til å måle IFN uttrykk signaturer i cellekulturmodeller studerer patogener eller i pasientprøver i forbindelse med sykdomsmodeller til å belyse de signaleringsmekanismer som er involvert i immunresponsen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency avtalen YI-AI-6153-01, FDA / CBER egenutført midler, og FDA medisinske mottiltak Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, og KDK ble støttet av en avtale til Forsknings Deltakelse Program ved Center for biologiske Evaluering og forskning administreres av Oak Ridge Institute for Science Education gjennom en Interagency avtalen mellom USA departmen of Energy og USA Food and Drug Administration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0 ml Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
References
- Yan, N., Chen, Z. J.
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J.
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
