Summary
렌티 바이러스는 cDNA를 표현 또는 shRNA를 생쥐의 특정 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절할 수의 정위 주입. 여기, 우리는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST)와 같은 행동 작업으로 정위 주사를 결합하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
정위 주사는 쥐에서 대상 뇌 영역에 높은 역가의 렌티 바이러스를 전달하는 유용한 기술이다. 렌티 바이러스가 과발현 또는 뇌 조직에 큰 손상없이 비교적 집중된 지역에서 최저 유전자 발현 할 수 있습니다. 복구 후, 주입 된 마우스는 오픈 필드 테스트 (OFT)과 강제 수영 시험 (FST) 등의 다양한 행동 작업에 테스트 할 수 있습니다. OFT는 마우스 신규 오픈 필드의 중앙에 보내는 시간의 양을 측정함으로써 마우스에서 운동 및 불안 표현형을 평가하기 위해 디자인된다. 더 불안 마우스 대조군과 비교하여 신규 필드의 중심에서 상당히 적은 시간을 소요한다. FST 물 버킷에 넣고, 마우스가 움직이지 않는 경우에 소요되는 시간을 정량화하여 항 우울증 표현형을 평가한다. 항 우울 표현형을 가진 마우스는 동물을 대조군에 비해 훨씬 적은 시간 움직이지를 보낼 것입니다. 이 프로토콜의 목적은 아이돌을 사용하는 것행동 검사와 함께 렌티 바이러스의 eotactic 주입은 동물의 행동을 조절하는 방법을 유전 적 요인 평가합니다.
Introduction
그 유전자 조작이 용이하기 때문에 마우스 신경 생물학에서 널리 사용되어왔다. 유전자 녹아웃 기술은 각각의 유전 인자는 마우스 동작을 모양 방법을 연구 조사 할 수 있습니다. 또한, CRE-에 loxP 시스템은 조직 -을위한 유용한 도구를 제공하고, 다른 조직에서 유전자 기능을 연구하는 연구자 수 있습니다 생쥐의 유형 - 특정 유전자 녹아웃을, 세포. (1) 그러나, 실제로, CRE 프로모터의 발현 패턴을 제어하기 어려운 , 지금까지 많은 설립 CRE 드라이버는 특정 지역과 관련된 표현을 달성하지 않았습니다. 2,3
대안 적으로, 정위 주사 성인 쥐의 뇌의 특정 영역을 목표로하는 방법이다. 된 cDNA 또는 shRNA를 발현 유전자 조작 바이러스를 주입하여, 유전자 발현의 특정 지역과 관련된 변조를 달성 할 수있다. 각 마우스의 뇌의 크기가 다르지만, 뇌의 특정 영역의 위치는 정위 번호 좌표를 사용하여 결정될 수있다궁둥이 마우스 뇌의 두개골에 랜드 마크에서 설정합니다. 가장 일반적으로 사용되는 랜드 마크 브레 그마, 람다, 및 라인 간가있다. 뇌 아틀라스로부터 얻어지는 좌표를 사용하여, 각 뇌 영역의 4 정확한 위치는 안테 - 후방 (A / P), 내측 - 외측 (M / L)에 의해 식별 될 수 있고, 지느러미 - 복부는 (D는 / V)에서 축 브레 그마는 / 간가 라인 교차. 주사는 형광 현미경으로 확인 할 수 있도록 일반적으로 쥐의 뇌에 주입 바이러스는 하나 빨강, 또는 녹색 형광 단백질 (RFP 또는 GFP) 태그된다.
쥐의 행동 평가는 정신 질환의 기초 연구에 특히 필요하다. 환자의 정신 장애의 증상은 일반적으로 비정상적인 행동을 포함한다. 이러한 인간의 행동 중 일부는 진화 적으로 보존하고 직접 모방 및 마우스에서 관찰 할 수있다. 예를 들어, 우울증 행동 절망을 측정함으로써 마우스에서 모델링 될 수있다. 자주 우울증이있는 사람그들도 도움이 될 것입니다 아무것도 할 것처럼 EN은 결국 자살로 이어질 수있는 증상을 느낀다. 설치류, 이것은 물 풀에 떠 대 수영 마우스 (포기로 간주) 시간의 양을 측정 강제 수영 시험 (FST)를 사용하여 모델링 될 수있다. 이 패러다임은 항우울제와 표현형을 구출에 의해 검증된다. 처리되지 않은 대조군에 비해 훨씬 적은 시간 움직이지를 보낼 것입니다 항우울제를받은 7, 8, 9 마우스를. 다른 행동 테스트, 오픈 필드 테스트 (OFT) 마우스에서 운동을 평가하도록 설계되고, 별도로 마우스에서 불안 표현형을 분석하는데 사용될 수있다. 5,6이 시험은 그들이 가까이있을 때 마우스는 안전한 느낌 전제 소설 열기 필드에서 벽에. 그들은 호기심 동물로 야생 형 마우스는 결국, 새로운 환경을 모색 할 것입니다. 그러나, 필드의 중심에서 적은 시간을 소비하는 것은 마우스 initia를 극복 할 수 없게되므로, 마우스에 불안을 나타낸다L의 공포는 새로운 환경에 가져왔다. 열린 필드의 중심에서 필요한 시간의 양에 의해 정량화 마우스 불안은 많은 정신 질환에 존재하는 인간 임상 불안, 비교 될 수있다.
행동 패러다임 정위 주사의 조합은 타겟 뇌 영역에서 특정 유전자의 발현을 변경하는 신규 한 방법이다. 마우스 동작에 변조 된 유전자 발현의 효과는 결정될 수있다. 전뇌 녹아웃 대조적으로,이 방법은 특정 뇌 영역을 대상으로 특히 유용하다. 또한, 정위 주사는 일반적으로 성인 야생형 마우스에서 수행되며, 따라서, 내인성 유전자 발현이 발달 단계에 걸쳐 유지되었다. 유전자는 배아 발달 또는 출생 후의 단계에서 생존에 필요한 경우이 방법은 효과가 혼동을 방지한다. 하나의 주요 제한은 실험 쥐를 통해 서 갈 필요가 있다는 것입니다H 쥐의 두개골이 가지고있는 침습 수술은 열 수 있습니다. 또한, 유전자 조절의 정도는 바이러스의 역가 및 효율성에 의해 결정된다. 바이러스는 특별한기구를 필요로 정위 좌표를 이용하여 정확한 영역에 주입되어야한다. 정확한 주사 부위의 확인은 사후을 완료 할 수 있습니다.
이 방법은 이전에 각종 신경 질환에서 특정 유전자의 참여를 테스트하는 데 사용되어왔다. 예를 들어, 바이러스 성 매개의 RNAi가 (도파민 합성 할 수있다) 토륨 유전자를 타겟팅하는 흑색질의 compacta에 주입하고, 전위의 거동 분석을 수행 하였다. (10) 또 다른 연구가 관련 마우스의 행동을 평가 렌티 소음 DISC1의 정위 주사를 사용 정신 분열증에. DISC1의 최저은 새로움에 대한 응답으로 증가 운동을 주도 (평행 정신 분열증의 양성 증상), 그리고 더 큰 부동FST. (11)는 마찬가지로, 추가 연구는 5-HT (1B)의 과발현이, OFT 증가 탐색 행동이 방법을 사용하여 항 불안 표현형과 일치 주도 것으로 나타났습니다. (12) 정위 주사 CRE-에 loxP 생쥐에서 재결합을 유도하는 CRE 바이러스를 제공 할 수 있습니다 . 이 방법은 선택적으로 편도선에서 Y2 수용체 맥리의 terminalis의 침대 핵을 제거하기 위해 사용되었다. 행동 분석하면,이 마우스는 유전자가 중앙 편도체에서 삭제 된 항 우울 표현형을 찾았지만, 한 유전자가 기저 편도 또는 맥리의 terminalis의 침대 핵에 삭제없이 표현형. (13) 따라서,이 기술을 동물의 행동에 유전 적 효과를 연구 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다.
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Protocol
참고 : 동물을 포함한 모든 프로토콜은 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 지침에 따라 추적 관찰, IACUC의 # 44057
1. 렌티 바이러스 생산
참고 : 형질 전날, LentiX-293 세포는 80 % 포화 상태에 있어야합니다.
- 단지 형질 전환 전에 DMEM으로 세포를 씻어 실온에서 5 분 동안 페니실린 (100 IU / ml) 및 스트렙토 마이신 (100 ㎕ / ml)이 DMEM / 10 % FBS의 10ml에 품어.
- 1 분 동안 1 ㎖의 DMEM 소용돌이 : 3 비율 (PEI 3 μL의 1 μg의 DNA :) DNA와 폴리에틸렌 이민 (PEI) (1) (1 ㎎ / ㎖)을 희석. DNA의 체적은 DNA의 농도에 의존했다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 예를 들어, 접시 당 PEI의 60 μL 벡터 플라스미드의 10 μg의, psPax2 14 플라스미드의 5 μg의, 수 포성 구내염 바이러스 (VSV)의 5 μg의 구성 DNA 플라스미드의 20 μg의를 사용합니다.
- DMEM (100mm 접시에 10 ml의 배지에 대한 예 1 ㎖) 총 배지의 1 / 10 볼륨. 접시에 드롭에 의해 DNA - 페이 혼합물 드롭 1 ㎖를 추가하고 문화 매체가 DNA와 잘 혼합 때까지 주위에 접시를 소용돌이 친다.
- 실온에서 6 시간 동안 품어 뜨는을 제거합니다. 배지 5 mL를 추가합니다.
- 형질 전환 후 48 시간은 50 ㎖ 튜브에 4 ℃에서 5 분 동안 627 XG에 바이러스 뜨는 스핀를 수집합니다. 초 원심 분리기 튜브에 0.45 ㎛의 주사기 필터를 통해 바이러스 상등액 30㎖의 필터.
- 튜브를 밸런스, 파라 필름의 작은 조각 튜브를 충당하기 위해 멸균 물을 추가합니다. 스핀 튜브를 4 ℃에서 120 분 동안 11,249 XG에. 진공 팁을 사용하여 액체를 제거합니다.
- 차가운 PBS 100 μL 튜브를 추가합니다. 조심스럽게 4 ° CO / N에서 튜브를 바위.
- 바이러스, 피펫 (T)를 다시 일시 중단그는 PBS는 끝 펠렛을 만지지 않도록 조심하면서, 펠렛 10 배 이상 단계 1.8에서 추가. 이 작업이 완료 될 때까지 펠릿을 재현 탁하지 않는다.
- -80 ° C에서 액체 질소 저장 튜브, 플래시 동결 당 10 ~ 20 μL에서 바이러스를 나누어지는.
2. 정위 주입
악기의 2.1) 준비
- 이전에 수술 가위, 무딘 엔드 집게, 바늘 홀더, 메스, 면봉 한 쌍, 및 멸균 지표와 밀봉 팩에 천 및 오토 클레이브를 놓습니다. 또한, 10 %, 포비돈 요오드, 70 % 에틸 알코올, 흡수성 봉합사, 가열 패드, 인공 눈물을 구 유리 비드 살균기, 드릴, 드릴 비트,이 일회용 주사기, 주입 주사기, 전기 면도기, 진통 (케토 프로 펜), 마취제 (AVERTIN), 장갑, 및 주입 펌프 정위 장치.
- 0.2 사용하여 멸균 후드에서 1.25 % AVERTIN 신선한 솔루션 그 날, 필터를 확인# 181; 멸균 주사기 필터를 M 및 멸균 혈청 유리 병에 넣습니다. 차 - 아밀 알코올 5 ㎖에 2,2,2- tribromoethyl 알코올의 2.5 g을 혼합 한 후 200 ml의 물에 용해. 5. 15 아래의 pH를 유지
마우스 2.2) 준비
- 마우스 (375 ㎎ / ㎏)의 중량을 기준 AVERTIN 관리]. 15 복강 내 (IP) 주입을 통해 AVERTIN와 마우스를 주사 한 후 완전 마취까지 다시 케이지로 놓는다.
- IP 주입 (ketaprofen, 5 ㎎ / ㎏), 장소 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 인공 눈물을 통해 진통을 제공합니다.
- 마우스가 자신의 발을 곤란에 의해 완전히 잠 들어 있는지 확인합니다. 마우스가 발 핀치에 응답하는 경우, 다음 (50 μL의 용량에) 더 많은 마취제를 제공합니다. 전기 면도기를 이용하여 마우스의 면도 헤드. (주둥이의 상단에, 일반적으로 그냥 귀 뒤에서)에 조작 할 수있는 지역 및 주변 지역을 면도.
- 마우스 나 배치정위 장치 NTO. 전방 클램프에 앞니를 래치, 클램프를 낮추고 턱이 완전히 안전 있도록 조입니다.
- 완전히 머리를 안정 외이도에 귀 막대를 삽입합니다. 내이가 손상 될 수있는, 너무 멀리에 귀 막대를 삽입하지 않도록주의하십시오. 완성되면, 마우스 본체는 헤드의 위치를 방해하지 않고 약간 이동 될 수 있어야한다.
- 절차 내내 쥐의 체온을 조절하기 위해 마우스 하에서 가열 패드를 배치.
- 철저하게 수술 영역을 청소합니다. 면봉을 사용하여 수술 부위의 중앙으로부터 시작하여 바깥쪽으로 이동하는 원 운동을 10 % 포비돈 요오드를 문질러. 그 후, 동일한 방식으로 수술 부위에 70 %의 에틸 알코올을 문질러 면봉을 사용한다. 두 번 반복합니다.
2.3) 첫 번째 절개
- 마우스가 수험 공부를하게되면, 멸균 장비 가방을 엽니 다. 변경 장갑 touchi 전에악기를 ng를. 멸균 천을 꺼내 천으로 악기를 배치합니다. 어떤 악기 않은 멸균 표면에 닿으면, 그것을 소독 15 초 동안 유리 구슬 살균기를 사용합니다.
- 비 지배적 인 손에 지배적 인 손과 무딘 엔드 집게에 메스를 가져 가라. 무딘 엔드 집게로 부드럽게 그립 마우스의 피부를 사용하고, 메스를 사용하여 절개를합니다. 약 1.5 cm (코 쪽) 귀 위의 절개를 시작하고 귀 아래 약 0.5 cm로 확장 할 수 있습니다. (그림 1) 브레 그마 노출 마우스의 머리의 중앙에 수직으로 절개를 확장 할 수 있습니다.
- 브레 그마가 가시화되면, 부드럽게 두개골의 표면을 덮고있는 피를 제거하는 살균면 팁을. 머리 피부 측으로 밀어 두면 끝을 사용한다.
2.4) 장비 설치
- 모든 혈액 두개골 표면으로부터 제거되고 브레 그마가 분명히 가시화되면 (콘을 주사기를 준비10 8 TU 1 μL의 / ㎖, 볼륨)의 자기 중심. 흄 후드에서 바이러스와 주사기 주입되는 입력합니다. 기포 내부 없는지 확인합니다. 완전히 고정되어 있는지 확인하고, 정위 장치에 주사기를 놓습니다.
- 멸균 주사기 바늘의 끝은 브레 그마의 교점과 라인 간가 설정되도록 그것이 바로 두개골 표면 위에까지 천천히 주사기를 낮출. 0으로이 점을 설정하고,이 시점에서 좌표를 결정합니다.
- 관심의 뇌 영역에 따라, 정위 좌표를 변화한다. 뇌지도 책 (4)를 이용하여 이러한 좌표를 결정합니다. 좌표가 결정되면, 그 좌표에 일치하도록 주사기의 바늘을 움직인다. 좌표를 사용하여 치아 이랑을 대상 = +/- 1mm, A / P = -1.82 mm M / L. 구멍을 뚫어야 할 필요가있는 시각화하기 위해 두개골 위 오른쪽에있는 바늘을 낮 춥니 다.
- 약간 주사기를 올려 드릴을 가지고 드릴 BI를 배치두개골에 약 45 ° 각도에서 대상 드릴 사이트 위의 T 오른쪽. 시추를 시작하고, 두개골 방법을 제공 할 때까지 시추를 유지한다. 두개골 방법을 제공하는 경우, 저항의 저하를 검출 할 수있다. 대뇌 피질의 손상을 방지하기 위해, 뇌에 드릴하지 않도록주의하십시오.
- 멸균면 팁을 가지고 구멍에서 모든 피를 닦아.
- 끝이 오른쪽 뇌 (안 두개골)의 표면에 앉아 있도록 주사기를 낮 춥니 다. D / V를가 뇌 아틀라스 좌표에 기초하여, 원하는 깊이까지 더 낮은 0 주사기 (깊이) 좌표를 설정한다. -1.79 mm로 치아 이랑, 설정 D / V에 도달합니다.
- 0.2 μL / 분의 속도로 주사를 시작한다. 주사기가 원하는 깊이보다 낮은 슬립하지 않도록 손목 시계. 이 경우, 부드럽게 다시 원하는 깊이에 주사기를 올립니다.
- 주입이 완료된 후, 잔여 바이러스가 흡수되었는지 확인 약 2 분을 기다린다. 천천히 주사기를 제기하고 리를 제거하기 위해면 팁을 사용주사 부위에서 파운드.
- 다른 반구에 대해 반복합니다.
2.5) 봉합
- 포장 및 그립에서 바늘 홀더를 사용하여 바늘을 멸균 봉합사와 바늘을 제거합니다. 떨어진 바늘 홀더 바늘의 날카로운 에지에 직면한다. 비 지배적 인 손에 무딘 엔드 집게를 잡고 마우스 그립 피부에 그것을 사용할 수 있습니다. 지배적 인 손으로 시작합니다.
- 부드럽게 피부 봉합을 통하여 밀어 절개의 반대편에 피부를 잡아 무딘 단부 집게를 사용한다. 약 0.75 인치가 남을 때까지 통해 봉합사를 당깁니다.
- 바늘의 이동을하자, 바늘 홀더 한 번 주위의 봉합을 포장 무딘 엔드 집게를 사용하여, 다음, 바늘 홀더와 0.75 인치 나머지 봉합을 잡은 통해 봉합사를 당겨 바늘과 바늘 홀더 있도록 그들은 원래의되었던 것과 헤드의 대향 측에서 끝낸다. 이 매듭을 형성한다.
- 이 단계를 반복합니다세 번 이상, 머리의 측면 번갈아 바늘 홀더는 각각의 시간에 끝난다.
- 봉합사를 잘라 단계를 반복 2.5.1-2.5.3 절개를 닫을 때까지.
2.6) 수술 후 케어
- 부드럽게 마우스의 귀 막대를 제거하고 전방 클램프에서의 턱을 제거합니다.
- 이 깨어나서 자신의 주위에 이동 될 때까지 가열 패드에 마우스를 유지합니다. 매일 마우스를 모니터링하고 유지하며, 손질 먹거나 마시는하지 고통의 흔적에 대한 눈을 밖으로. 필요하다고 판단되는 경우 추가 진통제를주십시오.
3. 필드 테스트
3.1) 설정
- 50cm 높은 벽, 크기 50cm X 50cm와 빈 사각형, 플라스틱 분야를 얻습니다 (하지만 약간 더 클 수 있습니다.) 실험을 시작하기 전에 70 %의 에틸 알코올과 아레나 청소. 에틸 알코올이 완전히 경기장에 마우스를 배치하기 전에 건조 가지고 있는지 확인하십시오.
- 에 경기장을 배치바닥 및 조명은 그림자와 눈부심을 최소화하기 위해 설정되어 있는지 확인하려고합니다.
- 추적 소프트웨어를 사용하는 경우, (마우스의 밝은 전망을 가지고 충분히 멀리 떨어져 전체 포함하는 전체 경기장,하지만 충분히 가까이), 오픈 필드의 직접 오버 헤드 열기 필드 위의 약 1.5 피트 카메라를 배치합니다.
- 상자 (30cm X 30cm 약 지역)의 중심 영역을 설정합니다. (16), 시간대를 설정 측면 패널의 영역 (1) 탭을 클릭합니다.
- 상단 패널에서 모양의 윤곽을 선택하고 중앙 영역의 경계를 설명합니다. 영역을 추가 선택하고 중앙 영역의 내부를 클릭합니다. 프로그램 지시 사항을 사용하여 (이이 절차를 "중심"이라한다) 영역의 이름. 행동 테스트 손으로 득점 할 경우, 필드의 바닥이 테이프를 사용하여 표시, 10cm X 10cm 사각형으로 분할되어 있는지 확인합니다.
- 소프트웨어를 설정 때문에 설정이 올바른지, 마우스가 쉽게 VISI입니다화면 BLE. 시험 분야 (조명) 및 마우스 컬러와 호환되도록 시스템에서 검출 설정을 조정하여이 작업을 수행.
참고 : 설정이 올 때, 시스템은 어떤 그림자 또는 소변 / 대변 만 마우스를 추적하고,해서는 안된다. 구체적인 소프트웨어 설정은 경기장 조명 및 마우스의 컬러에 의존한다.
3.2) 적응도 및 테스트
- 주변 환경에 적응을하기 위해 시험 전에 행동 방 1 시간에 실험 쥐를 이동합니다. 순응에 대한 자신의 새장에 마우스를 둡니다.
- 테이프에 카메라의 행동 작업을 켜고 마우스가 벽을 향하도록 경기장의 중앙 앞쪽으로 마우스를 놓습니다.
- 5 분 타이머를 설정하고 멀리 경기장에서 단계. 가능하면 실수 마우스에 영향을주지 않도록하기 위해, 공간을 남겨.
- 5 분가되면, 마우스를 제거하고 자신의 새장에 배치합니다.
- 철저하게 다음 마우스로 진행하기 전에 현장을 청소하기 위해 70 %의 에틸 알코올을 사용합니다. 에틸 알코올이 완전히 건조 가지고 있는지 확인하십시오.
3.3) 점수
- 네 발은 중간 30cm X 30cm의 내부에있을 때, 필드의 중심에있는 것으로 마우스를 고려한다.
- 마우스 중심에서 소비하는 시간을 정량화. 또한,이 시간 (예 : Noldus의 ethovison 등) 추적 소프트웨어를 사용하여 결정합니다.
- 이렇게하려면 분석 탭으로 이동 및 분석 프로필에서 "운동"을 클릭합니다. 현재 설정되어있는 카테고리를 삭제 한 다음 위치 탭에서 "영역"을 선택합니다. 중앙 영역을 선택합니다. 다음, 결과를 볼 수있는 (결과 탭에서) "분석 출력"을 선택합니다. 각각의 재판이 나타납니다 시간을 나열하는 표는 움직이지 보냈다.
- 그렇지 않으면, 손으로 OFT 점수. 오픈 필드는 OPE의 하단에 설명 (25) 10cm X 10cm 사각형이 있어야합니다N 필드 (AS 단계 3.1.3에 설명). 마우스는 경기장의 중심으로 항목 수에 더하여, 센터에서 소비하는 시간을 정량화. 16
참고 : 중앙 30cm X 30cm 지역은 열기 필드의 중심으로 간주됩니다. 마우스는 네 개의 발은 30 X 30cm 영역 내에있는 경우 중심 지역에 거주하는 것으로 간주된다.
4. 강제 수영 테스트
주 : 행동 작업 사이의 오일의 최소 허용합니다.
4.1) 설정
- 2 L 명확한 버킷을 확보, 22 ° C의 물을 채우기. 테이블에 양동이를 놓고 조명은 그림자와 눈부심을 최소화하기 위해 설정되어 있는지 확인하려고합니다.
- 추적 소프트웨어를 사용하는 경우, 직접 오버 헤드 버킷의 카메라를 배치합니다.
- 소프트웨어를 설정 마우스가 화면에 쉽게 볼 수 있도록.
4.2) 적응도 및 테스트
- 행동 소유주에 실험 쥐를 이동검사 전 OM 1 시간은 주변 환경을 적응한다. 순응에 대한 자신의 새장에 마우스를 둡니다.
- 테이프에 카메라 행동 작업을 켭니다. 조심스럽게 물 물통의 중간에 마우스를 배치했다. 마우스를 떨어 뜨리지 않도록해야합니다. 천천히 마우스를 내려 전면 발을 먼저 물에 접촉하도록. 잠수에서 자신의 머리를 방지하기 위해주의해야합니다.
- 6 분 동안 타이머를 설정하고 행동 영역에서 멀리 단계.
- 6 분가되면, 버킷에서 마우스를 제거하고 자신의 새장에 다시 마우스를 배치하기 전에 물기를 닦아 낸다.
4.3) 점수
- 수영 대 떠있는 시간을 정량화, (기본 설정해야합니다) Noldus에 의해 제안 추적 소프트웨어를 사용하는 경우, 11 % %의 부동을 설정합니다.
- 추적 시스템을 사용하여 정량화하기 위해, 분석 탭으로 이동 및 분석 프로필에서 이동을 클릭합니다. 에, 현재 설정되어있는 카테고리를 삭제하고 이동 상태를 선택(개인 행동 아래) 왼쪽 패널. 11 %로 부동을 설정합니다.
- 결과 탭에서, 트랙 시각화를 선택합니다. 결과를 볼 수있는 (결과 탭에서) 분석 출력을 선택합니다. 각각의 재판이 나타납니다 시간을 나열하는 표는 움직이지 보냈다.
- 손 채점 경우, 마우스가 마우스가 움직이지 소비 시간의 수영이나 등산, 그리고 양을 소비 한 시간을 측정한다. 또한, 처음에 움직 레이턴시를 측정한다. 결과 섹션에서 그림 2를 참조하십시오.
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Representative Results
정확한 정위 주입 올바른 좌표를 설정하는 방법에 크게 의존. 바이러스를 주입하기 위해 사용되는 바늘의 팁은 브레 그마의 교차점 간가 라인 (도 1)에 직접적으로 설정되어야한다. 이것은 바늘이 올바르게 배치되어 있는지의 여부를 확인하기 위해 실체 현미경을 사용하는 것이 도움이된다. 현미경으로 보면 바이러스가 주입 된 경우, 그것이 브레 그마의 교차점 간가 라인에 바로 도착 해 지도록, 바늘이 배치되어야한다. 즉, 주사기 바늘의 구멍에 직접 교차 위에 배치되어야한다. 본 연구에서는 RBM8a, 엑손 접합부 복잡 핵심 인자에 대하여의 shRNA를 발현하는 렌티 바이러스는, 치아 이랑에 주입 하였다. 렌티 바이러스는 감염된 신경에 레이블 RFP를 표현한다. (2)는 적색 신호 (도 3)으로 표시된 바와 같이 바이러스 정확한 영역에 주입 된 것을 보여준다.
행동 작업의 중요성을 달성하기 _content은 ">, 표본의 크기는 그룹 당 12 ~ 15 마우스에 이르기까지 다양합니다. 행동 작업 2 주 정위 주사 한 후 실시 할 수있다. 공정 거래 청에서, 불안 표현형이 존재하는 쥐에서 훨씬 적은 시간을 보내는 경우 대조군에 비해 열기 필드의 중심. 결과는 성인 쥐의 치아 이랑의 RBM8a의 최저를 나타냅니다 불안 행동 (P <0.05, 그림 4)에 연결됩니다. FST에서 부동의 관측 차이가 없었다 제어 및 치아 이랑의 RBM8a 최저 안티 우울증 행동 (그림 5)에 영향을주지 않음을 시사 실험 쥐. 사이에 통계 분석은 두 개의 꼬리, 두 샘플 불평등 분산 t 검정을 수행하는 구성되었다.
그림 1 : 브레 그마 및 간 교차청각은 라인. 정위 주사제, 주사기 바늘은 브레 그마의 교차점 간가 라인 늘어서한다. 이 점에 제로로 설정된다.
그림 2 : 계략도 전체 실험에 대한 타임 라인.
치아 이랑에 바이러스의 성공적인 주사를 보여주는 대표적인 뇌 조각 스케일 바 = 100 μm의 그림 3..
그림 4 :. 제어 및 소설 오픈 필드의 중심에서 소비 된 실험 쥐가 실험 쥐 signif 보내는 시간의 양불안 표현형을 나타내는 경기장의 중앙에 icantly 적은 시간 (N = 9-11, *, T (18) = -2.72, P <0.05, 평균 SEM)
그림 5 :. 제어 및 실험 쥐가 FST에서 움직이다 시간의 양 실험 쥐가 움직이지 보낸 시간의 컨트롤 다르지 않다 (N = 9.11 = 1.25 T (18), P> 0.05, 평균 SEM)
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Discussion
성공적인 정위 주사는 세 가지 요소에 의존 : 바늘 (팁, 살아 마우스를 유지 (브레 그마의 교회법 및 간가 줄에 바늘의 끝을) 좌표에 대한 올바른 원점 설정, 영점에 대한 권리 깊이를 설정 다만) 뇌 조직의 외관을 터치. 마우스의 생존 능력은 중요하다. 수술 생존율은 마우스가 제대로 마취 적절한 진통제를 수신되어 있는지 확인하여 도움을받을 수 있습니다. 통증 수술 후 회복 나쁨의 주요 원인으로 알려져있다. 마우스는 완전히 수술 내내 마취 보장 (이것은 다리 핀치에 반응하지 않아야) 및 진통제의 정확한 투여 량을 제공 생존 도와야한다 (마우스의 중량 기준). (17)는 또한 마우스에서 유지되어야 수술 과정에 걸쳐 가열 패드 그것은 마취에서 깨어 났을 때까지. 그들이 마취 때 마우스는 체온을 조절 할 수 없다. 몸의 성질ature은 수술 과정에서 크게 떨어질 것이다. 정위 수술의 길이가 상대적으로 짧은 비록, 저체온증 심각 마우스의 생존을 손상시킬 수 있습니다. 적절한 봉합 기술은 성공적인 수술을 수행하는 수단이있다. 마우스는 봉합에 선택하려고합니다, 그래서 상처에 너무 많은 긴장을 넣어 같이 너무 꽉 봉합 제거를 방지하기 위해 충분히 꽉 있는지 확인하는 것이 중요하다, 그러나. 각 스티치에 네 개의 매듭은 마우스가 봉합사를 제거 할 수 없음을 확인해야합니다. 열린 상처에 부정적인 어떤 행동 실험에 영향을 미치는 감염에 대한 감수성 증가로 적절한 봉합이 중요하다.
OFT는 운동과 생쥐의 불안 표현형을 평가하기위한 행동 패러다임이다. 마우스의 동작을 테스트 할 때, 마우스를 처리하고 경기장을 설정할 때 조심해야하는 것이 중요하다. 공정 거래 청에서, 패러다임은 마우스의 우려 갔지 페어링 설계N 자연 호기심, 새로운 환경에 배치하고 참신을 탐구하고자. 야생형 마우스는 처음에 더 취약 열기 필드의 중심을 입력 주저하지만, 결국 인해 타고난 호기심에, 그렇게 할 것입니다. 불안 마우스에 더 취약 공간 (필드의 중심을) 건너의 우려는 자연 호기심과 중심에서 소비 훨씬 적은 시간을 초래할 것이다, 탐구하는 욕망보다 더 큰 것입니다. 확인 패러다임이 제대로 작동하는지 확인하기 위해, 오픈 필드 이외의 요인과 관련된 스트레스를 최소화하는 것이 중요하다. 스트레스는 마우스 행동 방 (따라서 외부 환경이 가능한 교란 변수 아니다)에 적응하게하고, 이전의 마우스와 연관된 모든 냄새가 제거되었음을 보장 생쥐 사이 필드를 세정함으로써 최소화 될 수있다. (18) 잘못에 의해 발생하는 차이를 제거하는 데 도움이해야 다음 단계 하역장NG 마우스. 본 연구에서는 RBM8a 최저 마우스 컨트롤에 비해, 새로운 오픈 필드의 중앙에 훨씬 적은 시간을 보냈다. 쥐들은 대조군에 비해, 더 취약 신규 오픈 필드의 중간 들어갈 꺼려하기 때문에 이것은, 불안 표현형을 나타낸다.
FST는 마우스에서 항 우울 표현형을 조사하고자한다. 물 한 양동이에 배치 할 때, 수영 대 부동 훨씬 적은 시간을 보내고 마우스 항 우울 표현형을 갖는 것으로 간주된다. 강제 수영 시험에서 부동 (예 포기) 행동 절망하는 것으로 해석된다. 이 패러다임은 항우울제 치료에 의해 검증된다. 항우울제가 훨씬 적은 시간을 보낼 것입니다받을 7,8,9 마우스는 항 우울 표현형 나타내는 컨트롤에 비해 부동. 본 연구에서는 RBM8a 최저 마우스는 크게 움직이지 소요 된 시간에 제어 마우스에서 차이가 없었다. 티의 성인 쥐의 치아 이랑의 RBM8a 최저은 우울증, 또는 항 우울 표현형을 유도하지 않음을 나타냅니다. 우리의 이전 연구에서, 성인 쥐의 치아 이랑의 RBM8a 과발현이 크게 방지 우울 효과를 나타내는 컨트롤에 비해 시간 움직이지를 감소시킨다. (16)
이 논문에서 표현에 사용되는 정위 주사는 치아 이랑을 대상으로 하였다. 관심있는 유전자는 고도로 성인 마우스에서이 표현되기 때문에, 치아 이랑은, 목표 부위로 선정 하였다. 또한, 치아 이랑 우울증 및 불안과 연관되었다. 예를 들어, 한 연구는 선택적으로 지느러미 또는 복부 치아 이랑 하나로 과립 세포를 활성화 POMC-Chr2 생쥐를 사용했다. 지느러미와 복부 양쪽 치아 이랑의 활성화는 불안의 치아 이랑의 잠재적 인 역할을 나타내는, 새로운 환경의 증가 탐사되었다. (19) 다른 연구장애인 신경과 그 쥐. 우울증 표현형을 나타내는 FST에서 부동 증가했다 (20)는 또한, 전뇌에 AP 통신의 OA (1)의 활성화가 항 우울 FST의 효과, 참신 억제 먹이, 자당 소비 테스트에 이르게 발견했다. VEGF는 AP 통신의 OA 1의 치아 이랑의 노크 다운이 때,이 항 우울 표현형 (21)이 데이터는 치아 이랑은 불안과 우울증의 병태 생리에 중요한 역할을 가지고하는 것이 좋습니다. 잃고, 치아 이랑이 될 수 있음을 나타내었다 좋은 지역은 우리의 유전 적 변조 및 행동 실험 대상으로. 치아 이랑의 모든 세포가 감염 될 수 있도록 만 분할 셀 (레트로 바이러스)와 달리 렌티 바이러스는 특히 사용 하였다.
바이러스의 사양에 주입 될 수 있기 때문에 (다른 행동 작업에 더하여) 이들 세 실험 디자인의 조합은 생쥐에서 행동 적 표현형을 평가하는 신규 한 방법이다특정 발달 시간에 IC 뇌 영역입니다. 행동 작업과 짝을 렌티 바이러스의 정위 주사를 사용하여 만 완료하는 데 몇 개월이 소요 연구자가 특정 뇌 영역에서 유전자 발현의 행동 효과에 예비 데이터를 수집 할 수 있습니다. 반면에, 조건부 녹아웃 마우스는 자주 발생하는 년이 걸릴. 또한, 바이러스의 세포 유형 선호도 더 세포를 표적으로 할 수있다. 예를 들어, 레트로 바이러스 만 렌티 바이러스는 모든 세포 유형을 감염시키는 반면 (예를 들면 치아 이랑에서 신경줄 기세포와 같은) 셀 분할 감염시킬 수있다. (22, 23)을 따라서 함께 공동 주입,이 널리 사용되며, 개별적으로 검증 실험 프로토콜은 빠른 제공 그러나 광범위한 방법은 마우스 동작에 타겟팅 뇌 영역에서 특정 유전자의 역할을 테스트한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
References
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