Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.
Multipel sklerose er en inflammatorisk demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet kendetegnet ved plakdannelse indeholdende tabte oligodendrocytter, myelin, axoner og neuroner. Remyelinering er et endogent reparation mekanisme, hvorved nye myelin er produceret efter spredning, rekruttering og differentiering af oligodendrocyt præcursorceller i myelin-dannende oligodendrocytter, og er nødvendig for at beskytte axoner fra yderligere skader. I øjeblikket alle terapeutiske midler til behandling af multipel sklerose målrette afvigende immunkomponent af sygdommen, som reducerer inflammatoriske tilbagefald, men ikke forhindre progression til irreversibel neurologiske tilbagegang. Derfor er det bydende nødvendigt, at remyelinering-fremmende strategier udvikles som kan forsinke sygdommens progression og måske vende neurologiske symptomer. Adskillige dyremodeller for demyelinisering findes, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis og curprizone; der er imidlertid begrænsninger i deres anvendelse til at studere remyelinisering. En mere robust fremgangsmåde er omdrejningspunktet injektion af toksiner i det centrale nervesystem, herunder vaskemiddel lysolecithin i rygmarven hvide substans i gnavere. I denne protokol, viser vi, at den kirurgiske procedure er involveret i at injicere lysolecithin i den ventrale hvide substans af mus er hurtig, omkostningseffektiv, og kræver ingen yderligere materialer end dem, der er kommercielt tilgængelige. Denne procedure er ikke kun vigtigt for at studere de normale begivenheder involveret i remyelinering processen, men også som en præ-klinisk redskab til screening af kandidat remyelinering-fremmende lægemidler.
Multipel sklerose (MS) er en kronisk demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet (CNS), kendetegnet ved immun celleinfiltration og plaques indeholdende tabte myelin, oligodendrocytter, axoner og neuroner. De fleste patienter har en sygdomsforløb, der består af inflammatoriske tilbagefald ledsaget af en lang række af neurologiske symptomer, efterfulgt af perioder med remission. Over halvdelen af disse patienter med tiden overgang til en sekundær progressiv scene med nogen åbenbare attakker, men løbende neurologisk tilbagegang. Det menes, at denne gradvise forværring skyldes aksonal skader og tab, bidrog delvist af kronisk demyelinisering. Strategier til at genoprette tabte myelin således betragtes som en lovende behandling tilgang til at forsinke sygdommens progression og måske vende neurologiske symptomer.
Remyelinering er et endogent reparation respons i CNS, hvorved nye myelinskeder genereres fra rekrutteret oligodendrocyt precursorceller(OPCs), der differentierer til myelin-dannende oligodendrocytter. Remyelinering er blevet vist i dyremodeller for at være ganske robust 1-3, men dens effektivitet falder med alderen 4. Faktisk forekommer remyelinering hos mennesker, selv om det er ufuldstændig i de fleste MS-patienter 5. Alle aktuelt tilgængelige medicin for MS primært rettet mod afvigende immun komponent i sygdommen og, mens effektiv til at reducere tilbagefald, ikke markant forsinke sygdommens progression. Den næste generation af terapeutiske strategier for forvaltning af MS vil integrere fremskridt i immunmodulering med fremme af eget remyelinering for at forhindre både tilbagefald og progression 6.
En metode til at studere de- og remyelinering i CNS involverer direkte injektion af detergent lysophosphatidylcholin (lysolecithin) ind i rygmarven hvide substans 1,3,7. Denne procedure frembringer en velkarakteriseret demyelinating skade består hovedsagelig af makrofag / mikroglial infiltration og aktivering 8,9, reaktiv astrogliose, forstyrrelse af axonal homeostase / axonal skade, og OPC proliferation og migration 10. Læsionen forudsigeligt udvikler sig i periode på et par uger, og er i sidste ende i stand til fuldt remyelinating. Denne metode har været særligt nyttig i at studere koreografi af begivenheder, der er involveret i de- og remyelinisering. Endvidere er det blevet vedtaget som et redskab til præklinisk afprøvning af kandidat behandlingsformer at fremskynde reparation efter en demyeliniserende fornærmelse.
Der er udviklet en række dyremodeller for at studere MS, mest genkendeligt den eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) model. I EAE er gnavere immuniseres mod et fragment af et myelin-peptid og undergår inflammatorisk læsion udvikling manifesterer sig i stigende paralyse. Mens denne model har været nyttige i præklinisk afprøvning af immunmodulerende MS narkotika, er det ikke ideelt til at studere remyelinering tre årsager: For det første, placeringen af inflammatoriske læsioner er noget tilfældigt, og lokalisere læsioner, når de behandler væv til letmælk eller ultratynd sektioner kan være udfordrende. Den anden er, at remyelinering sker over et bestemt tidsforløb, og den nøjagtige alder af en enkelt EAE læsion kan ikke være kendt uden løbende ikke-invasiv magnetisk resonans. Den tredje er, at remyelinering er et naturligt forekommende fænomen i gnavere, og bevis for remyelinering efter narkotikabehandling i EAE kan ikke være en primær resultat af lægemidlet, men istead en sekundær fænomen reducere inflammation.
En anden almindelig fremgangsmåde til fremstilling af demyelinisering opnås ved at indføre kobber chelator cuprizone i kosten. Dette resulterer i udbredt demyelinisering, især i corpus callosum. Der er begrænsninger i at studere hjernebjælken som en lokalitet af remyelinisering af følgende grunde: For det første, Axon diametre (og dermed myelin tykkelse) er mindre end andre CNS-regioner, og dermed tyndt remyelinated skafter kan være til at skelne fra dem, der var aldrig demyeliniserede. For det andet, fordi mus corpus callosum indeholder> 70% umyelinerede axoner 16, kan det være uklart, om en remyelinated segment er sandt reparation af beskadiget myelin eller de novo myelin syntese i den voksne, som normalt forekommer 17.
Det er vores overbevisning, at den bedste model til at studere remyelinering er den direkte indsprøjtning af toksiner, enten lysolecithin, ethidiumbromid, eller andre, ind i de caudale cerebrale stilke 18 eller rygmarven hvide substans. Den tidligere placering opnås kun ved præcis 3-dimension stereotaktisk injektion, og er begrænset til større gnavere (rotter) på grund af den lille størrelse af de cerebellare stilke. Dette udelukker den omfattende ressource af transgene mus i at studere de- og remyelinisering. Rygmarven indeholder imidlertid mange store hvide substans skrifter, der er let tilgængelige kirurgisk. Mellemrum mellem ryghvirvler i rostrale thorax segment tillader eksponering af rygmarven uden behov for en laminektomi, som er et nødvendigt skridt i kaudale thorax kirurgiske procedurer. En fordel ved specifikt rettet den ventrale hvide substans er, at axoner er ensartet større end den dorsale hvide substans, hvilket gør kvantificering af remyelinering en mindre tvetydig opgave-ligner de udfordringer, der er forbundet med corpus callosum. Derudover ventrale hvide substans udgør en meget større tArget område at injicere; flere hundrede mikrometer sideværts i den dorsale region ville placere kapillarrøret uden søjlen, mens den samme afvigelse ventralt stadig ville frembringe en fremtrædende demyeliniserende læsion. Nogle protokoller injicere lysolecithin i både ryg og ventrale kolonner af samme dyr 19. Dette kan øge både sandsynligheden for korrekt kapillær placering og antallet af kvantificerbare læsioner i færre dyr. Mens de aktuelle data er fra 8-10 uger gamle dyr på tidspunktet for operation, har vi også haft succes efter samme procedure på 8-10 måneder gamle mus, hvor remyelinering er beskrevet som værende markant langsommere 4.
Kvantificering af remyelinering er ikke en triviel virksomhed. Et centralt dogme postulerer, at remyelinated segmenter er kortere i længden og tyndere i gennemsnit end deres sunde modstykker, og dermed g ratio beregninger (Axon diameter divideret med Axon + myelin diameter) af tværsnit semi- or ultratynde sektioner er blevet standard procedure. Imidlertid er det kendt, at remyelinated segmenter fortykkes over tid 2 og en nylig undersøgelse ved anvendelse af en transgen reporter remyelinating oligodendrocytter antyder, at mange staengelled sidste ende blive skelnes fra kontrollen 20. Kvantificerer antallet af modne oligodendrocytter inden læsionen er en indirekte måde at måle reparation, da oligodendrocytter er i stand til at gøre en lang række internodier, og en betydelig del af remyelinering-afhængig af modellen anvendte-kan forekomme fra Schwann celler 3. Selvfølgelig, som remyelinering har været forbundet med restaurering af saltatory ledning 21, ville den ultimative metriske reparation være funktionel genopretning af neurologiske underskud. Mens remyelinering har været forbundet med inddrivelse af funktion i nogle arter 22,23, er det ikke blevet en standard procedure i murine lysolecithin studier. Dette er sandsynligvis på grund af en mangel på åbenlys observstand underskud fra enten dorsale eller ventrale læsioner sammenlignet med mere robuste demyeliniserende modeller som EAE og endda cuprizone. Vi mener, at funktionelle mangler som følge af lysolecithin injektion, og efterfølgende opsving med remyelinering, kun vil være iagttages ved hjælp af følsomme test af fine sensomotoriske funktion.
En PubMed søgning af "remyelinering" ved siden en af dyremodeller, der er anført ovenfor, omend en brysk metodisk tilgang, viser færre søgning hits til lysolecithin (109) sammenlignet med EAE (188) og cuprizone (197). Hvis vores argument, at lysolecithin demyelinisering er den overlegne metode til at studere remyelinering, hvorfor er det den mindst diskuteret? Måske en ængstelse for at bruge denne metode bygger på en tro på tekniske vanskeligheder med at udføre den kirurgiske operation. I virkeligheden er denne procedure er hurtig, omkostningseffektiv, og er ikke sværere end rutinemæssig væv dissektion, der kræver materialer, der alle inducielt tilgængelige. Det er vores håb, at denne protokol viser sig nyttigt for dem, der ønsker at tilføje denne kraftfulde model til deres repertoire til at studere spændende og voksende område af myelin reparation.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates – Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates – Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
clippers | Philips | QG3330 | |
heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
surgical tape | 3M | 1527-1 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
scalpel blade | Feather | No. 15 | |
sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
32 gauge metal needle | BD | 305106 | |
needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit |
priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
cryostat | Leica | CM1900 | |
microscope slides | VWR | 48311-703 | |
bright field microscope | Olympus | BX51 | |
ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
goat serum | Sigma | G9023 | |
Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2000 dilution |
Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
PBS | Oxoid | BR0014 | |
isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
ketamine | CDMV | ||
xylazine | CDMV | ||
iodine | West Penetone | 2021 | |
Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
sucrose | Sigma | S5016 | |
Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
horse serum | Sigma | H0146 | |
glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
corn oil | Sigma | C8267 | |
polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
glycerol | Sigma | G9012 | |
cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
Recipes | |||
Eriochrome cyanine solution | |||
Ingredient | Amount to add | ||
Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
sulfuric acid | 400 mL 0.5% | ||
iron(III)chloride | 20 mL 10% | ||
water | 80 mL | ||
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
Gelvatol | |||
Ingredient | Amount to add | ||
PBS | 140 mL | ||
polyvinyl alcohol | 20 g | ||
glycerol | 40 g | ||
*mix well, place at 37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes |