Abstract
Multipel sklerose er en inflammatorisk demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet kendetegnet ved plakdannelse indeholdende tabte oligodendrocytter, myelin, axoner og neuroner. Remyelinering er et endogent reparation mekanisme, hvorved nye myelin er produceret efter spredning, rekruttering og differentiering af oligodendrocyt præcursorceller i myelin-dannende oligodendrocytter, og er nødvendig for at beskytte axoner fra yderligere skader. I øjeblikket alle terapeutiske midler til behandling af multipel sklerose målrette afvigende immunkomponent af sygdommen, som reducerer inflammatoriske tilbagefald, men ikke forhindre progression til irreversibel neurologiske tilbagegang. Derfor er det bydende nødvendigt, at remyelinering-fremmende strategier udvikles som kan forsinke sygdommens progression og måske vende neurologiske symptomer. Adskillige dyremodeller for demyelinisering findes, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis og curprizone; der er imidlertid begrænsninger i deres anvendelse til at studere remyelinisering. En mere robust fremgangsmåde er omdrejningspunktet injektion af toksiner i det centrale nervesystem, herunder vaskemiddel lysolecithin i rygmarven hvide substans i gnavere. I denne protokol, viser vi, at den kirurgiske procedure er involveret i at injicere lysolecithin i den ventrale hvide substans af mus er hurtig, omkostningseffektiv, og kræver ingen yderligere materialer end dem, der er kommercielt tilgængelige. Denne procedure er ikke kun vigtigt for at studere de normale begivenheder involveret i remyelinering processen, men også som en præ-klinisk redskab til screening af kandidat remyelinering-fremmende lægemidler.
Introduction
Multipel sklerose (MS) er en kronisk demyeliniserende sygdom i centralnervesystemet (CNS), kendetegnet ved immun celleinfiltration og plaques indeholdende tabte myelin, oligodendrocytter, axoner og neuroner. De fleste patienter har en sygdomsforløb, der består af inflammatoriske tilbagefald ledsaget af en lang række af neurologiske symptomer, efterfulgt af perioder med remission. Over halvdelen af disse patienter med tiden overgang til en sekundær progressiv scene med nogen åbenbare attakker, men løbende neurologisk tilbagegang. Det menes, at denne gradvise forværring skyldes aksonal skader og tab, bidrog delvist af kronisk demyelinisering. Strategier til at genoprette tabte myelin således betragtes som en lovende behandling tilgang til at forsinke sygdommens progression og måske vende neurologiske symptomer.
Remyelinering er et endogent reparation respons i CNS, hvorved nye myelinskeder genereres fra rekrutteret oligodendrocyt precursorceller(OPCs), der differentierer til myelin-dannende oligodendrocytter. Remyelinering er blevet vist i dyremodeller for at være ganske robust 1-3, men dens effektivitet falder med alderen 4. Faktisk forekommer remyelinering hos mennesker, selv om det er ufuldstændig i de fleste MS-patienter 5. Alle aktuelt tilgængelige medicin for MS primært rettet mod afvigende immun komponent i sygdommen og, mens effektiv til at reducere tilbagefald, ikke markant forsinke sygdommens progression. Den næste generation af terapeutiske strategier for forvaltning af MS vil integrere fremskridt i immunmodulering med fremme af eget remyelinering for at forhindre både tilbagefald og progression 6.
En metode til at studere de- og remyelinering i CNS involverer direkte injektion af detergent lysophosphatidylcholin (lysolecithin) ind i rygmarven hvide substans 1,3,7. Denne procedure frembringer en velkarakteriseret demyelinating skade består hovedsagelig af makrofag / mikroglial infiltration og aktivering 8,9, reaktiv astrogliose, forstyrrelse af axonal homeostase / axonal skade, og OPC proliferation og migration 10. Læsionen forudsigeligt udvikler sig i periode på et par uger, og er i sidste ende i stand til fuldt remyelinating. Denne metode har været særligt nyttig i at studere koreografi af begivenheder, der er involveret i de- og remyelinisering. Endvidere er det blevet vedtaget som et redskab til præklinisk afprøvning af kandidat behandlingsformer at fremskynde reparation efter en demyeliniserende fornærmelse.
Protocol
BEMÆRK: De anvendte dyr i denne procedure blev plejet i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care (CCAC) retningslinjer. Etik er blevet godkendt af Animal Care udvalg fra University of Calgary.
1. Forbered injektionssprøjte
- Opløs lysolecithin til en 1% opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4) og opbevares ved -20 ° C i små portioner (75 pl). Optø et hætteglas til stuetemperatur.
NB: hvis lysolecithin er uopløst, sonikeres røret i en ultralydsrenser (40 kHz) i ca. 30 minutter til dannelse af en ensartet opløsning. - Håndter forhånd trukket glas kapillar med ekstrem forsigtighed for at undgå at beskadige den fine spids. Skru møtrikken af en 10 pi injektionssprøjte og tråd det på den flade ende af kapillarrøret efterfulgt af 2 kapper, der sikrer, at de samvirkende ender af ferulerne tilpasse og kapillarrøret er etuiet i den koniske rørring (figur 1). Skyl sprøjten med isopropyl alkohol og fjerne stemplet. Når tør, skru nålesamlingen hånd stramt på injicere sprøjten.
- Sæt metal hub nål til priming sprøjten. Pierce en gummiskive med nålen, og skub den ned til bunden. Fyld priming sprøjte med lysolecithin. Forsigtigt nedtrykke priming sprøjten, indtil væsken er synlig på spidsen af nålen. Dette sikrer luftbobler ikke føres ind i injektionssprøjte.
- Sæt metal hub nål af priming sprøjten i intravenøse sprøjten. Realiseringen af et fast forsegling med gummiskive, træd langsomt priming sprøjten indtil kapillarrøret fylder til spidsen med løsningen. Fjern forsigtigt priming sprøjten samtidig nedtrykning at fylde cylinderen af injektionssprøjte uden at indføre luftbobler. Indsæt stemplet i injektionssprøjte og sikre opløsning strømmer fra spidsen af kapillaret som stemplet forsigtigt nedtrykkes.
BEMÆRK: Hvis der er luftbobler er synlige i hættenIllary eller injicere sprøjten, skal præparatet sprøjten gentages fra begyndelsen. Kontinuerlig væske i Indsprøjtningsanordningen det er afgørende for at sikre nøjagtige injektionsvolumener. - Vedhæft det udfyldte injicere sprøjten til armen af en stereotaktisk mikromanipulator. Dette afsluttede apparat vil være i stand til at injicere 15-20 dyr, før det skal genopfyldes.
- Kassér resterende lysolecithin fra priming sprøjten. Træk og tryk isopropylalkohol flere gange, og tag metal hub nål. Vent flere timer for den resterende isopropylalkohol i priming sprøjten til at fordampe før påfyldning igen.
2. Forbered Animal for Kirurgisk Procedure
BEMÆRK: Denne procedure er beskrevet for kvindelige C57BL / 6 mus i alderen 8-10 uger.
- Bedøve dyr med en intraperitoneal injektion af ketamin (200 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) eller pr institutionelle dyreplejepraksis regler. Plan fordyr at være under anæstesi i ca. 1 time, hvis der anvendes injicerbar anæstesi.
- Test, at dyret er dybt bedøvet ved fast klemme foden. En korrekt bedøvet dyr reagerer ikke på smerten.
- Brug neglesaks, barbere en 2-3 cm 2 område på den dorsale side af dyret, tæt til ørerne. Pas på ikke at beskadige ørerne.
- Tør området rent med 70% ethanol anvendes til en gaze. Sikre alle klippet hår er blevet fjernet fra området. Desinficer området med jod.
- Anvend vaseline til øjnene for at forhindre udtørring hele proceduren.
- Hold dyret i en opvarmet recovery kammeret, indtil klar til at begynde proceduren.
3. Udfør den kirurgiske procedure
BEMÆRK: Sørg for tilstrækkelig aseptisk teknik til alle trin i proceduren. Dette omfatter korrekt brug af handsker, hårnet, masker og gardiner. Alt værktøj skal steriliseres før kommer i contact med dyret.
- Flyt dyret til en stereotaktisk ramme, dorsale side op, forhøjet ved midtersektionen af foldede papirhåndklæder at overdrive krumning af rygsøjlen. Fastgør arme og hale med kirurgisk tape og fastgør hovedet med en tand klemme. Stabiliserende øre barer er ikke nødvendig for denne procedure.
- Brug en skalpel til at foretage en 3 cm midtlinjeincision, begyndende lige under ørerne og skære i haleretningen.
- Find kløft mellem de 2 store adipose strukturer og bruge fine pincet i hver hånd til at trække disse fra hinanden. Spred retraktorer at åbne det kirurgiske område.
- Under en kirurgisk mikroskop, find den fremtrædende udvækst processen med T2 ryghvirvel (Bemærk: Denne funktion er karakteristisk for C57BL / 6 mus stamme). Udfør en stump dissektion med lukkede foråret saks gennem overliggende muskulatur bedre at visualisere T2. Ved hjælp af pincet, føler for de hårde overflader af T3 og T4 for at bekræfte korrekt anatomisk placering.
- Bruge foråret saks, gør lavvandede laterale udskæringer (2-3 mm dyb) af bindevævet mellem T3 og T4. På grund af naturlig afstand mellem hvirvlerne i den øvre thorax del af muse rygsøjlen, en laminektomi er ikke nødvendigt at afsløre rygmarven. Vær opmærksom på, at for dybt et snit vil gennembore og beskadige ledningen.
BEMÆRK: En lille grad af blødning er almindelig under dette trin. Hvis dette sker, skal du holde en svamp spyd ind i området, indtil blødningen aftager (30-60 sek). - Visualiser rygmarven. Den vil blive dækket med et tykt lag af synlige dura hvis meningeal lag endnu ikke blev skåret mens udsætter ledningen. En fremtrædende blodkar løber caudale / rostralt gennem den omtrentlige midterlinjen af rygmarven.
BEMÆRK: Denne kar bør ikke anvendes som et vartegn for midterlinjen. I stedet bør tilstrækkelig belysning afsløre den grå-hvide substans grænser flankerer dorsale kolonne, og disse bør anvendes til at estimere midterlinjen. - Hvis duraforbliver intakt, gør blide laterale skrammer med en 32 G metal nål, indtil det er ryddet. Målet er at fjerne dura mens ikke skære de resterende underliggende meninges, som ikke er så tyk og sværere at se.
BEMÆRK: Frigivelse af cerebrospinalvæske indikerer et brud på arachnoid og mens dette kan ske uden mekanisk skade på vævet, skal den akkumulerede cerebrospinalvæske fjernes med en svamp spyd bedre at visualisere overfladen af ledningen. - Flyt injektionssprøjte på plads, og langsomt sænke den, indtil spidsen af kapillaret lige knap rører rygmarven umiddelbart lateral af hver side af midterlinjen. Lås armen på plads.
- Brug sorterede målinger af Z-retningen stereotaktisk arm til at gøre en baseline position måling. Fra denne læsning, trække 1,3 mm. Brug en hurtig og overfladisk nedadgående bevægelse til at gennembore vævet og sænk derefter forsigtigt kapillarrøret indtil den nye måling er nået. Valgfrit: Hvis det ønskes,læsioner i den dorsale kolonne kan fremstilles af den samme piercing bevægelse ved midterlinjen og en dybde på 0,3 mm (se diskussion for mere information).
BEMÆRK: Disse værdier er specifikke for indsprøjtning mellem T3 og T4. Hvis vælger at udføre injektionen på ethvert andet sted i rygmarven, skal disse værdier afledes alle tilgængelige mus hjernen atlas. - Brug mikromanipulator trykket lysolecithin i den ventrale rygmarv hvid substans. Lav 1 rotation af mikromanipulator hver 5 sek til 2 min, hvilket resulterede i et endeligt volumen på 0,5 pi. Lad kapillær på plads til 2 ekstra minutter til at forhindre tilbagestrømning af opløsning, og derefter forsigtigt fjerne kapillarrøret.
- Bind en enkelt sutur i musklen / fedtvæv overlejre rygsøjlen. Brug en ikke-afbrudt sutur for at lukke huden. Påfør mere jod til incisionssted.
- Placer dyret i en opvarmet opsving kammer indtil den genindvinder, derefter returnere det til sit bur. Anvend analgetika postoperativt pr institutionelle dyreplejepraksis regler. Yderligere postoperativ pleje er normalt ikke nødvendigt, da dyrene er fuldt ambulant og i stand til selv-fodring og drikke, så snart de restitution fra anæstesi.
- Gentag proceduren for de resterende dyr.
BEMÆRK: Med sprogfærdighed, operationen kan være afsluttet i 10-15 min pr dyr, især med hjælp fra en anden person, binde suturer. Det samme glaskapillar kan anvendes til 15-20 operationer før spidsen bliver sløv og skal udskiftes. Kontrol operationer kan udføres på samme måde som beskrevet med en injektion af PBS i rygmarven stedet for lysolecithin. Vi anbefaler ikke at rense kapillærerne til fremtidig brug.
4. Tissue behandling og analyse
- Sacrifice dyrene med en intraperitoneal overdosis af ketamin (500 mg / kg) og xylazin (25 mg / kg) på ønskede tidspunkter. Læsioner typisk udvikler sig i follgrund måde: 1-3 dage, aktiv demyelination; 3-7 dage, OPC rekruttering; 7-10 dage, oligodendrocyt differentiering; 10-21 dage, aktiv remyelinering 2,10,11.
- For at fremstille væv til histologi, først udføre en transcardial perfusion 12 med 20 ml RT PBS efterfulgt af 20 ml iskold 4% paraformaldehyd i PBS. Til fremstilling af harpiks indlejret væv til letmælk eller ultratynde sektionering, se trin 4.9.
- Fjern rygmarven hjælp buede ben saks til at klippe igennem hver ryghvirvler begynder ved cervikal ende af rygsøjlen og arbejder ned til den nedre thorax plan. Fastgør rygmarv O / N i 4% paraformaldehyd i PBS ved 4 ° C. Skift ledningerne til 30% saccharose i PBS ved 4 ° C i mindst 72 timer.
- Identificer injektionsstedet som en abnormitet på den dorsale overflade af rygmarven. Skær en 3 mm stykke væv (med injektionsstedet i midten) og ret brikkerne i cryomolds indeholder optimal skæring temperatur (OLT) compound. Suspender undersiden af cryomolds i en kølet blanding af 2-methylbutan og tøris, indtil OLT er helt frosset. Opbevares ved -80 ° C indtil den er klar til afsnittet.
- Afsnit de rygmarv på en kryostat med en bredde på 20 pm på objektglas og lad det lufttørre O / N før opbevaring dias ved -20 ° C.
- Detect læsion placering og størrelse ved hjælp af en eriochrome cyanin histologisk plet af myelin 13. Udfør alle trin ved stuetemperatur. Lufttørre slides i 30 minutter. Anbring objektglassene i klaringsmiddel i 1 min efterfulgt af rehydrering i graduerede ethanolopløsninger (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, vand) i 1 min hver.
- Anbring objektglassene i eriochrome cyanin opløsningen i 15 minutter, efterfulgt af en 1 min vask med vand. Differentiere 0,5% ammoniumhydroxid i 10 sek, efterfulgt af en 1 min vask med vand. Dehydrer i graduerede ethanolopløsninger (omvendt rækkefølge som beskrevet ovenfor) i 1 min hver, dækglas med montering medier og billede på en lys-field microscope.
- Brug immunhistokemi at visualisere axoner og myelin. Lufttørre slides i 30 minutter. Dehydrer med gradueret ethanol (vand, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) i 2 minutter hver ved stuetemperatur, og derefter omvendt rækkefølge tilbage til vand. Dette trin resulterer i større opløsning af individuelle myelin ringe 14.
- Blokere ikke-specifikke antistof-interaktioner under anvendelse af 10% gedeserum og 0,25% Triton X-100 i PBS i 60 minutter ved stuetemperatur. Fortynd primære antistoffer (muse-anti-SMI312 1: 2.000, kanin-anti-MBP 1: 1.000) i PBS og inkuberes på objektglas O / N ved 4 ° C.
- Vask 5 gange i 5 minutter med PBS ved stuetemperatur. Fortynd sekundære antistoffer (Alexa 488 anti-kanin 1: 500, Alexa 546 anti-muse 1: 500) i PBS og inkuberes på objektglas i 60 minutter ved stuetemperatur. Vask 5 gange i 5 minutter med PBS ved stuetemperatur. Mount glider med dækglas under anvendelse gelvatol og billede på et fluorescerende mikroskop.
- Brug immunhistokemi at visualisere celler af oligodendrocyt afstamning. Følg proceduren for step 4.7 udelade dehydrering / rehydrering trin, og under anvendelse af 10% hesteserum i stedet for gede-serum. Brug følgende primære antistof fortyndinger: gede-anti-PDGFRα 1: 100, muse-anti-CC1 1: 200, kanin-anti-Olig2 1: 200. Brug følgende sekundært antistof fortyndinger: Alexa 488 anti-goat 1: 500, Alexa 594 anti-muse-1: 500, Alexa 647 anti-kanin 1: 500.
- For at fremstille væv til letmælk eller ultratynd sektionering, først udføre en transcardial perfusion 12 med 20 ml RT PBS efterfulgt af 20 ml iskold 4% paraformaldehyd / 1% glutaraldehyd i PBS. Fjern rygmarven som beskrevet i trin 4.3. Fix O / N i 4% paraformaldehyd / 1% glutaraldehyd i PBS ved 4 ° C.
- Identificer injektionsstedet som beskrevet i trin 4.4. Skær en 1 mm stykke væv indeholdende injektionsstedet. Yderligere 1 mm blokke på hver side af læsionen kan fremstilles så godt, hvis det ønskes.
- I et stinkskab tilsættes 10 gange volumen 1% osmiumtetroxid / 1,5% kaliumferrocyanid til hver blok på isi 60 minutter.
BEMÆRK: osmiumtetroxid er et meget giftigt stof, og bør håndteres med største omhu. Alle materialer i kontakt med osmiumtetroxid bør placeres i majsolie (to gange volumen som osmiumtetroxid opløsning) til neutralisation. - Vask snore 3 gange med 0,2 M cacodylat i 10 minutter ved stuetemperatur, kasserer i majsolie. Dehydrer med graduerede ethanolopløsninger (vand, 50%, 70%, 90%, 2 gange med 95%, 2 gange med 100%, 2 gange med propylenoxid) i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Integrer snore i harpiks som pr fabrikantens instruktioner.
- Skær blokke på en ultramikrotom og montere sektioner på vand dråber på objektglas. Glassene anbringes på en varm plade (ca. 50 ° C), indtil tør.
- Visualiser myelin ved at tilsætte nogle dråber 1% toluidinblåt / 2% borax opløsning på dias i 10-15 sekunder ved 50 ° C. Skyl med vand, tør, og dækglas med montering medier. Billede sektioner på en lys-felt mikroskop.
Representative Results
Focal injektion af lysolecithin i den ventrale hvide substans frembringer en diskret demyeliniserende læsion, der kan påvises over en afstand på ca. 3 mm (figur 2). Immunhistokemisk farvning af læsionen kerne til myelin (MBP) og axoner (SMI312) viser axoner, der er blevet frataget myelin på 7 dage (figur 3). Med 14 dage, er mange axoner omgivet af MBP-positive ringe, hvilket tyder på forekomsten af remyelinisering. Farvning for celler af oligodendrocyt afstamning (PDGFRα, Olig2, CC1), er der en betydelig stigning i både det samlede antal celler ved 14 dage sammenlignet med 7 dage, samt fordelingen af modne oligodendrocytter i forhold til OPCs (figur 4) . I overensstemmelse med denne konstatering semithin snit farvet med toluidinblåt afsløre tilstedeværelsen af tynde myelinskeder 14 dage, der sjældent detekteres efter 7 dage (figur 5), hvilket indikerer, at disse remyelinated internodes.
Proceduren er meget reproducerbar mellem dyr. Variation opstår, når tung vejrtrækning ændrer den stationære position af kapillær-dette er normalt ikke et problem med tilstrækkelig sedation. Skader på axoner synes at være minimal, undtagen i centrum af læsionen, som er blevet beskrevet siden den tidligste brug af model 1. Vi mener, at dette er mekanisk skade fra glaskapillar, som det er også iagttages i PBS injiceret kontroller. Ikke desto mindre variation tendens til at være små, og vi og andre, der bruger en lignende procedure har opdaget forskelle mellem eksperimentelle betingelser med så få som 4 dyr pr gruppe 15.
Figur 1. Montering af injektionssprøjte. (A) møtrik injektionssprøjte er skruet på t han flade ende af kapillarrøret, efterfulgt af 2 feruler således, at deres parring ender interlock. Når kapillarrøret er fast etuiet i den koniske ferrule er samlingen skrues hånd stramt på enden af injektionssprøjte. (B) stykket centrum af en gummiskive med metallet hub nål fastgjort til priming sprøjten og glide ned til basen. (C) Træk lysolecithin opløsning i priming sprøjten. (D) trykkes forsigtigt priming sprøjten, indtil den første dråbe af lysolecithin er synlig på spidsen af nålen. (E) Sæt priming sprøjten ind i cylinderen af intravenøs sprøjte, hvilket gør en fast forsegling med gummiskive. Forsigtigt presse opløsningen, indtil den løber til ende af kapillarrøret. Trække forsigtigt priming sprøjten samtidig med at presset på stemplet for at fjerne metal hub nål uden at indføre luftbobler ind i injicere sprøjten.upload / 52679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. repræsentant lysolecithin læsion farvet med eriochrome cyanin. Serielle sektioner (anbragt 400 um hinanden) af et kendetegn lysolecithin læsion efter 14 dage farves med eriochrome cyanin at visualisere myelin (blå). Bemærk, at demyelinisering er begrænset til den ventrale hvide substans, og at læsionen spænder ca. 3 mm i rostral / caudale retning. Skala bar = 1 mm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. axoner og myelin iden lysolecithin model. (A) En sham (PBS) injiceret rygmarven efter 7 dage viser raske axoner der er omgivet af myelin ringe. (B) A lysolecithin læsion efter 7 dage viser blottet axoner samt forringet myelin. (C) ved 14 dage en Andelen af axoner (eksempler betegnet med hvide pilespidser) er forbundet med genetablering af myelin ringe. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. oligodendrocyt afstamningsceller i lysolecithin model. (A, C) 7 dage, er der en større repræsentation af PDGFRα + OPCs (hvide søjler) i forhold til CC1 + oligodendrocytter (magenta søjler); tallene i søjlerne repræsenterer procenter. Olig2 blev probet tilbekræfte farvning af oligodendrocyt afstamningsceller. (B, C) ved 14 dage er der en betydelig stigning i det samlede antal af oligodendrocyt afstamningsceller sammenlignet med 7 dage (p <0,05, to-halet t-test, n = 4 pr gruppe ). Der er også en betydelig stigning i fordelingen af oligodendrocytter til OPCs ved 14 dage i forhold til 7 dage (p <0,0001, Fishers eksakte test). Scale bar = 10 um. Hvert felt er fanget på en original forstørrelse på 60X. Værdier er middelværdi ± SD. * Betyder p <0,05. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. remyelinering i lysolecithin model. (A) et tværsnit toluidinblåt farves semithin sektion af ventrale hvide substans i en HEAlthy mus viser axoner over en bred vifte af kaliber med respektive myelin tykkelse. (B) efter 7 dage, manglende myelinskeder observeres støder op til en upåvirket område (nederst til højre). (C) ved 14 dage tyndt myelinerede kapper ( eksempler betegnet med røde pilespidser) fremgår hele læsionen, indikerer remyelinated segmenter. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Der er udviklet en række dyremodeller for at studere MS, mest genkendeligt den eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) model. I EAE er gnavere immuniseres mod et fragment af et myelin-peptid og undergår inflammatorisk læsion udvikling manifesterer sig i stigende paralyse. Mens denne model har været nyttige i præklinisk afprøvning af immunmodulerende MS narkotika, er det ikke ideelt til at studere remyelinering tre årsager: For det første, placeringen af inflammatoriske læsioner er noget tilfældigt, og lokalisere læsioner, når de behandler væv til letmælk eller ultratynd sektioner kan være udfordrende. Den anden er, at remyelinering sker over et bestemt tidsforløb, og den nøjagtige alder af en enkelt EAE læsion kan ikke være kendt uden løbende ikke-invasiv magnetisk resonans. Den tredje er, at remyelinering er et naturligt forekommende fænomen i gnavere, og bevis for remyelinering efter narkotikabehandling i EAE kan ikke være en primær resultat af lægemidlet, men istead en sekundær fænomen reducere inflammation.
En anden almindelig fremgangsmåde til fremstilling af demyelinisering opnås ved at indføre kobber chelator cuprizone i kosten. Dette resulterer i udbredt demyelinisering, især i corpus callosum. Der er begrænsninger i at studere hjernebjælken som en lokalitet af remyelinisering af følgende grunde: For det første, Axon diametre (og dermed myelin tykkelse) er mindre end andre CNS-regioner, og dermed tyndt remyelinated skafter kan være til at skelne fra dem, der var aldrig demyeliniserede. For det andet, fordi mus corpus callosum indeholder> 70% umyelinerede axoner 16, kan det være uklart, om en remyelinated segment er sandt reparation af beskadiget myelin eller de novo myelin syntese i den voksne, som normalt forekommer 17.
Det er vores overbevisning, at den bedste model til at studere remyelinering er den direkte indsprøjtning af toksiner, enten lysolecithin, ethidiumbromid, eller andre, ind i de caudale cerebrale stilke 18 eller rygmarven hvide substans. Den tidligere placering opnås kun ved præcis 3-dimension stereotaktisk injektion, og er begrænset til større gnavere (rotter) på grund af den lille størrelse af de cerebellare stilke. Dette udelukker den omfattende ressource af transgene mus i at studere de- og remyelinisering. Rygmarven indeholder imidlertid mange store hvide substans skrifter, der er let tilgængelige kirurgisk. Mellemrum mellem ryghvirvler i rostrale thorax segment tillader eksponering af rygmarven uden behov for en laminektomi, som er et nødvendigt skridt i kaudale thorax kirurgiske procedurer. En fordel ved specifikt rettet den ventrale hvide substans er, at axoner er ensartet større end den dorsale hvide substans, hvilket gør kvantificering af remyelinering en mindre tvetydig opgave-ligner de udfordringer, der er forbundet med corpus callosum. Derudover ventrale hvide substans udgør en meget større tArget område at injicere; flere hundrede mikrometer sideværts i den dorsale region ville placere kapillarrøret uden søjlen, mens den samme afvigelse ventralt stadig ville frembringe en fremtrædende demyeliniserende læsion. Nogle protokoller injicere lysolecithin i både ryg og ventrale kolonner af samme dyr 19. Dette kan øge både sandsynligheden for korrekt kapillær placering og antallet af kvantificerbare læsioner i færre dyr. Mens de aktuelle data er fra 8-10 uger gamle dyr på tidspunktet for operation, har vi også haft succes efter samme procedure på 8-10 måneder gamle mus, hvor remyelinering er beskrevet som værende markant langsommere 4.
Kvantificering af remyelinering er ikke en triviel virksomhed. Et centralt dogme postulerer, at remyelinated segmenter er kortere i længden og tyndere i gennemsnit end deres sunde modstykker, og dermed g ratio beregninger (Axon diameter divideret med Axon + myelin diameter) af tværsnit semi- or ultratynde sektioner er blevet standard procedure. Imidlertid er det kendt, at remyelinated segmenter fortykkes over tid 2 og en nylig undersøgelse ved anvendelse af en transgen reporter remyelinating oligodendrocytter antyder, at mange staengelled sidste ende blive skelnes fra kontrollen 20. Kvantificerer antallet af modne oligodendrocytter inden læsionen er en indirekte måde at måle reparation, da oligodendrocytter er i stand til at gøre en lang række internodier, og en betydelig del af remyelinering-afhængig af modellen anvendte-kan forekomme fra Schwann celler 3. Selvfølgelig, som remyelinering har været forbundet med restaurering af saltatory ledning 21, ville den ultimative metriske reparation være funktionel genopretning af neurologiske underskud. Mens remyelinering har været forbundet med inddrivelse af funktion i nogle arter 22,23, er det ikke blevet en standard procedure i murine lysolecithin studier. Dette er sandsynligvis på grund af en mangel på åbenlys observstand underskud fra enten dorsale eller ventrale læsioner sammenlignet med mere robuste demyeliniserende modeller som EAE og endda cuprizone. Vi mener, at funktionelle mangler som følge af lysolecithin injektion, og efterfølgende opsving med remyelinering, kun vil være iagttages ved hjælp af følsomme test af fine sensomotoriske funktion.
En PubMed søgning af "remyelinering" ved siden en af dyremodeller, der er anført ovenfor, omend en brysk metodisk tilgang, viser færre søgning hits til lysolecithin (109) sammenlignet med EAE (188) og cuprizone (197). Hvis vores argument, at lysolecithin demyelinisering er den overlegne metode til at studere remyelinering, hvorfor er det den mindst diskuteret? Måske en ængstelse for at bruge denne metode bygger på en tro på tekniske vanskeligheder med at udføre den kirurgiske operation. I virkeligheden er denne procedure er hurtig, omkostningseffektiv, og er ikke sværere end rutinemæssig væv dissektion, der kræver materialer, der alle inducielt tilgængelige. Det er vores håb, at denne protokol viser sig nyttigt for dem, der ønsker at tilføje denne kraftfulde model til deres repertoire til at studere spændende og voksende område af myelin reparation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R.
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
