Abstract
Рассеянный склероз является воспалительным демиелинизирующих заболевание центральной нервной системы, характеризующееся образованием зубного налета, содержащей утраченные олигодендроцитов, миелин, аксоны и нейроны. Ремиелинизацию является эндогенным ремонт механизм, посредством которого новая миелина производится после распространения, найма, и дифференцировки клеток олигодендроцитов предшественников в миелиновых формирования олигодендроцитам и это необходимо для защиты аксонов от дальнейшего повреждения. В настоящее время все терапевтические для лечения рассеянного склероза целевой аномальной иммунной компонент заболевания, которые снижают воспалительные рецидивы, но не предупредить развитие необратимых неврологических упадка. Поэтому крайне важно, чтобы стратегии ремиелинизации способствующих быть разработаны, которые могут замедлить прогрессирование болезни и, возможно, обратить вспять неврологические симптомы. Несколько животных моделей демиелинизации существуют, в том числе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и curprizone; Однако, есть Limiставления в их использовании для изучения ремиелинизацию. Более надежный подход фокусное инъекции токсинов в центральной нервной системе, в том числе моющего средства лизолецитин в спинной мозг белого вещества грызунов. В этом протоколе, мы демонстрируем, что хирургическая процедура участие в инъекционных лизолецитина в брюшной белом веществе мышей быстро, экономически эффективным, и не требует никаких дополнительных материалов, чем имеющиеся в продаже. Эта процедура важна не только для изучения нормальные события, участвующих в процессе ремиелинизацию, но и как доклинических инструмент для скрининга кандидатов ремиелинизацию-продвижения терапии.
Introduction
Рассеянный склероз (РС) является хроническим заболеванием, демиелинизирующих центральной нервной системы (ЦНС), характеризующейся иммунной инфильтрации и бляшек, содержащих потерянные миелина олигодендроцитов, аксоны нейронов и клеток. Большинство пациентов имеют болезнь курс, состоящий из воспалительных рецидивов, а также широкий спектр неврологических симптомов, с последующим периодами ремиссии. Более половины из этих пациентов в конечном итоге перейти к вторичному прогрессирующей стадии без видимых рецидивов, но постоянного неврологического упадка. Считается, что это постепенное ухудшение из-за аксонального повреждения и потери, вклад частично хронической демиелинизации. Стратегии восстановить утраченные миелин, таким образом, считается перспективным метод лечения, чтобы задержать прогрессирование болезни и, возможно, обратить вспять неврологические симптомы.
Ремиелинизацию является эндогенным ответ ремонт в ЦНС в результате чего новые миелиновые оболочки формируются из завербованных клеток-предшественников олигодендроцитов(OPCs), что дифференцироваться в миелиновых формирования олигодендроцитах. Ремиелинизацию было показано на животных моделях, чтобы быть достаточно надежной 1-3, однако, его эффективность снижается с возрастом 4. В самом деле, ремиелинизация происходит в организме человека, хотя это является неполным в большинстве MS пациентов 5. Все доступные в настоящее время препараты для MS, прежде всего, нацелены на аномальной иммунной компонент болезни и, в то время как эффективны в сокращении рецидивов, не заметно замедлить прогрессирование болезни. Следующее поколение терапевтических стратегий для управления MS будет интегрировать достижения в иммуномодуляцию с усилением эндогенной ремиелинизации для того, чтобы предотвратить как рецидивы и прогрессирование 6.
Один из методов для изучения де- и ремиелинизации в ЦНС включает в себя непосредственный впрыск моющего лизофосфатидилхолина (лизолецитину) в спинной мозг белого вещества 1,3,7. Эта процедура дает хорошо охарактеризованы demyelinatчисле травмы, состоящий в основном из макрофагов / микроглии инфильтрации и активации 8,9, реактивной астроглиоза, возмущения аксонов гомеостаза / аксонов травмы, и OPC пролиферации и миграции 10. Поражение предсказуемо развивается в течение периода от нескольких недель и в конечном счете способна полностью remyelinating. Этот метод особенно полезен при изучении хореографии событий, связанные с разработкой и ремиелинизации. Кроме того, он был принят в качестве инструмента для доклинических испытаний кандидатов терапии для ускорения ремонта после демиелинизирующего оскорбление.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: животные, используемые в этой процедуре были уход в соответствии с Канадским советом по уходу за животными (ССАС) руководящих принципов. Этика были утверждены Care Комитета по Животным университета Калгари в.
1. Подготовьте шприц для инъекций
- Растворить лизолецитин в 1% -ном растворе в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, рН 7,4) и хранят при -20 ° С в небольших аликвот (75 мкл). Оттепель флакон РТ.
Примечание: Если лизолецитин является нерастворенного, разрушать ультразвуком трубку в ультразвуковом очистителе (40 кГц) в течение примерно 30 мин с образованием однородного раствора. - Обращайтесь с предварительно вытащил стеклянный капилляр с особой осторожностью, чтобы не повредить нежную чаевые. Отвинтите гайку 10 мкл инъекционных шприца и пропустите его на плоскую конце капилляра, затем 2 наконечниками, гарантируя, что соединяемые концы наконечников выровнять и капиллярной уютно в конической манжеты (рисунок 1). Промойте шприц с isopropил спирт и удалить поршень. После высыхания, винтовые узла иглы руку плотно к инъекционным шприцем.
- Прикрепите металлический ступицы иглы для грунтовочного шприца. Пирс резиновые диск с иглой и сдвиньте его вниз до основания. Заполните грунтовки шприц с лизолецитина. Осторожно нажать на грунтовочное шприц, пока жидкость не видна на кончике иглы. Это гарантирует, воздушные пузырьки не будут введены в шприц для инъекций.
- Вставьте металлический ступицы иглы для подкачки шприца в инъекционного шприца. Создание фирмы уплотнение с резиновым диском, медленно нажать на заливную шприц, пока капиллярной не заполняет до кончика раствором. Осторожно снимите заливную шприц, одновременно нажимая, чтобы заполнить бочку инъекционных шприца без введения пузырьков воздуха. Вставить поршень в в инъекционного шприца и обеспечивать раствор течет от кончика капилляра, как поршень слегка нажата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если видны в крышке пузырьки воздухаIllary или инъекционных шприцев, препарат Шприц должен быть повторен с самого начала. Непрерывная жидкости в инъекционного аппарата имеет решающее значение для обеспечения точных объемов закачки. - Приложить заполненный инъекционного шприца в руку стереотаксической микроманипулятора. Это завершило аппарат сможет придать 15-20 животных до необходимости быть пополнен.
- Откажитесь от оставшегося лизолецитину от заливной шприц. Вывод и нажмите изопропиловый спирт несколько раз, и отсоедините металлический ступицы иглы. Подождите несколько часов, оставшихся изопропилового спирта в грунт шприца для испарения, прежде чем снова заполнения.
2. Подготовка животных для хирургической процедуры
Примечание: Эта процедура описана для женщин C57BL / 6 мышей в возрасте 8-10 недель.
- Обезболить животное с внутрибрюшинной инъекции кетамина (200 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) или в институциональных правил по уходу за животными. Планживотное находится под анестезией в течение приблизительно 1 ч при использовании инъекционного наркоза.
- Тест, что животное глубоко под наркозом, крепко зажимая ногу. Правильно наркозом животное не будет реагировать на повышение.
- Использование машинки для стрижки, бритье 2-3 см 2 площади на спинной стороне животного, недалеко от ушей. Будьте осторожны, чтобы не повредить слух.
- Протрите место в чистоте с 70% этанола, примененного к марлевым тампоном. Убедитесь, что все обрезается волосы были удалены из этого района. Лечить области с йодом.
- Применение вазелин для глаз, чтобы предотвратить высыхание в течение всей процедуры.
- Держите животное в нагретой камере восстановления до готовности, чтобы начать процедуру.
3. Выполните хирургической процедуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить достаточную технику асептического для всех этапов процедуры. Это включает в себя правильное использование перчаток, сетки для волос, маски и шторы. Все инструменты должны быть стерилизованы до вступления в контакторовт с животным.
- Перемещение животное стереотаксической рамки, спинной стороной вверх, возведен в середине секции по бумажных полотенец преувеличивать искривление позвоночника. Закрепите руки и хвост с хирургической лентой и закрепите головку зажимом зуба. Стабилизация уха бары не являются необходимыми для этой процедуры.
- Используйте скальпель, чтобы сделать 3 см срединный разрез, начиная чуть ниже ушей и резки в каудальном направлении.
- Найдите разрыв между 2 больших жировых структур и использовать тонкий пинцет в каждой руке, чтобы вытащить их друг от друга. Распространение преднатяжителями, чтобы открыть операционного поля.
- Под операционным микроскопом, найдите видное процесс вырост T2 позвонка (Примечание: эта функция характерна штамма C57BL / 6 мыши). Выполните тупым с закрытыми весенних ножницами через покрывающей мускулатуру, чтобы лучше представить себе, Т2. Используя щипцы, чувствовать за твердыми поверхностями Т3 и Т4, чтобы подтвердить правильность анатомического расположения.
- Использование пружинных ножниц, сделать неглубокие боковые порезы (2-3 мм в глубину) соединительной ткани между T3 и T4. Благодаря естественной расстояние между позвонками в верхней грудной части позвоночника мыши, ламинэктомию нет необходимости раскрывать в спинной мозг. Будьте внимательны, что слишком глубоко вырезать пробьет и повредить кабель.
ПРИМЕЧАНИЕ: малая степень кровотечения является общим во время этого шага. Если это происходит, не держать мочалку копье в области, пока кровотечение стихает (30-60 сек). - Визуализация спинной мозг. Это будет покрыт толстым слоем видимой твердой мозговой оболочки, если это менингеальные слой еще не обрезается, подвергая питания. Известный кровеносных сосудов работает хвостовой / ростральной через приблизительной средней линии спинного мозга.
Примечание: Этот сосудистую не должны быть использованы в качестве ориентира для средней линии. Вместо этого, достаточное освещение должно выявить границы серо-белого вещества фланговые спинной колонки, и они должны быть использованы для оценки средней линии. - Если твердой мозговой оболочкиостается неизменным, сделать нежные боковые царапины с 32 г металлической иглой, пока она не будет устранена. Цель состоит в том, чтобы удалить твердую мозговую оболочку, а не резать оставшихся, лежащие в основе мозговых оболочек, которые не толстый, и трудно увидеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выпуск спинномозговой жидкости свидетельствует о нарушении паутинной и, хотя это может происходить без механического повреждения ткани, накапливается спинномозговой жидкости должны быть удалены с губкой копьем, чтобы лучше визуализировать поверхности шнура. - Перемещение инъекционного шприца на месте и медленно опустите ее, пока кончик капилляра едва не коснется спинной мозг сразу же латеральнее обе стороны от средней линии. Блокировка руку на месте.
- Используйте градуированные измерения Z-направлении стереотаксической руку, чтобы сделать базовый измерение положения. От этого чтения, вычесть 1,3 мм. Используйте вниз быстро и неглубоко движение для прокалывания ткани, а затем осторожно опустите в капилляр до Новое измерение не будет достигнута. Дополнительно: при желании,повреждения в спинной колонки могут быть получены тем же движением пирсинг в средней линии и глубиной 0,3 мм (см обсуждения для получения дополнительной информации).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения являются специфическими для потребителей инъекционных между T3 и T4. Если выбирают для выполнения инъекции в любом другом месте в спинном мозге, эти значения должны быть получены из любых доступных атлас мозга мыши. - Используйте микроманипулятор нажимать лизолецитина в брюшной спинного мозга белого вещества. Сделать один поворот микроманипулятором каждые 5 секунд в течение 2 минут, в результате чего в конечном объеме 0,5 мл. Оставьте капилляр на месте в течение 2 дополнительных минут для предотвращения обратного потока раствора, а затем осторожно снимите капилляра.
- Свяжите одну нить в мышцы / жировой ткани, перекрывающей позвоночник. Используйте не-прерванной нити, чтобы закрыть кожу. Применить больше йода, в месте разреза.
- Поместите животное в нагретой камере восстановления до тех пор, пока не восстановится, то вернуть его в клетку. Применить анальгетики постоперативно, как в институциональных правил по уходу за животными. Дополнительная послеоперационный уход, как правило, не требуется, поскольку животные полностью амбулаторно-возможности самостоятельного кормления и поения, как только они выход из наркоза.
- Повторите процедуру для остальных животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: При языком, операция может быть завершена в 10-15 минут на животное, в частности, с помощью второго человека, связывая швов. Же стеклянный капилляр может быть использован в течение примерно 15-20 операций, прежде чем кончик становится тупой и должен быть заменен. Операции управления могут быть выполнены идентично, как описано, с введением PBS в спинной мозг, а не лизолецитин. Мы не рекомендуем очистки капилляров для дальнейшего использования.
4. Ткань обработка и анализ
- Пожертвовать животных внутрибрюшинной передозировки кетамина (500 мг / кг) и ксилазина (25 мг / кг) в желаемых временных точках. Поражения обычно развиваются в Фолляиз-за манера: 1-3 дня, активный демиелинизация; 3-7 дней, вербовка OPC; 7-10 дней, олигодендроцит дифференциация; 10-21 дней, активный ремиелинизации 2,10,11.
- Чтобы подготовить ткань для гистологического исследования, первый выполнить transcardial перфузии 12 с 20 мл PBS RT с последующим 20 мл ледяной 4% параформальдегида в PBS. Для приготовления смолы встроенного ткани для полу- или ультратонких срезов, см шаг 4,9.
- Удалить спинной мозг с помощью изогнутых ножниц кости, чтобы прорезать каждый позвонков, начиная с конца шейки позвоночника и рабочей вниз к нижней грудной уровне. Закрепите спинного мозга O / N в 4% параформальдегидом в PBS при 4 ° С. Переключатель шнуры до 30% сахарозы в PBS при 4 ° С в течение по меньшей мере 72 ч.
- Определение места инъекции в качестве аномалии на дорсальной поверхности спинного мозга. Вырезать 3 мм кусок ткани (с месте инъекции в центре) и совместите части в cryomolds, содержащие оптимальную температуру резания (OCT) COmpound. Приостановка нижнюю сторону cryomolds в охлажденной смеси 2-метилбутана и сухого льда до тех пор, пока октября полностью заморожены. Хранить при -80 ° С до готовности разделе.
- Раздел спинного мозга на криостате при ширине 20 мкм на предметных стеклах и дайте высохнуть на воздухе O / N до сохранения слайды при температуре -20 ° C.
- Обнаружение местоположения очага поражения и размер, используя eriochrome цианиновый гистологического пятно миелина 13. Выполните все шаги при комнатной температуре. Воздушно-сухой скользит в течение 30 мин. Место скользит в очистке агента в течение 1 мин, после чего регидратации в градуированных этанольных растворов (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, вода) в течение 1 мин каждый.
- Место слайды в eriochrome цианинового раствор в течение 15 мин, затем 1 мин промыть водой. Дифференцироваться в 0,5% гидроксида аммония в течение 10 сек, с последующим 1 мин промыть водой. Дегидрировать в градуированных этанола решений (в обратном порядке, как описано выше) в течение 1 мин каждый, покровное с монтажной средств массовой информации и изображения на ярко-полевых миcroscope.
- Используйте иммуногистохимии для визуализации аксонов и миелина. Воздушно-сухой скользит в течение 30 мин. Высушить с градуированной этанола (вода, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) в течение 2 мин каждый при комнатной температуре, а затем в обратном порядке обратно в воду. Этот шаг приводит к большей разрешения индивидуальных миелиновых колец 14.
- Блок неспецифических взаимодействий антител с использованием 10% козьей сыворотки и 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 60 мин при комнатной температуре. Развести первичных антител (мышиного анти-SMI312 1: 2000, кролик анти-МВР 1: 1000) в PBS и инкубировали на слайдах O / N при 4 ° С.
- Промыть 5 раз в течение 5 мин с PBS при комнатной температуре. Развести вторичными антителами (Alexa 488 анти-кроличий 1: 500, Alexa 546 против мышиного 1: 500) в PBS и инкубировали на слайдах в течение 60 мин при комнатной температуре. Промыть 5 раз в течение 5 мин с PBS при комнатной температуре. Гора слайды с покровные использованием gelvatol и изображение на флуоресцентного микроскопа.
- Использование иммуногистохимии для визуализации клетки олигодендроцитов линии. Следуйте процедуре улEP 4,7, опуская стадии дегидратации / регидратации, и с использованием 10% лошадиной сыворотки вместо козьей сыворотки. Используйте следующие разведения первичных антител: анти-козел PDGFRα 1: 100, мышиного анти-CC1 1: 200, кролик анти-Olig2 1: 200. Используйте следующие вторичные разведения антител: Alexa 488 анти-козел 1: 500, Alexa 594 анти-мышь 1: 500, Alexa 647 анти-кролик 1: 500.
- Чтобы подготовить ткань для полу- или ультратонкой срезов, первый выполнить transcardial перфузии 12 с 20 мл PBS RT с последующим 20 мл ледяной 4% параформальдегида / 1% глутарового альдегида в PBS. Удалить спинной мозг, как описано в стадии 4,3. Закрепить O / N в 4% параформальдегид / 1% глутаральдегид в PBS при 4 ° С.
- Определить место инъекции, как описано в шаге 4.4. Вырезать 1 мм кусок ткани, содержащей в месте инъекции. Дополнительные блоки 1 мм по обе стороны от поражения, могут быть получены также, если это желательно.
- В вытяжном шкафу, добавить 10 раз 1% по объему четырехокиси осмия / 1,5% кровяной соли для каждого блока на льдув течение 60 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: четырехокись осмия является высокотоксичным веществом и должны быть обработаны с особой тщательностью. Все материалы, контактирующие с осмия должен быть помещен в кукурузном масле (дважды объема, как осмия раствора) для нейтрализации. - Промыть 3 раза шнуров с 0,2 М какодилате в течение 10 мин при комнатной температуре, отбрасывая в кукурузном масле. Высушить с градуированными этанольных растворов (вода, 50%, 70%, 90%, 2 раза 95%, в 2 раза с 100%, 2 раза пропиленоксида) в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Код для вставки шнуры в смоле в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Вырезать блоки на ультрамикротоме и смонтировать разделы на капелек воды на предметных стеклах. Место скользит по горячей плите (примерно 50 ° С) до полного высыхания.
- Представьте миелин, добавив несколько капель 1% толуидиновым синим / 2% раствор буры на слайдах 10-15 сек при 50 ° С. Промыть водой, сухой и покровного с монтажными средствами массовой информации. Разделы изображение на ярко-поле микроскопа.
Representative Results
Фокусное инъекции лизолецитин в брюшной белого вещества производит дискретный демиелинизирующих поражения, которое обнаруживается на расстоянии примерно 3 мм (рисунок 2). Иммуногистохимическое окрашивание ядра поражения для миелина (ОБМ) и аксонов (SMI312) показывает, аксоны, которые были лишены миелина в течение 7 дней (Рисунок 3). По 14 дней, многие аксоны окружены MBP-положительных колец, что свидетельствует появление ремиелинизации. Окрашивание для клеток олигодендроцитов линии (PDGFRα, OLIG2, СС1), существует значительное увеличение как общего числа клеток на 14 день по сравнению с 7 дней, а также распределения зрелых олигодендроцитов по сравнению с OPCs (фиг.4) , В соответствии с этим выводом, полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим выявить наличие тонких миелиновых оболочек в 14 дней, которые редко обнаруженных на 7 дней (рисунок 5), указывая, что они remyelinated Internodes.
Процедура высокой воспроизводимостью между животными. Изменение происходит, когда тяжелое дыхание изменяет стационарную позицию капиллярно-это, как правило, не проблема с адекватной седации. Повреждение аксонов по-видимому, будет минимальным, за исключением того, в самом центре поражения, который был описан с самого раннего использования модели 1. Мы считаем, что это механическое повреждение из стеклянного капилляра, а также наблюдается в PBS вводили управления. Тем не менее, изменчивость, как правило, мало, и мы и другие, использующие подобную процедуру обнаружили различий между экспериментальных условиях при наличии всего 4 животных в группе 15.
Рисунок 1. Ассамблея инъекционных шприца. () Гайка инъекционного шприца с резьбой на Т Он плоский конец стеклянного капилляра, а затем 2 наконечники таким образом, что их концы спаривания блокировки. После того, как капиллярный прочно плотно в конической манжеты, сборка ввинчивается руку туго на конце инъекционного шприца. (В) фигуру центр резиновой диска с металлической втулки иглы, прикрепленной к грунтовочной шприца и скользить вниз, чтобы база. (C) Вывод лизолецитина решение в заливной шприц. (D) Осторожно нажмите на топливный шприц, пока первая капля лизолецитина не видно на кончике иглы. (E) Вставьте грунтовки шприц в стволе инъекций шприц, что делает твердое уплотнение с резиновым диском. Осторожно нажать решение, пока она не проходит до конца капилляра. Осторожно вывести на топливный шприц при сохранении давление на поршень, чтобы удалить металлические втулки иглы без введения пузырьков воздуха в инъекционных шприцев.Загрузка / 52679 / 52679fig1large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Представитель лизолецитина поражения окрашивали eriochrome цианиновым. Серийные срезы (интервал 400 мкм друг от друга) характерного лизолецитину поражения на 14 дней, окрашенных eriochrome цианиновым визуализировать миелин (синий). Обратите внимание, что демиелинизация ограничивается вентральной белого вещества и что поражение охватывает примерно 3 мм в ростральной / каудальном направлении. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. аксонов и миелина вМодель лизолецитина. (А) фиктивным (PBS) вводили в спинной мозг 7 дней показывает здоровых аксонов, окруженные миелиновых колец. (В) лизолецитин поражения в течение 7 дней показывает оголенные аксоны, а также деградации миелина. (С) В 14 дней, Доля аксонов (примеры обозначены белыми стрелками), связанный с появлением миелиновых колец. Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. олигодендроцитов Lineage клетки в модели лизолецитину. (А, С) в течение 7 дней, существует большая представление PDGFRα + OPCs (белые столбики) по отношению к СС1 + олигодендроцитов (Magenta) баров; число в пределах баров представляют проценты. Olig2 зондируют вподтвердить окрашивание олигодендроцитов клона клеток. (B, C) В 14 дней, есть значительное увеличение общего числа олигодендроцитов клона клеток по сравнению с 7 дней (р <0,05, Стьюдента-тест, N = 4 в группе ). Существует также значительное увеличение в распределении олигодендроцитов в OPCs на 14 дней по сравнению с 7 дней (р <0,0001, точный критерий Фишера). Масштабная линейка = 10 мкм. Каждое поле захвачен в оригинальной увеличением 60X. Приведены средние значения ± SD. * Означает р <0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. ремиелинизацию в модели лизолецитину. (А) поперечного сечения толуидин синий окрашенных полутонких секцию брюшной белого вещества в слухlthy мыши показывает аксонов в широком диапазоне калибров с соответствующей толщины миелина. (В) В 7 дней, отсутствие миелиновых оболочек наблюдается вблизи незатронутой области (справа внизу). (С) В 14 дней, тонко миелинизированные оболочки ( примеры, помеченные красными стрелками) появляются на протяжении поражения, что свидетельствует о remyelinated сегментов. Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Discussion
Количество животных моделях были разработаны для изучения MS, наиболее распознать на экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) модели. В ЭОС, грызуны, иммунизированных против фрагмента миелиновой пептида и пройти воспалительный развитие поражения, проявляющиеся в восходящем параличе. Хотя эта модель была полезна для доклинических испытаний иммуномодулирующих MS наркотики, он не подходит для изучения ремиелинизацию по трем основным причинам: во-первых, расположение воспалительных поражений несколько случайных и поиск повреждений при обработке ткани для полу- или сверхтонких секции могут быть сложной задачей. Во-вторых, ремиелинизация происходит в течение определенного времени, конечно, и точный возраст одного EAE поражения не могут быть известны без постоянного неинвазивной магнитно-резонансной томографии. В-третьих, ремиелинизация является естественным явлением у грызунов, и свидетельствует о ремиелинизации после обработки препарата в EAE не может быть первичным следствием препарата, но ввместо него вторичное явление уменьшения воспаления.
Другой распространенный метод получения демиелинизации достигается путем введения меди хелатор cuprizone в рационе. Это приводит к широкому распространению демиелинизации, особенно в мозолистого тела. Есть ограничения в изучении мозолистое тело как место ремиелинизации по следующим причинам: во-первых, диаметры аксонов (и, таким образом, миелин толщина) которые меньше, чем в других регионах ЦНС, и, таким образом, тонко remyelinated оболочки могут быть неотличимы от тех, которые никогда не были демиелинизированные. Во-вторых, потому, что мышь мозолистое тело содержит> 70% немиелинизированные аксоны 16, это может быть неясно, будет ли remyelinated сегмент верно ремонт поврежденного миелина или De Novo миелина синтеза у взрослых, который происходит обычно 17.
Это нашей веры, что лучшая модель для изучения ремиелинизацию является непосредственным впрыском токсинов, либо лизолецитин, ethidий бромид, или другие, в хвостовых ножек мозга 18 или спинного мозга белого вещества. Прежнее местоположение достигается только за счет точной 3-мерном стереотаксической инъекции, и ограничивается крупными грызунов (крыс) из-за небольшого размера мозжечка цветоносах. Это исключает обширный ресурс трансгенных мышей в изучении де- и ремиелинизацию. Спинного мозга, однако, содержит много больших белого вещества участки, которые легко доступны хирургическим путем. Пробелы между позвонками в ростральной грудного сегмента позволяет воздействия спинного мозга без необходимости ламинектомии, что необходимым шагом в каудальных грудной хирургических процедур. Преимущество, специально нацеленные на вентральной белого вещества является то, что аксоны равномерно больше, чем спинной белого вещества, что делает количественное ремиелинизации менее двусмысленным задача-аналогичны тем вызовам, связанным с мозолистого тела. Кроме того, вентральный белое вещество составляет гораздо большую тArget область вводить; несколько сотен микрон в поперечном направлении области спины бы разместить капилляр вне столбца, в то время как то же самое отклонение вентрально все еще произвести заметную демиелинизирующих поражения. Некоторые протоколы вводить лизолецитина в обоих спинной и брюшной колонкам и того же животного 19. Это может увеличить как вероятность правильного размещения капиллярной и количество количественному поражений в меньшем количестве животных. В то время как текущие данные, представленные от 8-10-недельных животных во время операции, мы также имели успех с использованием той же процедуры на 8-10 месячных мышей, которых ремиелинизация описан как заметно медленнее 4.
Количественное ремиелинизации не тривиально предприятие. Центральная догма утверждает, что remyelinated сегменты короче и тоньше, чем в среднем у здоровых, и, таким образом, расчеты г-отношение (диаметр аксона делится на аксона + диаметром миелина) из поперечного сечения полу оR ультратонких срезов стали стандартная процедура. Тем не менее, известно, что сегменты remyelinated загустеть в течение долгого времени, и 2 недавнее исследование с использованием трансгенных репортер remyelinating олигодендроцитов показывает, что многие междоузлий в конечном счете станет неотличим от контроля 20. Количественная количество зрелых олигодендроцитов в поражение косвенный способ измерить ремонт, как олигодендроциты способны сделать широкий ряд междоузлий, и значительная часть ремиелинизации-в зависимости от используемой модели-может произойти от клеток Шванн 3. Конечно, как ремиелинизации был связан с восстановлением прыжковой проводимости 21, конечная метрика ремонта будет функциональное восстановление неврологических дефицитов. В то время как ремиелинизации был связан с восстановлением функции у некоторых видов 22,23, она не стала стандартной процедурой в исследованиях на мышах лизолецитину. Это, вероятно, из-за отсутствия явного Observспособные дефицит либо из спинной или брюшной поражений, по сравнению с более надежных моделей демиелинизации, такие как ЭОС и даже cuprizone. Мы считаем, что функциональные дефициты, вытекающие из лизолецитина инъекции, и последующее восстановление с ремиелинизации, будет наблюдать только с помощью чувствительных тестов изобразительного функционирования сенсомоторной.
PubMed поиск "ремиелинизации", наряду с любым из животных моделей, перечисленных выше, хотя и бесцеремонной методологического подхода, показывает меньшее число посещений поиска для лизолецитина (109) по сравнению с ЭОС (188) и cuprizone (197). Если наши рассуждения, что лизолецитина демиелинизация выше подход для изучения ремиелинизацию, почему это наименее обсуждаемых? Возможно, опасения для использования этого метода происходит от веры технических трудностей при выполнении хирургической операции. В действительности, эта процедура не быстрая, экономически эффективной, и не сложнее, чем обычное рассечения тканей, требующих материалов, которые все Commerбенно доступны. Это наша надежда, что этот протокол окажется полезным для тех, кто желает, чтобы добавить эту мощную модель в свой репертуар для изучения интересной и развивающейся области миелина ремонта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R. Myelination of the mouse corpus callosum. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
