Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.
मल्टीपल स्क्लेरोसिस खो oligodendrocytes, माइलिन, एक्सोन, और न्यूरॉन्स युक्त पट्टिका गठन की विशेषता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक सूजन demyelinating बीमारी है। Remyelination नई माइलिन माइलिन के गठन oligodendrocytes में प्रसार, भर्ती, और oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं के भेदभाव के बाद का उत्पादन किया है, जिसके तहत एक अंतर्जात मरम्मत तंत्र है, और आगे के नुकसान से axons की रक्षा के लिए आवश्यक है। वर्तमान में, एकाधिक काठिन्य के उपचार के लिए सभी चिकित्सा विज्ञान भड़काऊ relapses के कम हो लेकिन अपरिवर्तनीय न्यूरोलॉजिकल गिरावट को बढ़ने से रोकने के लिए नहीं है जो इस रोग की न्यायपालिका प्रतिरक्षा घटक, लक्ष्य। यह remyelination को बढ़ावा देने रणनीतियों रोग प्रगति में देरी और शायद स्नायविक लक्षण रिवर्स सकता है जो विकसित किया जाना है कि इसलिए आवश्यक है। Demyelination की कई पशु मॉडल प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस और curprizone सहित मौजूद; हालांकि, Limi कर रहे हैंremyelination के अध्ययन के लिए उनके उपयोग में tations। एक और अधिक मजबूत दृष्टिकोण कृन्तकों की रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ में डिटर्जेंट lysolecithin सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विषाक्त पदार्थों का केन्द्र इंजेक्शन है। इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों के उदर सफेद पदार्थ में lysolecithin इंजेक्शन लगाने में शामिल शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया तेज, लागत प्रभावी है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उन लोगों से कोई अतिरिक्त सामग्री की आवश्यकता है कि प्रदर्शित करता है। यह प्रक्रिया है लेकिन यह भी उम्मीदवार remyelination को बढ़ावा देने के चिकित्सा विज्ञान स्क्रीनिंग के लिए एक पूर्व नैदानिक उपकरण के रूप में, न केवल remyelination प्रक्रिया में शामिल सामान्य घटनाओं के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है।
मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और खो माइलिन, oligodendrocytes, axons और न्यूरॉन्स युक्त सजीले द्वारा विशेषता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की एक पुरानी demyelinating बीमारी है। अधिकांश रोगियों को छूट की अवधि के द्वारा पीछा स्नायविक लक्षण की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ भड़काऊ relapses, से मिलकर एक बीमारी कोर्स है। इन रोगियों में से आधे से अधिक अंततः कोई स्पष्ट relapses लेकिन नित्य न्यूरोलॉजिकल गिरावट के साथ एक उच्च माध्यमिक प्रगतिशील चरण के लिए संक्रमण। यह इस प्रगतिशील गिरावट axonal क्षति और नुकसान की वजह से माना जाता है कि, पुराने demyelination के हिस्से में योगदान दिया। खो माइलिन बहाल करने के लिए रणनीतियाँ इस प्रकार रोग प्रगति में देरी और शायद स्नायविक लक्षण रिवर्स करने के लिए एक आशाजनक उपचार दृष्टिकोण माना जाता है।
Remyelination नई मेलिन शीथ भर्ती oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं से उत्पन्न कर रहे हैं जिससे सीएनएस में एक अंतर्जात मरम्मत प्रतिक्रिया हैमाइलिन के गठन oligodendrocytes में अंतर यह है कि (OPCs)। Remyelination 1-3, हालांकि, इसकी दक्षता 4 साल की उम्र के साथ में गिरावट आती है काफी मजबूत होने के लिए पशु मॉडल में दिखाया गया है। यह एमएस रोगियों 5 के बहुमत में अधूरा है, हालांकि दरअसल, remyelination इंसानों में होता है। एमएस के लिए सभी वर्तमान में उपलब्ध दवाओं में मुख्य रूप से relapses को कम करने में प्रभावी है, जबकि स्पष्ट रूप से रोग प्रगति देरी नहीं करते, रोग की न्यायपालिका प्रतिरक्षा घटक लक्ष्य और। एमएस के प्रबंधन के लिए चिकित्सीय रणनीतियों की अगली पीढ़ी relapses और प्रगति 6 दोनों को रोकने के क्रम में अंतर्जात remyelination की वृद्धि के साथ immunomodulation में प्रगति का एकीकरण करेगा।
एक विधि डे अध्ययन करने के लिए और सीएनएस में remyelination रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ 1,3,7 में डिटर्जेंट lysophosphatidylcholine (lysolecithin) के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है। यह प्रक्रिया एक अच्छी तरह से विशेषता demyelinat का उत्पादनचोट मुख्यतः बृहतभक्षककोशिका / microglial घुसपैठ और सक्रियण 8,9, प्रतिक्रियाशील astrogliosis, axonal समस्थिति / axonal चोट, और OPC प्रसार और प्रवास 10 की गड़बड़ी से मिलकर आईएनजी। घाव जाहिर है कुछ ही हफ्तों की अवधि में विकसित और पूरी तरह से remyelinating के अंत में सक्षम है। इस विधि डे और remyelination में शामिल घटनाओं की कोरियोग्राफी का अध्ययन करने में विशेष रूप से उपयोगी रही है। इसके अलावा, यह एक demyelinating अपमान निम्नलिखित मरम्मत में तेजी लाने के लिए उम्मीदवार के उपचारों के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए एक उपकरण के रूप में अपनाया गया है।
पशु मॉडलों के एक नंबर एमएस, सबसे मान्यतापूर्वक प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) मॉडल का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। EAE में, कृन्तकों एक माइलिन पेप्टाइड का एक टुकड़ा के खिलाफ प्रतिरक्षित और आरोही पक्षाघात में प्रकट भड़काऊ घाव विकास से गुजरना कर रहे हैं। अर्द्ध या ultrathin के लिए ऊतक प्रसंस्करण जब सबसे पहले, भड़काऊ घावों के स्थान कुछ हद तक अनियमित है, और घावों लगाने: इस मॉडल immunomodulatory एमएस दवाओं के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए उपयोगी हो गया है, जबकि यह तीन मुख्य कारणों के लिए remyelination के अध्ययन के लिए आदर्श नहीं है वर्गों चुनौतीपूर्ण हो सकता है। दूसरा remyelination एक विशिष्ट समय के पाठ्यक्रम पर होता है, और एक एकल EAE घाव का सही उम्र नित्य गैर इनवेसिव चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के बिना नहीं जाना जा सकता है। तीसरे remyelination दवा के एक प्राथमिक परिणाम नहीं हो सकता EAE में दवा इलाज के बाद एक स्वाभाविक रूप से कृन्तकों में घटना है, और remyelination का सबूत है कि है, लेकिन मेंसूजन को कम करने के लिए एक उच्च माध्यमिक घटना बजाए।
Demyelination उत्पादन का एक अन्य आम तरीका आहार में तांबे chelator cuprizone शुरू करने से हासिल की है। यह सबसे विशेष रूप से महासंयोजिका में, बड़े पैमाने पर demyelination में यह परिणाम है। सबसे पहले, अक्षतंतु व्यास (और इस प्रकार माइलिन मोटाई) अन्य सीएनएस क्षेत्रों की तुलना में छोटे होते हैं, और इस तरह बारीकी remyelinated शीथ demyelinated कभी नहीं थे कि उन लोगों से पृथक किया जा सकता है: निम्न कारणों remyelination की एक साइट के रूप में महासंयोजिका का अध्ययन करने में सीमाएं हैं। माउस महासंयोजिका> 70% बिना मेलिनकृत एक्सोन 16 क्योंकि इसमें दूसरे, यह एक remyelinated खंड 17 सामान्य रूप से होता है, जो वयस्क, में क्षतिग्रस्त माइलिन या डी नोवो माइलिन संश्लेषण का सच मरम्मत है कि क्या यह स्पष्ट नहीं हो सकता है।
यह remyelination के अध्ययन के लिए सबसे अच्छा मॉडल विषाक्त पदार्थों के प्रत्यक्ष इंजेक्शन, या तो lysolecithin, ethid है कि हमारा विश्वास का हैदुम मस्तिष्क peduncles 18 या रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ में IUM ब्रोमाइड, या दूसरों को,। पूर्व स्थान ही सटीक 3-आयाम स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन द्वारा हासिल की है, और कारण अनुमस्तिष्क peduncles के छोटे आकार बड़ा कृन्तकों (चूहे) तक सीमित है। इस डे और remyelination का अध्ययन करने में ट्रांसजेनिक चूहों के व्यापक संसाधन शामिल नहीं है। रीढ़ की हड्डी है, तथापि, आसानी से सुलभ शल्य चिकित्सा कर रहे हैं कि कई बड़े सफेद बात इलाकों में शामिल है। व्याख्यान चबूतरे वाला वक्ष सेगमेंट में कशेरुकाओं के बीच रिक्त स्थान दुम वक्ष शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में एक आवश्यक कदम है, जो एक laminectomy के, बिना जरूरत के लिए रीढ़ की हड्डी के प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से उदर सफेद बात को निशाना बनाने का एक लाभ यह एक्सोन remyelination की मात्रा का ठहराव, जिससे पृष्ठीय सफेद पदार्थ की तुलना में समान रूप से बड़े होते हैं वह यह है कि एक कम अस्पष्ट कार्य-समान महासंयोजिका के साथ जुड़े चुनौतियों के लिए। इसके अतिरिक्त, उदर सफेद पदार्थ एक बहुत बड़ा टी का निर्माण करता हैइंजेक्षन करने के लिए क्षेत्र arget; एक ही विचलन पेट के बल अभी भी एक प्रमुख demyelinating घाव का उत्पादन होगा जबकि पार्श्व पृष्ठीय क्षेत्र में कई सौ माइक्रोन, स्तंभ के बाहर केशिका जगह होगी। कुछ प्रोटोकॉल पृष्ठीय और एक ही पशु 19 के उदर कॉलम दोनों में lysolecithin इंजेक्षन। यह उचित केशिका नियुक्ति की संभावना और कम जानवरों में मात्रात्मक घावों की संख्या दोनों में वृद्धि कर सकते हैं। प्रस्तुत मौजूदा डेटा आपरेशन के समय में 8-10 सप्ताह पुराने जानवरों से है, हम भी remyelination चार स्पष्ट रूप से धीमी होने के रूप में वर्णित किया गया है, जहां 8-10 महीने पुराने चूहों, पर एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सफलता मिली है।
Remyelination की मात्रा का ठहराव एक तुच्छ उपक्रम नहीं है। एक केंद्रीय हठधर्मिता remyelinated खंडों उनके स्वस्थ समकक्षों की तुलना में औसतन लंबाई में छोटी और पतली हैं, और पार के अनुभागीय अर्द्ध ओ के इस प्रकार जी अनुपात गणना (अक्षतंतु व्यास अक्षतंतु + माइलिन व्यास द्वारा विभाजित) कि positsआर ultrathin वर्गों मानक प्रक्रिया बन गए हैं। हालांकि, यह remyelinated खंडों समय 2 से अधिक मोटा होना और remyelinating oligodendrocytes के ट्रांसजेनिक संवाददाता का उपयोग करते हुए एक ताजा अध्ययन में कई internodes अंततः नियंत्रण 20 से पृथक हो जाते हैं कि पता चलता है कि जाना जाता है। घाव के भीतर परिपक्व oligodendrocytes की संख्या बढ़ाता oligodendrocytes internodes की एक विस्तृत संख्या बनाने में सक्षम हैं, के रूप में की मरम्मत को मापने के लिए एक अप्रत्यक्ष तरीका है, और remyelination-निर्भर मॉडल पर का एक महत्वपूर्ण अनुपात इस्तेमाल कर सकते हैं श्वान कोशिकाओं 3 से होते हैं। Remyelination नाटकीय चालन 21 की बहाली के लिए जोड़ा गया है के रूप में बेशक, मरम्मत का अंतिम मीट्रिक न्यूरोलॉजिकल घाटा के कार्यात्मक वसूली होगी। Remyelination कुछ प्रजातियों 22,23 में समारोह की वसूली करने के लिए जोड़ा गया है, वहीं यह murine lysolecithin अध्ययन में एक मानक प्रक्रिया नहीं बन गया है। इस वजह से प्रकट observ की कमी होने की संभावना हैऐसे EAE और यहां तक कि cuprizone के रूप में और अधिक मजबूत demyelination मॉडल की तुलना में पृष्ठीय या उदर या तो घावों से सक्षम घाटे,। हम remyelination साथ इंजेक्शन, और बाद में वसूली lysolecithin से उत्पन्न कार्यात्मक घाटे, केवल ठीक ज्ञानेन्द्रिय कामकाज के प्रति संवेदनशील परीक्षण का उपयोग नमूदार हो जाएगा कि विश्वास करते हैं।
एक अशिष्ट methodological दृष्टिकोण यद्यपि, ऊपर सूचीबद्ध पशु मॉडलों में से किसी के साथ "remyelination" की एक की खोज, EAE (188) और cuprizone (197) की तुलना में (109) lysolecithin के लिए कम खोज हिट पता चलता है। Demyelination lysolecithin remyelination के अध्ययन के लिए बेहतर दृष्टिकोण है कि हमारे तर्क है, यही कारण है अगर ऐसा है, कम से कम चर्चा की? शायद इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक आशंका सर्जिकल आपरेशन प्रदर्शन में तकनीकी कठिनाई के एक विश्वास से निकला है। वास्तविकता में, इस प्रक्रिया के सभी वाणिज्यिक कर रहे हैं कि सामग्री की आवश्यकता होती है, तेजी से, लागत प्रभावी है, और कोई दिनचर्या ऊतक विच्छेदन की तुलना में अधिक मुश्किल हैखासकर उपलब्ध है। यह इस प्रोटोकॉल माइलिन मरम्मत के रोमांचक और क्षेत्र के विस्तार के अध्ययन के लिए अपने प्रदर्शनों की सूची के लिए इस शक्तिशाली मॉडल जोड़ना चाहते हैं कि उन लोगों के लिए उपयोगी साबित होता है कि हमारी आशा है।
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates – Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates – Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
clippers | Philips | QG3330 | |
heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
surgical tape | 3M | 1527-1 | |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
scalpel blade | Feather | No. 15 | |
sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
32 gauge metal needle | BD | 305106 | |
needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μL syringe is a tighter fit |
priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
cryostat | Leica | CM1900 | |
microscope slides | VWR | 48311-703 | |
bright field microscope | Olympus | BX51 | |
ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
goat serum | Sigma | G9023 | |
Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2000 dilution |
Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
PBS | Oxoid | BR0014 | |
isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
ketamine | CDMV | ||
xylazine | CDMV | ||
iodine | West Penetone | 2021 | |
Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
sucrose | Sigma | S5016 | |
Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
horse serum | Sigma | H0146 | |
glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
corn oil | Sigma | C8267 | |
polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
glycerol | Sigma | G9012 | |
cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
Recipes | |||
Eriochrome cyanine solution | |||
Ingredient | Amount to add | ||
Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
sulfuric acid | 400 mL 0.5% | ||
iron(III)chloride | 20 mL 10% | ||
water | 80 mL | ||
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
Gelvatol | |||
Ingredient | Amount to add | ||
PBS | 140 mL | ||
polyvinyl alcohol | 20 g | ||
glycerol | 40 g | ||
*mix well, place at 37 °C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes |