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Neuroscience

Lysolecithin की फोकल इंजेक्शन द्वारा प्रायोगिक Demyelination और murine स्पाइनल कॉर्ड की Remyelination

Published: March 26, 2015 doi: 10.3791/52679
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Clinical Neurosciences, Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary, 2Department of Oncology, Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary

Abstract

मल्टीपल स्क्लेरोसिस खो oligodendrocytes, माइलिन, एक्सोन, और न्यूरॉन्स युक्त पट्टिका गठन की विशेषता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के एक सूजन demyelinating बीमारी है। Remyelination नई माइलिन माइलिन के गठन oligodendrocytes में प्रसार, भर्ती, और oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं के भेदभाव के बाद का उत्पादन किया है, जिसके तहत एक अंतर्जात मरम्मत तंत्र है, और आगे के नुकसान से axons की रक्षा के लिए आवश्यक है। वर्तमान में, एकाधिक काठिन्य के उपचार के लिए सभी चिकित्सा विज्ञान भड़काऊ relapses के कम हो लेकिन अपरिवर्तनीय न्यूरोलॉजिकल गिरावट को बढ़ने से रोकने के लिए नहीं है जो इस रोग की न्यायपालिका प्रतिरक्षा घटक, लक्ष्य। यह remyelination को बढ़ावा देने रणनीतियों रोग प्रगति में देरी और शायद स्नायविक लक्षण रिवर्स सकता है जो विकसित किया जाना है कि इसलिए आवश्यक है। Demyelination की कई पशु मॉडल प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस और curprizone सहित मौजूद; हालांकि, Limi कर रहे हैंremyelination के अध्ययन के लिए उनके उपयोग में tations। एक और अधिक मजबूत दृष्टिकोण कृन्तकों की रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ में डिटर्जेंट lysolecithin सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विषाक्त पदार्थों का केन्द्र इंजेक्शन है। इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों के उदर सफेद पदार्थ में lysolecithin इंजेक्शन लगाने में शामिल शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया तेज, लागत प्रभावी है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उन लोगों से कोई अतिरिक्त सामग्री की आवश्यकता है कि प्रदर्शित करता है। यह प्रक्रिया है लेकिन यह भी उम्मीदवार remyelination को बढ़ावा देने के चिकित्सा विज्ञान स्क्रीनिंग के लिए एक पूर्व नैदानिक ​​उपकरण के रूप में, न केवल remyelination प्रक्रिया में शामिल सामान्य घटनाओं के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और खो माइलिन, oligodendrocytes, axons और न्यूरॉन्स युक्त सजीले द्वारा विशेषता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की एक पुरानी demyelinating बीमारी है। अधिकांश रोगियों को छूट की अवधि के द्वारा पीछा स्नायविक लक्षण की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ भड़काऊ relapses, से मिलकर एक बीमारी कोर्स है। इन रोगियों में से आधे से अधिक अंततः कोई स्पष्ट relapses लेकिन नित्य न्यूरोलॉजिकल गिरावट के साथ एक उच्च माध्यमिक प्रगतिशील चरण के लिए संक्रमण। यह इस प्रगतिशील गिरावट axonal क्षति और नुकसान की वजह से माना जाता है कि, पुराने demyelination के हिस्से में योगदान दिया। खो माइलिन बहाल करने के लिए रणनीतियाँ इस प्रकार रोग प्रगति में देरी और शायद स्नायविक लक्षण रिवर्स करने के लिए एक आशाजनक उपचार दृष्टिकोण माना जाता है।

Remyelination नई मेलिन शीथ भर्ती oligodendrocyte अग्रदूत कोशिकाओं से उत्पन्न कर रहे हैं जिससे सीएनएस में एक अंतर्जात मरम्मत प्रतिक्रिया हैमाइलिन के गठन oligodendrocytes में अंतर यह है कि (OPCs)। Remyelination 1-3, हालांकि, इसकी दक्षता 4 साल की उम्र के साथ में गिरावट आती है काफी मजबूत होने के लिए पशु मॉडल में दिखाया गया है। यह एमएस रोगियों 5 के बहुमत में अधूरा है, हालांकि दरअसल, remyelination इंसानों में होता है। एमएस के लिए सभी वर्तमान में उपलब्ध दवाओं में मुख्य रूप से relapses को कम करने में प्रभावी है, जबकि स्पष्ट रूप से रोग प्रगति देरी नहीं करते, रोग की न्यायपालिका प्रतिरक्षा घटक लक्ष्य और। एमएस के प्रबंधन के लिए चिकित्सीय रणनीतियों की अगली पीढ़ी relapses और प्रगति 6 दोनों को रोकने के क्रम में अंतर्जात remyelination की वृद्धि के साथ immunomodulation में प्रगति का एकीकरण करेगा।

एक विधि डे अध्ययन करने के लिए और सीएनएस में remyelination रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ 1,3,7 में डिटर्जेंट lysophosphatidylcholine (lysolecithin) के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है। यह प्रक्रिया एक अच्छी तरह से विशेषता demyelinat का उत्पादनचोट मुख्यतः बृहतभक्षककोशिका / microglial घुसपैठ और सक्रियण 8,9, प्रतिक्रियाशील astrogliosis, axonal समस्थिति / axonal चोट, और OPC प्रसार और प्रवास 10 की गड़बड़ी से मिलकर आईएनजी। घाव जाहिर है कुछ ही हफ्तों की अवधि में विकसित और पूरी तरह से remyelinating के अंत में सक्षम है। इस विधि डे और remyelination में शामिल घटनाओं की कोरियोग्राफी का अध्ययन करने में विशेष रूप से उपयोगी रही है। इसके अलावा, यह एक demyelinating अपमान निम्नलिखित मरम्मत में तेजी लाने के लिए उम्मीदवार के उपचारों के पूर्व नैदानिक ​​परीक्षण के लिए एक उपकरण के रूप में अपनाया गया है।

Protocol

नोट: इस प्रक्रिया में प्रयुक्त जानवर पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद (CCAC) के दिशा निर्देशों के अनुसार के लिए परवाह कर रहे थे। आचार कैलगरी विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. इंजेक्शन के लिए सिरिंज तैयार

  1. (; 7.4 पीएच पीबीएस) और स्टोर छोटे aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस (75 μl) में फॉस्फेट बफर खारा में एक 1% समाधान के लिए lysolecithin भंग। आर टी करने के लिए एक शीशी पिघलना।
    नोट: lysolecithin अघुलित है, तो एक समान समाधान के लिए फार्म का लगभग 30 मिनट के लिए एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर (40 किलोहर्ट्ज़) में ट्यूब sonicate।
  2. नाजुक टिप को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए अत्यधिक ध्यान के साथ पहले से खींच लिया गिलास केशिका संभाल लेना। एक 10 μl इंजेक्शन लगाने सिरिंज का अखरोट खोल देना और ferrules की संभोग सिरों संरेखित और केशिका शंक्वाकार सामी (चित्रा 1) में सुखद है कि यह सुनिश्चित करने, दो ferrules द्वारा पीछा केशिका के फ्लैट अंत पर यह धागा। Isoprop साथ सिरिंज कुल्लाYL शराब और सवार को हटा दें। सूखी एक बार इंजेक्शन सिरिंज पर तंग सुई विधानसभा हाथ पेंच।
  3. भड़काना सिरिंज के लिए धातु हब सुई संलग्न। पियर्स सुई के साथ एक रबर डिस्क और आधार करने के लिए इसे नीचे स्लाइड। Lysolecithin साथ भड़काना सिरिंज भरें। तरल सुई की नोक पर दिखाई देता है जब तक धीरे भड़काना सिरिंज दबाना। यह हवा के बुलबुले इंजेक्शन सिरिंज में पेश नहीं किया जाएगा सुनिश्चित करता है।
  4. इंजेक्शन सिरिंज में भड़काना सिरिंज के धातु हब सुई डालें। केशिका समाधान के साथ टिप को भरता है जब तक रबर डिस्क के साथ एक फर्म सील करना, धीरे-धीरे भड़काना सिरिंज दबाना। एक साथ हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना इंजेक्शन लगाने सिरिंज के बैरल को भरने के लिए निराशाजनक है, जबकि ध्यान भड़काना सिरिंज को हटा दें। इंजेक्शन सिरिंज में सवार डालें और सवार धीरे उदास है के रूप में समाधान केशिका की नोक से बहती है सुनिश्चित करते हैं।
    नोट: किसी भी हवाई बुलबुले टोपी में दिखाई दे रहे हैंillary या सिरिंज इंजेक्शन सिरिंज तैयारी शुरू से ही दोहराया जाना चाहिए। इंजेक्शन लगाने के उपकरण में सतत द्रव सटीक इंजेक्शन संस्करणों सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. एक स्टीरियोटैक्टिक micromanipulator के हाथ करने के लिए पूरा इंजेक्शन लगाने सिरिंज संलग्न। यह पूरा तंत्र refilled किया ज़रूरत से पहले 15-20 जानवरों इंजेक्षन करने में सक्षम हो जाएगा।
  6. भड़काना सिरिंज से शेष lysolecithin त्यागें। वापस लेने और isopropyl शराब कई बार दबाना, और धातु हब सुई अलग। फिर से भरने से पहले लुप्त हो जाना भड़काना सिरिंज में शेष isopropyl शराब के लिए कई घंटे इंतजार।

2. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के लिए पशु की तैयारी

नोट: यह प्रक्रिया महिला C57BL / 6 चूहों, वृद्ध 8-10 हफ्तों के लिए वर्णित है।

  1. Ketamine (200 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) की या संस्थागत पशु की देखभाल के नियमों के अनुसार एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize। इसकी योजना बनाएंइंजेक्शन संज्ञाहरण का उपयोग कर यदि पशु लगभग 1 घंटे के लिए संज्ञाहरण के तहत किया जाना है।
  2. पशु गहरा मजबूती से पैर pinching द्वारा anesthetized है कि टेस्ट। एक ठीक anesthetized जानवर चुटकी का जवाब नहीं देंगे।
  3. क़ैंची का उपयोग, कान के करीब पशु, के पृष्ठीय पक्ष पर एक 2-3 सेमी 2 क्षेत्र दाढ़ी। कानों को नुकसान नहीं सावधान रहना होगा।
  4. एक धुंध पैड के लिए लागू 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र को साफ साफ कर लें। सभी काटा बाल क्षेत्र से हटा दिया गया है सुनिश्चित करें। आयोडीन के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित।
  5. प्रक्रिया के दौरान सुखाने को रोकने के लिए आंखों को पेट्रोलियम जेली लागू करें।
  6. प्रक्रिया शुरू करने के लिए तैयार है जब तक एक गर्म वसूली कक्ष में पशु रखें।

3. सर्जिकल प्रक्रिया का प्रदर्शन

नोट: प्रक्रिया के सभी चरणों के लिए पर्याप्त सड़न रोकनेवाला तकनीक सुनिश्चित करें। इस दस्ताने, hairnets, मास्क, और पर्दे के समुचित उपयोग भी शामिल है। सभी उपकरण contac में आने से पहले निष्फल होना चाहिएजानवर के साथ टी।

  1. एक stereotactic फ्रेम करने के लिए पशु ले जाएँ, पृष्ठीय पक्ष, रीढ़ की वक्रता अतिरंजना मुड़ा हुआ कागज तौलिए से मध्य वर्ग पर ऊपर उठाया। सर्जिकल टेप के साथ हथियार और पूंछ जकड़ना और एक दांत क्लैंप के साथ सिर सुरक्षित। स्थिर कान सलाखों इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक नहीं हैं।
  2. सिर्फ कान के नीचे शुरू करने और दुम दिशा में कटौती, एक 3 सेमी midline चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें।
  3. 2 बड़े वसा संरचनाओं के बीच खाई का पता लगाएँ और इन के अलावा खींचने के लिए एक हाथ में ठीक संदंश का उपयोग करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को खोलने के लिए retractors बिखरा हुआ है।
  4. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, टी 2 बांस की प्रमुख परिणाम प्रक्रिया का पता लगाने (नोट: यह फीचर C57BL 6 / माउस तनाव की विशेषता है)। बेहतर टी 2 कल्पना करने के लिए overlaying मांसलता के माध्यम से बंद वसंत कैंची के साथ एक कुंद विच्छेदन प्रदर्शन। संदंश का प्रयोग, उचित संरचनात्मक स्थान पुष्टि करने के लिए T3 और टी -4 के कठोर सतहों के लिए लग रहा है।
  5. वसंत कैंची का प्रयोग, T3 और टी -4 के बीच संयोजी ऊतक का (2-3 मिमी गहरी) उथले पार्श्व में कटौती कर सकते हैं। कारण माउस कशेरुका स्तंभ के ऊपरी वक्ष भाग में कशेरुकाओं के बीच प्राकृतिक अंतर रखने के लिए, एक laminectomy के रीढ़ की हड्डी प्रकट करने के लिए आवश्यक नहीं है। भी गहरी एक कट पियर्स और हड्डी को नुकसान होगा कि ध्यान में रखना होगा।
    नोट: रक्तस्राव के एक छोटे से डिग्री इस कदम के दौरान आम है। यदि ऐसा होता है, खून बह रहा उतरे (30-60 सेकंड) जब तक क्षेत्र में एक स्पंज भाला पकड़।
  6. रीढ़ की हड्डी की कल्पना। गर्भनाल को उजागर करते हुए इस मस्तिष्कावरणीय परत अभी तक कटौती नहीं की गई थी कि अगर यह दिखाई दे ड्यूरा की एक मोटी परत के साथ कवर किया जाएगा। एक प्रमुख रक्त वाहिका रीढ़ की हड्डी की अनुमानित midline के माध्यम से दुम / चोंच पर चलाता है।
    नोट: यह vasculature के midline के लिए एक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। इसके बजाय, पर्याप्त प्रकाश व्यवस्था पृष्ठीय स्तंभ flanking ग्रे सफेद बात सीमाओं प्रकट करना चाहिए, और इन midline के अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  7. ड्यूरा हैंइसे मंजूरी दे दी है जब तक बरकरार रहता है, एक 32 जी धातु सुई के साथ कोमल पार्श्व scrapes के बनाते हैं। लक्ष्य के रूप में मोटी और देखने के लिए कठिन नहीं कर रहे हैं, जो शेष अंतर्निहित तानिका, काट नहीं है, जबकि ड्यूरा दूर करने के लिए है।
    नोट: मस्तिष्कमेरु द्रव की रिलीज मकड़ी का उल्लंघन इंगित करता है और इस ऊतक के लिए यांत्रिक क्षति के बिना हो सकता है, जबकि संचित मस्तिष्कमेरु द्रव बेहतर कॉर्ड की सतह कल्पना करने के लिए एक स्पंज भाला के साथ हटा दिया जाना चाहिए।
  8. जगह में इंजेक्शन लगाने सिरिंज ले जाएँ और केशिका की नोक अभी मुश्किल midline के दोनों ओर के तुरंत पार्श्व रीढ़ की हड्डी को छूता है जब तक धीरे-धीरे यह कम है। जगह में बांह ताला।
  9. एक आधारभूत स्थिति माप बनाने के लिए जेड दिशा स्टीरियोटैक्टिक बांह की वर्गीकृत माप का उपयोग करें। इस पढ़ने से, 1.3 मिमी घटाना। ऊतक पियर्स के लिए एक त्वरित और उथले नीचे गति का उपयोग और नई माप तक पहुँच जाता है तो ध्यान से केशिका कम है। वैकल्पिक: अगर वांछित,पृष्ठीय स्तंभ में घावों midline पर एक ही भेदी गति और 0.3 मिमी (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें) की गहराई से उत्पादन किया जा सकता है।
    नोट: ये मान T3 और टी -4 के बीच इंजेक्शन लगाने के लिए विशिष्ट हैं। रीढ़ की हड्डी में किसी भी अन्य स्थान पर इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए चयन करते हैं, तो इन मूल्यों को किसी भी उपलब्ध माउस ब्रेन एटलस से व्युत्पन्न किया जाना चाहिए।
  10. उदर रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ में lysolecithin दबाना micromanipulator का प्रयोग करें। 0.5 μl के अंतिम मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप, 2 मिनट के लिए micromanipulator के एक रोटेशन हर 5 सेकंड बनाओ। समाधान की backflow को रोकने के लिए दो अतिरिक्त मिनट के लिए जगह में केशिका छोड़ दो, और फिर ध्यान केशिका हटा दें।
  11. स्पाइनल कॉलम overlaying मांसपेशी / वसा ऊतकों में एक भी सिवनी बाँधो। त्वचा को बंद करने के लिए एक गैर-बाधित सीवन का प्रयोग करें। चीरा साइट को और अधिक आयोडीन लागू करें।
  12. यह ठीक नहीं है, जब तक तो अपने पिंजरे करने के लिए इसे वापस एक गर्म वसूली कक्ष में पशु रखें। दर्दनाशक दवाओं लागू करें पोस्टऑपरेशन संस्थागत पशु की देखभाल के नियमों के अनुसार। जानवरों के रूप में जल्द ही संज्ञाहरण से वे वसूली के रूप में पूरी तरह से चल और आत्म-खिलाने और पीने के लिए सक्षम हैं के रूप में अतिरिक्त पोस्ट ऑपरेटिव केयर आमतौर पर आवश्यक नहीं है।
  13. शेष जानवरों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
    नोट: प्रवीणता के साथ, आपरेशन विशेष रूप से टांके बांधने एक दूसरे व्यक्ति की मदद से, पशु प्रति 10-15 मिनट में पूरा किया जा सकता है। टिप कुंद हो जाता है और प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए इससे पहले एक ही गिलास केशिका लगभग 15-20 सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बजाय lysolecithin की रीढ़ की हड्डी में पीबीएस का एक इंजेक्शन के साथ, के रूप में वर्णित नियंत्रण सर्जरी हूबहू किया जा सकता है। हम भविष्य में उपयोग के लिए केशिकाओं की सफाई की सिफारिश नहीं है।

4. ऊतक प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. वांछित समय बिंदुओं पर ketamine (500 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (25 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal अधिक मात्रा के साथ पशुओं का बलिदान। घावों आमतौर पर foll में विकसितकारण तरीके: 1-3 दिनों सक्रिय demyelination; 3-7 दिनों, ओपीसी भर्ती; 7-10 दिन, oligodendrocyte भेदभाव; 10-21 दिनों सक्रिय remyelination 2,10,11।
  2. पहले पीबीएस में 20 मिलीलीटर ठंडा 4% paraformaldehyde के द्वारा पीछा 20 मिलीलीटर आरटी पीबीएस के साथ एक transcardial छिड़काव 12 प्रदर्शन, ऊतक विज्ञान के लिए ऊतक तैयार करने के लिए। अर्द्ध या ultrathin सेक्शनिंग के लिए राल एम्बेडेड ऊतक की तैयारी के लिए, कदम 4.9 देखें।
  3. प्रत्येक कशेरुकाओं स्पाइनल कॉलम के गर्भाशय ग्रीवा के अंत में शुरू करने और कम वक्ष स्तर के नीचे काम कर के माध्यम से कटौती करने के लिए घुमावदार हड्डी कैंची का उपयोग रीढ़ की हड्डी निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 4% paraformaldehyde में रीढ़ की हड्डी डोरियों हे / एन को ठीक करें। कम से कम 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 30% sucrose के लिए रस्सियों स्विच करें।
  4. रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सतह पर एक विषमता के रूप में इंजेक्शन साइट की पहचान। (बीच में इंजेक्शन साइट के साथ) ऊतक का एक 3 मिमी टुकड़ा काट और इष्टतम काटने तापमान युक्त cryomolds (अक्टूबर) के सह में टुकड़े संरेखितmpound। अक्टूबर पूरी तरह से जमे हुए है जब तक दो-methylbutane और सूखी बर्फ की एक ठंडा मिश्रण में cryomolds के नीचे निलंबित। अनुभाग के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. खुर्दबीन स्लाइड पर 20 माइक्रोन की चौड़ाई में धारा एक cryostat पर रीढ़ की हड्डी डोरियों और शुष्क हवा ओ करने की अनुमति / एन -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड भंडारण से पहले।
  6. माइलिन 13 साल की एक eriochrome cyanine ऊतकीय दाग का उपयोग कर घाव स्थान और आकार का पता लगाने। आरटी पर सभी चरणों को पूरा करें। 30 मिनट के लिए हवा शुष्क स्लाइड। 1 मिनट प्रत्येक के लिए श्रेणीबद्ध इथेनॉल समाधान में पुनर्जलीकरण द्वारा पीछा 1 मिनट (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, पानी) के लिए एजेंट की मंजूरी देने में जगह स्लाइड।
    1. पानी के साथ एक एक मिनट धोने के द्वारा पीछा किया 15 मिनट के लिए eriochrome cyanine समाधान में जगह स्लाइड,। पानी के साथ एक एक मिनट धोने के द्वारा पीछा किया, 10 सेकंड के लिए 0.5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड में अंतर। एक उज्ज्वल क्षेत्र मील पर 1 मिनट के बढ़ते मीडिया के साथ प्रत्येक coverslip के लिए, और छवि के लिए (जैसा कि ऊपर वर्णित आदेश रिवर्स) वर्गीकृत इथेनॉल समाधान में निर्जलीकरणcroscope।
  7. Axons और माइलिन कल्पना करने के लिए immunohistochemistry का प्रयोग करें। 30 मिनट के लिए हवा शुष्क स्लाइड। आरटी पर 2 मिनट प्रत्येक के लिए श्रेणीबद्ध इथेनॉल (पानी, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) के साथ निर्जलीकरण, फिर वापस पानी के क्रम को उल्टा। यह कदम व्यक्तिगत माइलिन के छल्ले 14 की अधिक से अधिक संकल्प में यह परिणाम है।
    1. आरटी पर 60 मिनट के लिए पीबीएस में 10% बकरी सीरम और 0.25% ट्राइटन X-100 का उपयोग करते हुए गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बातचीत ब्लॉक। पीबीएस में और 4 डिग्री सेल्सियस पर / स्लाइड हे पर एन सेते प्राथमिक एंटीबॉडी (1000: 2000, खरगोश विरोधी है MBP एक माउस विरोधी SMI312 1) पतला।
    2. आरटी पर पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 5 बार धोएं। पीबीएस में और आरटी पर 60 मिनट के लिए स्लाइड पर सेते माध्यमिक एंटीबॉडी (500: 500, एलेक्सा 546 विरोधी माउस एक एलेक्सा 488 विरोधी खरगोश 1) पतला। आरटी पर पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 5 बार धोएं। माउंट एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर gelvatol और छवि का उपयोग कर coverslips के साथ स्लाइड।
  8. Oligodendrocyte वंश की कोशिकाओं कल्पना करने के लिए immunohistochemistry का प्रयोग करें। अनुसूचित जनजाति के लिए प्रक्रिया का पालन करेंईपी 4.7, निर्जलीकरण / पुनर्जलीकरण कदम को छोड़ते हुए, और 10% घोड़े सीरम की बजाय बकरी सीरम के प्रयोग से। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी dilutions का उपयोग करें: बकरी विरोधी PDGFRα 1: 100, माउस विरोधी CC1 1: 200, खरगोश विरोधी Olig2 1: 200। एलेक्सा 488 विरोधी बकरी 1: 500, एलेक्सा 594 विरोधी माउस 1: 500, एलेक्सा 647 विरोधी खरगोश 1: 500 निम्न माध्यमिक एंटीबॉडी dilutions का प्रयोग करें।
  9. पहले पीबीएस में 20 मिलीलीटर ठंडा 4% paraformaldehyde / 1% glutaraldehyde के द्वारा पीछा 20 मिलीलीटर आरटी पीबीएस के साथ एक transcardial छिड़काव 12 प्रदर्शन, अर्द्ध या ultrathin सेक्शनिंग के लिए ऊतक तैयार करने के लिए। 4.3 चरण में वर्णित के रूप में रीढ़ की हड्डी निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में हे / एन 4% में paraformaldehyde / 1% glutaraldehyde को ठीक करें।
  10. कदम 4.4 में वर्णित के रूप में इंजेक्शन साइट की पहचान। इंजेक्शन साइट युक्त ऊतक के एक 1 मिमी टुकड़ा काट। अगर वांछित घाव के दोनों तरफ अतिरिक्त 1 मिमी ब्लॉक के रूप में अच्छी तरह से तैयार किया जा सकता है।
  11. एक धूआं हुड में, बर्फ पर प्रत्येक ब्लॉक के लिए 10 गुना मात्रा 1% आज़मियम tetroxide / 1.5% पोटेशियम ferrocyanide जोड़ने60 मिनट के लिए।
    नोट: आज़मियम tetroxide एक बेहद जहरीला पदार्थ है और चरम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। आज़मियम tetroxide के साथ संपर्क में सभी सामग्री निराकरण के लिए मक्का का तेल (आज़मियम tetroxide समाधान के रूप में दो बार की मात्रा) में रखा जाना चाहिए।
  12. मक्का का तेल में discarding, आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.2 एम cacodylate साथ डोरियों तीन बार धोएं। वर्गीकृत इथेनॉल समाधान (पानी, 50%, 70%, 90%, 95% के साथ दो बार, 100% के साथ 2 बार, propylene ऑक्साइड के साथ 2 बार) आरटी पर 10 मिनट के लिए साथ निर्जलीकरण।
  13. निर्माता के निर्देशों के अनुसार राल में शामिल करें डोरियों।
  14. एक ultramicrotome पर ब्लॉक कट और खुर्दबीन स्लाइड पर पानी की बूंदों पर वर्गों माउंट। शुष्क जब तक एक गर्म प्लेट (लगभग 50 डिग्री सेल्सियस) पर प्लेस स्लाइड।
  15. 50 डिग्री सेल्सियस पर 10-15 सेकंड के लिए स्लाइड पर नीले 1% toluidine / 2% बोरेक्स समाधान की कुछ बूँदें जोड़कर माइलिन कल्पना। बढ़ते मीडिया के साथ पानी, सूखा, और coverslip से कुल्ला। एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर छवि वर्गों।

Representative Results

उदर सफेद पदार्थ में lysolecithin की फोकल इंजेक्शन लगभग 3 मिमी (चित्रा 2) की दूरी पर detectable है कि एक असतत demyelinating घाव पैदा करता है। घाव माइलिन के लिए कोर (MBP) और axons (SMI312) के immunohistochemical धुंधला 7 दिनों (चित्रा 3) में माइलिन की छीन लिया गया है कि एक्सोन से पता चलता है। 14 दिनों तक, कई एक्सोन remyelination की घटना से पता चलता है, जो इस MBP पॉजिटिव के छल्ले, से घिरे हैं। Oligodendrocyte वंश (PDGFRα, Olig2, CC1) की कोशिकाओं के लिए धुंधला हो जाना, 7 दिन, साथ ही OPCs की तुलना में परिपक्व oligodendrocytes के वितरण की तुलना में 14 दिनों में कोशिकाओं की कुल संख्या दोनों में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है (चित्रा 4) । इस खोज के अनुरूप, toluidine नीले रंग के साथ दाग semithin वर्गों इन मैं remyelinated कर रहे हैं यह दर्शाता है कि शायद ही कभी 7 दिन (चित्रा 5) में पता चला रहे हैं कि 14 दिनों में पतली मेलिन शीथ की उपस्थिति का पता चलता हैnternodes।

प्रक्रिया पशुओं के बीच अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। भारी साँस लेने की स्थिर स्थिति बदल जब रूपांतर तब होता है केशिका-यह आमतौर पर पर्याप्त बेहोश करने की क्रिया के साथ एक मुद्दा नहीं है। एक्सोन को नुकसान मॉडल एक का सबसे पहले प्रयोग के बाद से वर्णित किया गया है, जो घाव, के बहुत केन्द्र में छोड़कर कम से कम प्रतीत होता है। हम यह पीबीएस नियंत्रण इंजेक्ट में भी मानने योग्य है, क्योंकि यह कांच केशिका से यांत्रिक चोट होने का विश्वास है। फिर भी, परिवर्तनशीलता छोटा हो जाता है, और हम और एक समान प्रक्रिया का उपयोग कर दूसरों समूह 15 प्रति के रूप में कुछ के रूप में 4 जानवरों के साथ प्रयोगात्मक शर्तों के बीच मतभेद का पता चला है।

चित्र 1
इंजेक्शन लगाने के लिए सिरिंज का चित्रा 1. विधानसभा। (ए) इंजेक्शन सिरिंज का अखरोट टी पर पिरोया है वह अपने संभोग गूंथ समाप्त हो जाती है कि दो ferrules ऐसे द्वारा पीछा गिलास केशिका के फ्लैट अंत। केशिका मजबूती शंक्वाकार सामी में सुखद है एक बार, विधानसभा तंग इंजेक्शन लगाने सिरिंज के अंत पर हाथ खराब कर दिया है। (बी) भड़काना सिरिंज से जुड़ी धातु हब सुई के साथ एक रबर डिस्क के केन्द्र टुकड़ा और इसे नीचे स्लाइड आधार। (सी) भड़काना सिरिंज में समाधान lysolecithin वापस ले लें। (डी) धीरे lysolecithin की पहली बूंद सुई की नोक पर दिखाई देता है जब तक। (ई) भड़काना सिरिंज दबाना इंजेक्शन लगाने की बैरल में भड़काना सिरिंज डालें रबर डिस्क के साथ एक फर्म मुहर बनाने, सिरिंज। यह केशिका के अंत तक चलता है जब तक धीरे समाधान दबाना। इंजेक्शन लगाने सिरिंज में हवा के बुलबुले शुरू करने के बिना धातु हब सुई निकालने के लिए सवार पर दबाव बनाए रखते हुए सावधानी भड़काना सिरिंज वापस ले लें।/ 52,679 / 52679fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "अपलोड> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Eriochrome cyanine के साथ दाग घाव lysolecithin चित्रा 2. प्रतिनिधि। धारावाहिक वर्गों eriochrome cyanine के साथ दाग 14 दिनों में एक विशेषता lysolecithin घाव का (400 माइक्रोन अलग स्थान) माइलिन (नीला) कल्पना करने के लिए। कि demyelination उदर सफेद बात के लिए प्रतिबंधित है नोट और घाव व्याख्यान चबूतरे वाला / दुम दिशा में लगभग 3 मिमी तक फैला है। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. axons और माइलिन मेंlysolecithin मॉडल। (ए) एक दिखावा (पीबीएस) 7 दिनों में रीढ़ की हड्डी इंजेक्ट माइलिन के छल्ले से घिरे रहे हैं कि स्वस्थ एक्सोन से पता चलता है। 7 दिनों में घाव अपमानित माइलिन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक्सोन denuded शो lysolecithin (बी) ए। (सी) 14 दिनों में, एक एक्सोन (सफेद तीर के साथ चिह्नित उदाहरण) का अनुपात माइलिन के छल्ले के फिर से बाहर निकलना के साथ जुड़े रहे हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा lysolecithin मॉडल में 4. Oligodendrocyte वंश कोशिकाओं। (ए, सी) 7 दिनों में, CC1 + oligodendrocytes (मैजंटा सलाखों) के लिए एक बड़ा PDGFRα + OPCs का प्रतिनिधित्व (सफेद सलाखों) रिश्तेदार नहीं है; सलाखों के भीतर संख्या के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। Olig2 करने के लिए जांच की गई थीoligodendrocyte वंश कोशिकाओं का धुंधला पुष्टि करते हैं। (बी, सी) 14 दिनों में, वहाँ सात दिनों (पी <0.05, दो पूंछ टी परीक्षण की तुलना में oligodendrocyte वंश कोशिकाओं की कुल संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है, एन = समूह प्रति 4 )। 7 दिन (पी <.0001, फिशर सटीक परीक्षण) की तुलना में 14 दिनों में OPCs को oligodendrocytes के वितरण में एक उल्लेखनीय वृद्धि भी है। स्केल बार 10 माइक्रोन =। प्रत्येक क्षेत्र 60X का एक मूल बढ़ाई पर कब्जा कर लिया है। मान एसडी ± मतलब कर रहे हैं। * पी <0.05 का प्रतीक है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Lysolecithin मॉडल में चित्रा 5. Remyelination। (ए) एक गेंद से उदर सफेद पदार्थ की धारा semithin दाग एक पार के अनुभागीय toluidine नीलाlthy माउस (बी) 7 दिनों में। संबंधित माइलिन मोटाई के साथ कैलिबर की एक विस्तृत श्रृंखला पर एक्सोन से पता चलता है, मेलिन शीथ की कमी (ठीक नीचे) एक अप्रभावित क्षेत्र से सटे मनाया जाता है। 14 दिनों में (सी), बारीकी मेलिनकृत शीथ ( लाल तीर के साथ चिह्नित उदाहरण) remyelinated खंडों का संकेत घाव भर में दिखाई देते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पशु मॉडलों के एक नंबर एमएस, सबसे मान्यतापूर्वक प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) मॉडल का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। EAE में, कृन्तकों एक माइलिन पेप्टाइड का एक टुकड़ा के खिलाफ प्रतिरक्षित और आरोही पक्षाघात में प्रकट भड़काऊ घाव विकास से गुजरना कर रहे हैं। अर्द्ध या ultrathin के लिए ऊतक प्रसंस्करण जब सबसे पहले, भड़काऊ घावों के स्थान कुछ हद तक अनियमित है, और घावों लगाने: इस मॉडल immunomodulatory एमएस दवाओं के पूर्व नैदानिक ​​परीक्षण के लिए उपयोगी हो गया है, जबकि यह तीन मुख्य कारणों के लिए remyelination के अध्ययन के लिए आदर्श नहीं है वर्गों चुनौतीपूर्ण हो सकता है। दूसरा remyelination एक विशिष्ट समय के पाठ्यक्रम पर होता है, और एक एकल EAE घाव का सही उम्र नित्य गैर इनवेसिव चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के बिना नहीं जाना जा सकता है। तीसरे remyelination दवा के एक प्राथमिक परिणाम नहीं हो सकता EAE में दवा इलाज के बाद एक स्वाभाविक रूप से कृन्तकों में घटना है, और remyelination का सबूत है कि है, लेकिन मेंसूजन को कम करने के लिए एक उच्च माध्यमिक घटना बजाए।

Demyelination उत्पादन का एक अन्य आम तरीका आहार में तांबे chelator cuprizone शुरू करने से हासिल की है। यह सबसे विशेष रूप से महासंयोजिका में, बड़े पैमाने पर demyelination में यह परिणाम है। सबसे पहले, अक्षतंतु व्यास (और इस प्रकार माइलिन मोटाई) अन्य सीएनएस क्षेत्रों की तुलना में छोटे होते हैं, और इस तरह बारीकी remyelinated शीथ demyelinated कभी नहीं थे कि उन लोगों से पृथक किया जा सकता है: निम्न कारणों remyelination की एक साइट के रूप में महासंयोजिका का अध्ययन करने में सीमाएं हैं। माउस महासंयोजिका> 70% बिना मेलिनकृत एक्सोन 16 क्योंकि इसमें दूसरे, यह एक remyelinated खंड 17 सामान्य रूप से होता है, जो वयस्क, में क्षतिग्रस्त माइलिन या डी नोवो माइलिन संश्लेषण का सच मरम्मत है कि क्या यह स्पष्ट नहीं हो सकता है।

यह remyelination के अध्ययन के लिए सबसे अच्छा मॉडल विषाक्त पदार्थों के प्रत्यक्ष इंजेक्शन, या तो lysolecithin, ethid है कि हमारा विश्वास का हैदुम मस्तिष्क peduncles 18 या रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ में IUM ब्रोमाइड, या दूसरों को,। पूर्व स्थान ही सटीक 3-आयाम स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन द्वारा हासिल की है, और कारण अनुमस्तिष्क peduncles के छोटे आकार बड़ा कृन्तकों (चूहे) तक सीमित है। इस डे और remyelination का अध्ययन करने में ट्रांसजेनिक चूहों के व्यापक संसाधन शामिल नहीं है। रीढ़ की हड्डी है, तथापि, आसानी से सुलभ शल्य चिकित्सा कर रहे हैं कि कई बड़े सफेद बात इलाकों में शामिल है। व्याख्यान चबूतरे वाला वक्ष सेगमेंट में कशेरुकाओं के बीच रिक्त स्थान दुम वक्ष शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में एक आवश्यक कदम है, जो एक laminectomy के, बिना जरूरत के लिए रीढ़ की हड्डी के प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से उदर सफेद बात को निशाना बनाने का एक लाभ यह एक्सोन remyelination की मात्रा का ठहराव, जिससे पृष्ठीय सफेद पदार्थ की तुलना में समान रूप से बड़े होते हैं वह यह है कि एक कम अस्पष्ट कार्य-समान महासंयोजिका के साथ जुड़े चुनौतियों के लिए। इसके अतिरिक्त, उदर सफेद पदार्थ एक बहुत बड़ा टी का निर्माण करता हैइंजेक्षन करने के लिए क्षेत्र arget; एक ही विचलन पेट के बल अभी भी एक प्रमुख demyelinating घाव का उत्पादन होगा जबकि पार्श्व पृष्ठीय क्षेत्र में कई सौ माइक्रोन, स्तंभ के बाहर केशिका जगह होगी। कुछ प्रोटोकॉल पृष्ठीय और एक ही पशु 19 के उदर कॉलम दोनों में lysolecithin इंजेक्षन। यह उचित केशिका नियुक्ति की संभावना और कम जानवरों में मात्रात्मक घावों की संख्या दोनों में वृद्धि कर सकते हैं। प्रस्तुत मौजूदा डेटा आपरेशन के समय में 8-10 सप्ताह पुराने जानवरों से है, हम भी remyelination चार स्पष्ट रूप से धीमी होने के रूप में वर्णित किया गया है, जहां 8-10 महीने पुराने चूहों, पर एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर सफलता मिली है।

Remyelination की मात्रा का ठहराव एक तुच्छ उपक्रम नहीं है। एक केंद्रीय हठधर्मिता remyelinated खंडों उनके स्वस्थ समकक्षों की तुलना में औसतन लंबाई में छोटी और पतली हैं, और पार के अनुभागीय अर्द्ध ओ के इस प्रकार जी अनुपात गणना (अक्षतंतु व्यास अक्षतंतु + माइलिन व्यास द्वारा विभाजित) कि positsआर ultrathin वर्गों मानक प्रक्रिया बन गए हैं। हालांकि, यह remyelinated खंडों समय 2 से अधिक मोटा होना और remyelinating oligodendrocytes के ट्रांसजेनिक संवाददाता का उपयोग करते हुए एक ताजा अध्ययन में कई internodes अंततः नियंत्रण 20 से पृथक हो जाते हैं कि पता चलता है कि जाना जाता है। घाव के भीतर परिपक्व oligodendrocytes की संख्या बढ़ाता oligodendrocytes internodes की एक विस्तृत संख्या बनाने में सक्षम हैं, के रूप में की मरम्मत को मापने के लिए एक अप्रत्यक्ष तरीका है, और remyelination-निर्भर मॉडल पर का एक महत्वपूर्ण अनुपात इस्तेमाल कर सकते हैं श्वान कोशिकाओं 3 से होते हैं। Remyelination नाटकीय चालन 21 की बहाली के लिए जोड़ा गया है के रूप में बेशक, मरम्मत का अंतिम मीट्रिक न्यूरोलॉजिकल घाटा के कार्यात्मक वसूली होगी। Remyelination कुछ प्रजातियों 22,23 में समारोह की वसूली करने के लिए जोड़ा गया है, वहीं यह murine lysolecithin अध्ययन में एक मानक प्रक्रिया नहीं बन गया है। इस वजह से प्रकट observ की कमी होने की संभावना हैऐसे EAE और यहां तक ​​कि cuprizone के रूप में और अधिक मजबूत demyelination मॉडल की तुलना में पृष्ठीय या उदर या तो घावों से सक्षम घाटे,। हम remyelination साथ इंजेक्शन, और बाद में वसूली lysolecithin से उत्पन्न कार्यात्मक घाटे, केवल ठीक ज्ञानेन्द्रिय कामकाज के प्रति संवेदनशील परीक्षण का उपयोग नमूदार हो जाएगा कि विश्वास करते हैं।

एक अशिष्ट methodological दृष्टिकोण यद्यपि, ऊपर सूचीबद्ध पशु मॉडलों में से किसी के साथ "remyelination" की एक की खोज, EAE (188) और cuprizone (197) की तुलना में (109) lysolecithin के लिए कम खोज हिट पता चलता है। Demyelination lysolecithin remyelination के अध्ययन के लिए बेहतर दृष्टिकोण है कि हमारे तर्क है, यही कारण है अगर ऐसा है, कम से कम चर्चा की? शायद इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक आशंका सर्जिकल आपरेशन प्रदर्शन में तकनीकी कठिनाई के एक विश्वास से निकला है। वास्तविकता में, इस प्रक्रिया के सभी वाणिज्यिक कर रहे हैं कि सामग्री की आवश्यकता होती है, तेजी से, लागत प्रभावी है, और कोई दिनचर्या ऊतक विच्छेदन की तुलना में अधिक मुश्किल हैखासकर उपलब्ध है। यह इस प्रोटोकॉल माइलिन मरम्मत के रोमांचक और क्षेत्र के विस्तार के अध्ययन के लिए अपने प्रदर्शनों की सूची के लिए इस शक्तिशाली मॉडल जोड़ना चाहते हैं कि उन लोगों के लिए उपयोगी साबित होता है कि हमारी आशा है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
spring scissors Fine Science Tools 15004-08
forceps Fine Science Tools 11254-20
retractor Fine Science Tools 17003-03
clippers Philips QG3330
heating recovery chamber Peco Services V1200
surgical tape 3M 1527-1
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
scalpel blade Feather No. 15
sponge spear Beaver Visitec 581089
5-0 Vicryl sutures Ethicon J511G
curved ToughCut spring scissors Fine Science Tools 15123-12
32 G metal needle BD 305106
needle holders Fine Science Tools 12002-14
angled forceps Fine Science Tools 11251-35
cotton tipped applicator Puritan 806-WC
gauze pads Safe Cross First Aid 3763
10 μl syringe Hamilton 7635-01 make sure to purchase the microliter, not gastight syringe
compression fitting Hamilton 55750-01 contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit
priming kit Hamilton PRMKIT contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs
pre-pulled glass capillaries WPI TIP10TW1 (pack of 10) contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1)
stereotactic frame David Kopf instruments Model 900
Ultrasonic cleaner Fisher Scientific FS-20
Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound VWR 25608-930
Tissue-Tek intermediate cryomold VWR 25608-924
cryostat Leica CM1900
microscope slides VWR 48311-703
bright field microscope Olympus  BX51
ultramicrotome Leica EM UC7 EM UC7
Lysophosphatidylchoine Sigma L1381
2-methylbutane Sigma M32631
Triton x-100 Sigma X-100
goat serum Sigma G9023
Mouse anti-SMI312 antibody Covance SMI-312R 1:2,000 dilution
Rabbit anti-MBP antibody Abcam AB40390 1:1000 dilution
Goat anti-PDGFRα antibody R&D Systems AF1062 1:100 dilution
Rabbit anti-Olig2 antibody Millipore AB9610 1:200 dilution
Mouse anti-CC1 antibody Calbiochem OP80 1:200 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Life technologies A-11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG Life technologies A-11003 1:500 dilution
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Jackson Immuno 705-546-147 1:500 dilution
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG Jackson Immuno 715-586-151 1:500 dilution
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Jackson Immuno 711-606-152 1:500 dilution
PBS Oxoid BR0014
isopropyl alcohol Sigma 109827
ketamine CDMV
xylazine CDMV
iodine West Penetone 2021
Vaseline petroleum jelly VWR CA05971
paraformaldehyde Sigma P6148
sucrose Sigma S5016
Eriochrome Cyanine R Sigma 32752
sulfuric acid Sigma 320501
iron(III) chloride Sigma 157740
ammonium hydroxide Sigma 320145
Acrytol Leica Biosystems 3801700
Citrisolv Fisher Scientific 22-143-975
horse serum Sigma H0146
glutaraldehyde Electron Micrscopy Sciences 16220
osmum tetroxide Electron Micrscopy Sciences 19150 highly toxic
potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate Sigma P3289
corn oil Sigma C8267
polyvinyl alcohol Sigma P8136
glycerol Sigma G9012
cacodylic acid Electron Micrscopy Sciences 12300
propylene oxide Electron Micrscopy Sciences 20401
EMBED kit Electron Micrscopy Sciences 14120
Toluidine Blue O Sigma T3260
Sodium tetraborate decahydrate Sigma S9640
Recipes
Eriochrome cyanine solution
Ingredient Amount to add
Eriochrome Cyanine R 0.8 g
sulfuric acid 400 ml 0.5%
iron(III)chloride 20 ml 10%
water 80 ml
*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.
Gelvatol
Ingredient Amount to add
PBS 140 mL
polyvinyl alcohol 20 g
glycerol 40 g
*mix well, place at  37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 97 demyelination remyelination lysolecithin रीढ़ की हड्डी oligodendrocyte माइलिन एकाधिक काठिन्य
Lysolecithin की फोकल इंजेक्शन द्वारा प्रायोगिक Demyelination और murine स्पाइनल कॉर्ड की Remyelination
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Keough, M. B., Jensen, S. K., Yong,… More

Keough, M. B., Jensen, S. K., Yong, V. W. Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin. J. Vis. Exp. (97), e52679, doi:10.3791/52679 (2015).

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