Summary
Classica analisi forelimb asimmetria del test del cilindro viene normalmente utilizzato per valutare deficit comportamentali nei ratti seguenti lesione cerebrale o ictus; tuttavia, esso non riesce a rilevare deficit consistenti in topi. Questo studio dimostra che quantificare il comportamento zampa-trascinamento è un'analisi più sensibile di lesioni cerebrali nei topi.
Abstract
Il test del cilindro è abitualmente utilizzato per prevedere il danno ischemico focale alla corteccia motoria degli arti anteriori nei roditori. Quando è inserito nel cilindro, roditori esplorano da allevamento e toccando le pareti del cilindro con le zampe degli arti anteriori per il supporto posturale. A seguito di danno ischemico alla corteccia sensomotoria zampa anteriore, i ratti si affidano maggiormente alle loro arti anteriori zampa inalterata per il supporto posturale conseguente minor numero di tocchi con la zampa interessata che è chiamato arti anteriori asimmetria. Al contrario, danno ischemico focale nel cervello di topo non riesce a portare a deficit consistenti simili in forelimb asimmetria. Mentre i deficit forelimb asimmetria sono raramente osservati, i topi non mostrano un romanzo comportamento post ictus chiamato "zampa-trascinamento". Paw-trascinamento è la tendenza per un mouse per trascinare la zampa interessata lungo la parete del cilindro, piuttosto che spingere direttamente fuori dal muro quando smontando da un posteriore per una presa di posizione a quattro zampe. Abbiamo già dimostrato checomportamento trascinando la zampa è molto sensibile alle piccole lesioni ischemiche corticali alla corteccia motoria degli arti anteriori. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi-zampa di trascinamento. Definiamo cosa una zampa-resistenza è e dimostrare come quantificare il comportamento-zampa di trascinamento. Il test del cilindro è un test semplice ed economico da gestire e non richiede pre-formazione o strategie privazione alimentare. Utilizzando analisi-zampa trascinando al test del cilindro, si riempie una nicchia per predire le lesioni ischemiche corticali, come photothrombosis e endotelina-1 (ET-1) ischemia indotta - due modelli che sono sempre più in popolarità e producono lesioni focali più piccoli di occlusione dell'arteria cerebrale media. Infine, misurando il comportamento-zampa trascinando nel test del cilindro permetterà studi di recupero funzionale dopo lesione corticale utilizzando una vasta coorte di ceppi di topi transgenici in cui precedente analisi forelimb asimmetria non è riuscita a rilevare i deficit consistenti.
Introduction
L'obiettivo di strategie di risanamento neurali è quello di dimostrare sia la riparazione dei tessuti e recupero funzionale. Il recupero funzionale è in genere valutata con test comportamentali che misurano deficit funzionali, in questo caso che coinvolge le abilità motorie che sono associati con danni alle regioni specifiche del cervello. Lesione cerebrale traumatica o danno ischemico all'area forelimb sensomotoria della corteccia possono essere dimostrati da una serie di test comportamentali. Uno di questi test, il test del cilindro è ampiamente utilizzata nei ratti per valutare deficit funzionali all'attività degli arti anteriori 1. Il test ha un basso costo di set-up che richiede solo un cilindro, fotocamera e tavolino con trasparente. E 'facile da gestire in quanto si basa sul comportamento esplorativo naturale dei roditori, quindi non sono necessari pre-allenamento e privazione di cibo o ricompense. Nonostante questi numerosi vantaggi, il test cilindro è sottoutilizzato per valutare i deficit degli arti anteriori nei topi dopo lesioni focali alla zampa anteriore sensorimotor corteccia, che si attribuisce all'analisi del comportamento topo nel test del cilindro. Asimmetria forelimb è la misura classica di analisi per il test del cilindro. Quando è inserito nel cilindro, roditori naturalmente esplorare le pareti del cilindro da allevamento sui loro arti posteriori e toccando le pareti del cilindro con le zampe degli arti anteriori per l'equilibrio posturale. Il numero di tocchi zampa muro con ogni zampa anteriore è facilmente quantificato riprese roditori durante questa esplorazione del cilindro. Asimmetria zampa anteriore si verifica quando la zampa zampa anteriore colpita rende meno tocchi con la parete che la zampa anteriore zampa inalterato ed è indicativa di un danno alla corteccia sensomotoria controlaterale. Nei ratti, le iniezioni intra-corticali dell'agente vasocostrittiva, endotelina (ET-1), nella corteccia sensomotoria forelimb provoca una lesione ischemica focale che si traduce in deficit comportamentali nella zampa anteriore controlaterale. Deficit in uso forelimb controlaterale sono facilmente rilevati come variazioni di forelimb asimmetria nel test del cilindro in ratti 1-3. A differenza di ratti però, i cambiamenti nella zampa anteriore asimmetria sono variabili e meno consistente nei topi dopo comparabili ET-1 iniezioni 4-6. Qui mostriamo una nuova analisi del comportamento degli arti anteriori nel test del cilindro - analisi del comportamento-zampa di trascinamento. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'analisi zampa trascinamento è una misura più sensibile di danno al forelimb sensorimotor corteccia nei topi rispetto all'analisi forelimb asimmetria classica e quindi è applicabile ad una varietà di modelli di lesioni focali corticali.
L'esame di come i contatti delle zampe anteriori la parete del cilindro seguente danno ischemico alla corteccia sensomotoria forelimb rivelato un comportamento romanzo nei topi - zampa-trascinamento 4. Una zampa-trascinamento si verifica quando il mouse si trova sulle zampe posteriori per esplorare la parete del cilindro poi trascina il suo affetto zampa (contra-lesionale) lungo la parete del cilindro verso la sua linea mediana o verso il basso il tempo murola sua zampa inalterato fornisce supporto posturale contro il muro. Paw-trascina raramente si verificano nei topi incolumi dunque l'aspetto di una zampa-resistenza è un indicatore positivo di lesioni alla corteccia sensomotoria forelimb 4. Abbiamo già quantificato comportamento zampa trascinando nei topi dopo ET-1 danno ischemico al forelimb sensomotorio corteccia e abbiamo dimostrato il comportamento-zampa trascinando sostenuta nei topi fino a due settimane post-ictus 4. Qui mostriamo che il comportamento-zampa trascinamento è sostenuta fino a quattro settimane post-ictus. Analisi del comportamento della zampa trascinando fornisce uno strumento nuovo e sensibile per la valutazione danno ischemico focale alla corteccia sensomotoria arti anteriori nei topi. Il suo basso costo di set-up, la facilità di amministrazione e segnando fanno di questo uno strumento semplice, ma utile per valutare rapidamente deficit comportamentali degli arti anteriori nei topi.
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Protocol
Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Memorial University of Animal Care Comitato Etico di Terranova secondo le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali.
1. Mice
- Utilizzare topi adulti. In questo studio, sono stati utilizzati topi maschi adulti FVBN (n = 10) tra 2-4 mesi. Topi di casa su un 12:12 ora inversione del ciclo luce-buio e forniscono chow roditore standard ed acqua ad libitum.
2. I materiali richiesti per il Test cilindro
- Ottenere un tavolo con un top trasparente per filmare il test del cilindro. Le dimensioni della tabella sono irrilevanti, il superiore deve essere plexiglass o vetro, e ci deve essere abbastanza spazio per posizionare uno specchio in calce. Questo permette il mouse per essere videoregistrate dal basso. Usare uno specchio calce per riflettere l'immagine attraverso il cilindro. In alternativa, utilizzare una telecamera capovolta se disponibile. Le dimensioni del tavolo utilizzati in questo protocollo sono 54 x 56 x 66,5 centimetri (WxLxH) con un 51 x 51 centimetri superiore (axl).
- Ottenere uno specchio. Le dimensioni dello specchio utilizzati nel presente protocollo sono 34 x 58cm (axl).
- Ottenere un cilindro trasparente / plexiglass per il mouse per eseguire in. Le dimensioni del cilindro utilizzati in questo protocollo sono 17,5 centimetri alto, 8,8 centimetri ID, 9,5 centimetri diametro con uno spessore di 0,35 centimetri. Un cilindro più alto può essere richiesto per i ceppi più attivi del mouse.
- Posizionare il cilindro sul tavolo e filmare il riflesso nello specchio di seguito.
- Sono necessarie una videocamera e cavalletto. Registrare video a circa 650KB / s, che è di circa 190 MB per ogni 5 minuti di video di cilindro. Assicurarsi che la fotocamera ha una funzionalità di zoom per garantire che il cilindro abbraccia l'intero campo visivo.
NOTA: La videocamera utilizzata in questo protocollo è una Sony DCR-SR42, zoom ottico 40x, zoom digitale 2,000x, 680kpix che utilizza la definizione standard, NTSC video interlacciato). - Ottenere software per l'analisi - un pl multimedialeayer con supporto video e modulazione della velocità di riproduzione. Il lettore multimediale utilizzata in questo protocollo è la v2.1.2 VLC Media Player.
- Ottenere un computer con un sistema operativo in grado di eseguire il lettore multimediale e un monitor.
- Per una conservazione elettronica per i video. Scaricare video da un disco rigido esterno o copiarlo su DVD per la conservazione a lungo termine.
NOTA: A 190MB per video, 84 sessioni di stare su una scheda SD da 16 GB e 168 sessioni di stare su una scheda SD da 32 GB. A causa della relativa economicità dei media SD, e l'incertezza in quanto tempo alcuni topi richiedono di completare 20 gomme posteriori, si consiglia una scheda da 32 GB. In questo studio, i video sono stati copiati dalla fotocamera a un hard disk esterno da 2 TB e poi ricopiati su DVD come backup.
3. Setup sperimentale della prova Cilindro
- Fissare mirror qui sotto il tavolo in un angolo di 45 gradi al piano del tavolo. Farlo utilizzando due staffe di supporto attaccati alle gambe del tavolo a support la parte superiore e inferiore dello specchio, rispettivamente. Località staffe sono noti in una vista laterale della tabella (Figura 1A) e una vista faccia sul tavolo (Figura 1B).
- Posizionare cilindro sul centro del tavolo. Disegnare quattro linee equidistanti cui il cilindro si siede sul tavolo con un pennarello nero (Sharpie) in modo che il cilindro può essere sollevato e restituito alla stessa posizione (figura 2). Li disegno sul lato inferiore del tavolo trasparente permette il tavolo da pulire tra sperimentazione animale senza dissolvere l'inchiostro indicatore.
- Fissare la macchina fotografica e cavalletto. Puntare la fotocamera a specchio in modo che l'immagine guarda direttamente attraverso la canna del cilindro. Assicurarsi che la parete interna del cilindro pieno è visibile e ostruita dalla base (Figura 3). Vedere una vista laterale-on della configurazione, compreso l'angolo relativo della configurazione della telecamera e specchio, dall'alto (figura 4A) e dallivello della falda, compreso un allevamento mouse (Figura 4B).
- Preparare le carte cue per identificare ogni mouse prima delle riprese. Assicurarsi che le carte includono tipicamente un numero di identificazione per ciascun topo, il time-point della prova (ad es., 3 giorni dopo il trattamento) e la data della sessione riprese. Non includere il gruppo di trattamento sulla carta spunto per garantire lo sperimentatore è accecato.
- Film in condizioni di illuminazione interna standard come questo livello di luce è necessaria per vedere chiaramente i movimenti del mouse intorno al cilindro.
NOTA: Se disponibile riprese al buio con una fotocamera luce rossa può essere sufficiente, ma ci si deve prima verificare se tocchi zampa e trascina sono chiaramente visibili per la quantificazione.
4. Esecuzione
- Iniziare le riprese. Visualizza la scheda spunto del mouse adeguato davanti all'obiettivo della fotocamera.
- Abbassare il mouse nel cilindro dall'alto aperto subito dopo aver girato la scheda cue.
- Iniziate le riprese del mouse. Ridurre al minimo il rumore durante questo periodo, come i topi potrebbero perdere interesse ad esplorare se spaventato.
- Osservare la parte posteriore topi di esplorare il cilindro. Cattura il video fino a quando il mouse esegue un minimo di venti posteriori.
NOTA: A posteriori si verifica quando entrambi zampe anteriori perdono contatto con il pavimento e il mouse si erge sulle zampe posteriori. - Pulire tavolo e cilindro con una soluzione di pulizia adeguato tra ogni mouse per igienizzare ed eliminare profumi del mouse.
- Il congelamento è quando i topi smettere di esplorare e rimanere tranquillamente seduto a quattro zampe per circa 5 minuti. Se topi congelare prima che si verifichino venti retri, può essere necessario rimuoverli dal cilindro per 10-20 minuti prima di riprendere la prova. Se i topi non eseguono venti posteriori, vengono rimossi dallo studio.
NOTA: Nella nostra esperienza, i topi hanno mai avuto bisogno di essere esclusi a causa di mancanza di esplorare il cilindro.
5. Valutazione del Test Cilindro con Paw-trascinamentoAnalisi
- Riprodurre il video a un tasso compreso tra 0,25x e 0.67x velocità normale a seconda di quanto velocemente il mouse esplora il cilindro. Utilizzare un lettore multimediale che offre una velocità di riproduzione lenta.
- Quantificare il numero totale di tocchi zampa. Tocchi Paw si verificano quando le ruote posteriori del mouse (Figura 5A), tocca il lato del cilindro (Figura 5B), poi smonta con entrambe le zampe contemporaneamente (Figura 5C) e terre (Figura 5D). La zampa può o non può contattare la parete del cilindro con una palma piena, ma qualche contatto con la parete del cilindro deve avvenire. Valutare tocchi zampa contando il numero di volte che il mouse entra in contatto (per quanto breve) con la parete del cilindro con una o entrambe le zampe anteriori mentre permanente sulle sue arti posteriori durante una posteriore.
Si noti che il contatto con la parete del cilindro viene conteggiato solo come "touch paw" o "zampa trascinare" se il mouse è in posizione arretrata - piedisui suoi arti posteriori con entrambe le zampe anteriori fuori del piano del tavolo. Se il mouse rimane in una posizione di 3 punti - entrambi gli arti posteriori e una zampa sul tavolo e comincia a toccare il muro con la zampa libera - questo non viene conteggiato come un tocco zampa. I topi possono posteriore e toccare la parete del cilindro con una sola zampa anteriore e questo viene considerato come un tocco di zampa. Nota: un mouse può spostare il proprio corpo intorno al cilindro durante una posteriore, rendendo più di due contatti. Questi contatti sono conteggiati - uno per ogni tocco di zampa anteriore sinistra e uno per ogni tocco zampa anteriore destra. - Quantificare il numero di zampa-trascina. Comportamento trascinando Paw è distinta dalle normali tocchi zampa.
- Se i contatti zampa parete del cilindro con un pieno palma aperta (Figura 6B), che cadrà lentamente dalla parete, spesso con un leggero tremore. Il movimento inizia con le cifre trascinamento contro la parete del cilindro sia in direzione mediale o verso il basso, (Figura 6C) prima allontanamento completely (Figura 6D). Il mouse sarà quindi smontare con la sua zampa inalterato (Figura 6E) prima di atterrare a quattro zampe (Figura 6F). Questo è considerato una zampa-resistenza e dovrebbe essere considerata in un conteggio.
- Se il paw non tocchi la parete del cilindro con una palma completamente aperta, esso sfiorare la parete del cilindro con le cifre prima allontanamento dalla parete del cilindro. Allo stesso modo, un mouse può trascinare la zampa contro la parete del cilindro, ma non rilasciarlo completamente prima di scendere. Questi sono entrambi considerati zampa-trascina così come tocchi e dovrebbe essere considerato come sia in un conteggio.
- La zampa può anche trascinare lungo la parete del cilindro, mentre un mouse esplora il cilindro. In questo caso, la zampa seguirà la torsione del busto del mouse come esplora sinistra oa destra della sua posizione originale (Figura 7A-D) prima di smontaggio (Figura 7E). Questo non è considerato una zampa-trascinamento, in quanto dipende mouse scelta casualeuna direzione di esplorare e non dipende da quale emisfero corticale è stato danneggiato.
- Paw-trascina sono espressi in percentuale di zampa trascina per numero totale di tocchi zampa durante una sessione. Esprimere il numero di zampa-trascina come percentuale di contatti totali zampa per ogni zampa anteriore separatamente.
- Tocchi conseguente una zampa trascinare contano come una zampa trascinare e un tocco contemporaneamente. Così, se un mouse trascina la zampa ogni volta i contatti zampa la parete del cilindro, la percentuale paw trascinamento è espressa come 100%.
6. Ulteriori design sperimentale Suggerimenti
- Per ridurre al minimo le variabili estranee:
- Testare i topi allo stesso tempo ogni giorno test. Testare i topi durante il loro ciclo di veglia. Mantenere topi su un ciclo di luce retromarcia 12 ore facilita la prestazione.
- I topi possono essere riluttanti a esplorare il cilindro se ha sottolineato sia da rumore o un ambiente nuovo. Test topi nella loro camera di conservazione animale o di una stanza che abbiano ieen confidenza con riduce lo stress. Ciò si può verificare se la stanza è rumorosa, se il mouse è stato spintonato prima di entrare nel cilindro o per assuefazione.
NOTA: Il test dovrebbe essere effettuato una volta prima di manipolazione sperimentale di servire come una lettura di base. Dopo manipolazione, giorni di test sono a discrezione dello sperimentatore, se si consiglia di evitare un eccessivo numero di esposizioni al cilindro in un breve periodo di tempo. - Topi può diventare riluttanti a posteriori dopo 6-7 esposizioni verso il cilindro. Per questo studio, i topi sono stati testati nel cilindro per un totale di sette volte, prima di ischemia e nei giorni 1, 3, 7, 14, 21 e 28 post-intervento chirurgico.
NOTA: In questo studio abbiamo utilizzato il ceppo FVBN mouse. Abbiamo precedentemente testato topi C57BL / 6 nel cilindro e comportamento paw trascinando osservati dopo un ET-1 danno ischemico (dati non mostrati). C57BL / 6 topi sono stati più attivi che FVBN topi quando allevamento e spesso saltato sul bordo del cilindroprima di salire fuori. Cilindri Taller dovrebbero essere usati se i topi cercano di fuggire saltando.
7. L'endotelina-1 Chirurgia e infarto misurazioni del volume
- Eseguire endotelina-1 chirurgia e misurazioni del volume dell'infarto secondo protocolli precedentemente pubblicati 4. Per indirizzare anteriore corteccia motoria degli arti anteriori, ogni mouse dovrebbe ricevere tre ET-1 iniezioni alle seguenti coordinate: (i) +0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medio-laterale (ml) / - 1.2 dorso-ventrale (DV), ( ii) +0.4 AP / 1,25 ml / - 1.2 DV e (iii) +0,1 AP / 1,75 ml / -1.2 DV 4.
8. Analisi statistica
- Si raccomanda un due vie misure ripetute analisi della varianza (ANOVA) per analizzare la percentuale di zampa trascinamento per le zampe affetti e non tra i diversi punti di tempo.
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Representative Results
Abbiamo già dimostrato che il comportamento-zampa trascinando appare a seguito di una focale danno ischemico al forelimb sensomotorio corteccia ed è un indicatore positivo di danni 4. Iniezioni intra-corticali di ET-1 nella corteccia forelimb sensorimotor stati usati per indurre una lesione ischemica (Figura 8A, B). Questo studio ha esaminato se il comportamento-zampa trascinando prorogato per più di 14 giorni post-infortunio per il suo uso potenziale per valutare il recupero funzionale. I topi sono stati sottoposti alla prova di cilindro sul giorno precedente ET-1 iniezioni per punto di tempo pre-operatorio, e nei giorni 1, 3, 7, 14, 21 e 28 post-infortunio. Ad ogni punto di tempo, il numero di tocchi zampa e trascina zampa sono stati quantificati sia per la zampa colpite e inalterati. Due vie misure ripetute ANOVA sul numero di tocchi zampa rivelato significativi effetti principali di tempo [F (6.108) = 3.59, p = 0,0028] e soggetti [F (18.108) = 2.38, p = 0,0032] ma nessun effetto del trattamento(Tabella 1). Considerando che, utilizzando l'analisi standard di zampa anteriore asimmetria per il test del cilindro che quantifica tocchi zampa colpite rispetto totale tocchi zampa rivelato deficit comportamentali degli arti anteriori incoerente. A senso unico ripetute misure ANOVA sulla percentuale di utilizzo della zampa affetta rivelato un significativo effetto principale del tempo (p = 0.015), che ha seguito da test post hoc di Dunnett ha mostrato una significativa riduzione nella percentuale uso zampa interessata a 7, 14 e 21 giorni dopo -Chirurgia e recuperato da 28 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 8C). Al contrario, un modo ripetuto due misure ANOVA sul numero di zampa trascina rivelato significativi effetti principali di tempo [F (6.108) = 7.09, p <0.0001], trattamento [F (1,108) = 33.02, p <0.0001], interazione [ F (6.108) = 9.89, p <0.0001] e soggetti [F (18.108) = 4,84, p <0,0001]. Ulteriori analisi Bonferroni post hoc ha mostrato un aumento significativo del numero di zampa trascina in ogni tempo dopo l'intervento chirurgico (tabella 1). Allo stesso modo, un modo due misure ANOVA confrontando il numero dei colpiti ripetuto zampa-trascina rispetto totale tocchi zampa colpite rivelato significativi effetti principali di tempo [F (6.108) = 6,63, p <0.0001], trattamento [F (1,108) = 20.46, p = 0,0003], interazione [F (6.108) = 8.21, p <0.0001] e soggetti (matching) [F (18.108) = 7.35, p <0,0001]. Ulteriori analisi Bonferroni post hoc ha mostrato una significativa comportamento zampa trascinando fino a 28 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 8D). Il comportamento-zampa trascinando era specifico per l'arto interessato come nessun aumento o il cambiamento di zampa-trascinamento è stato osservato con l'arto inalterato. -Paw trascinando comportamento con la zampa anteriore interessata era significativamente elevato a 1, 3, 7, 21 e 28 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 8D). Comportamento trascinando Zampa ha alzato a 1 giorno post-operatorio con> 30% di tutti i tocchi zampa con la zampa anteriore colpita causando una zampa-trascina poi scesa al ~ 15% a 3 giorni dopo l'intervento chirurgico dove rimase fino al 28 giorno post-operatorio. A 28 giorni dopo l'intervento chirurgico, i topi sono stati sacrificati e volumi infarto valutati. Il volume medio di infarto per il gruppo era di 3,2 ± 0,4 micron 3 (n = 10 topi). Questi risultati mostrano che piccoli infarti corticali possono provocare deficit comportamentali significative e durature come misurati nella prova di cilindro. In sintesi, questi dati dimostrano che non solo è-paw trascinando altamente reattivo danneggiare alla corteccia forelimb sensorimotor, ma che paw-trascinamento persiste anche nel tempo e può essere utilizzato per valutare il recupero funzionale.
Figura 1. luoghi staffa per il fissaggio specchio posto sotto la tabella. (A) Vista frontale di tabella che mostra posizioni della staffa sulle gambe anteriori del tavolo. (A ') di ingrandimento superiore di inserto in A mostra l'ubicazione di staffe sul zampe anteriori. (B) Vista posteriore della tabella di spettacoloing posizioni staffa gamba posteriore. (B ') di ingrandimento superiore di inserto in B indicativa staffa sulle zampe posteriori del tavolo.
Figura 2. Marcatura la posizione per il posizionamento del cilindro sulla tavola. Foto del tavolo indicando posizionamento del cilindro con linee nere disegnate intorno al perimetro della base. Le frecce indicano le linee nere tracciate sul lato inferiore dei plexiglas utilizzati per il centraggio del cilindro sul tavolo.
Figura 3. Vista frontale della macchina fotografica e da tavolo set-up. La foto del tavolo dimostrare la linea di vista direttamente attraverso la canna del cilindro (freccia rossa).
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Figura 4. Una vista laterale della telecamera e tavolo set-up. La telecamera è rivolta direttamente alla base del cilindro. (A) Tabella e l'installazione della telecamera catturate da sopra. (B) Il tavolo e configurazione della telecamera prese al livello del tavolo, che mostra un allevamento topo nel cilindro.
Figura 5. Una sequenza di foto che dimostrano un mouse allevamento indenne. (A) Foto di un mouse prima di una posteriore. (B) Il mouse tocca la parete del cilindro con entrambe le zampe. (C) Per lo smontaggio, il mouse spingerà contro la parete del cilindro utilizzando entrambe le zampe, e (D) terreno su tutte e quattro le zampe. Zampa sinistra Lt = del topo, zampa destra Rt = del mouse.
Figura 6. Una sequenza di foto che dimostrano un ferito topo zampa-trascinamento. (A) Foto di un mouse prima di una posteriore. (B) Il mouse toccherà la parete del cilindro con entrambe le zampe; (C) poi lentamente lasciare che le cifre sulla zampa resistenza colpita verticalmente lungo la parete del cilindro; (D) prima di lasciare la zampa cadere dal muro. (E) Il mouse sarà poi smontare con la zampa inalterata e (F) terreno su tutte e quattro le zampe. Inserti alto ingrandimento in B, C e D dimostrano come i contatti delle zampe anteriori colpite la parete del cilindro. Zampa sinistra Lt = del mouse.
Figura 7. A 'non zampa-drag'. (A) Il mouse tocca la parete del cilindro con entrambe le zampe. (B) Il mouse torce torso lateralmente per esplorare la parete del cilindro. (C) Il topo ri-posizioni suo zampe anteriori che porta ad una nuova posizione lateralmente e trascina la zampa finale nella stessa direzione. (D) La zampa posteriore è piantato saldamente nella sua nuova posizione, e entrambe le zampe sono utilizzati per smontare (E) per tornare a tutte e quattro le zampe. Frecce rosse indicano posizione di zampe in posizioni di inizio e fine. Freccia rossa indica il movimento di trascinamento zampa lungo la parete del cilindro.
Figura 8. Paw-trascinamento comportamento è sostenuta per 4 settimane a seguito di un corticale focale, lesione ischemica. (A) ph Rappresentante otomicrograph di una sezione del cervello coronale violetto cresolo macchiato attraverso un ET-1 lesione ischemica a 28 giorni dopo l'intervento chirurgico. (B) di ingrandimento superiore di ET-1 lesione della zona in scatola in A. (C) Analisi di arti anteriori asimmetria nel test del cilindro a seguito di un ET-1 danno ischemico al sensomotorio forelimb mostra deficit comportamentali variabili. I dati sono espressi come media ± SEM. Mezzi sono stati analizzati mediante unidirezionali misure ripetute ANOVA rivelano un significativo effetto principale di tempo (p = 0,015) seguito da test post hoc di Dunnett confrontando tutti i mezzi per il mezzo prima del trattamento. (D) Analisi del comportamento a zampa di trascinamento nel test del cilindro rivela un deficit comportamentale zampa anteriore è sostenuta fino a quattro settimane a seguito di un infortunio ischemico ET-1-indotta. Mezzi sono stati analizzati da due vie misure ripetute ANOVA seguito dal test di Bonferroni posthoc. (N = 10) * P <0.05, ** P <0.01, *** p <0.001.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52701/52701fig8large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I punti chiave per stabilire quando quantificazione comportamento zampa trascinando nella prova del cilindro sono i seguenti: i) quantificare il numero di zampa trascina contro tocchi zampa totali per ogni zampa prima di lesioni cerebrali per stabilire una linea di base; ii) quantificare il numero di zampa-trascina contro tocchi zampa totali per ogni zampa dopo l'infortunio ischemico; e iii) di discriminare tra una zampa-resistenza e il movimento laterale della zampa lungo la parete del cilindro durante la rotazione laterale del tronco del mouse.
Paw-trascinamento è un comportamento romanzo che appare dopo un trauma alla corteccia sensomotoria arti anteriori. L'aspetto del comportamento paw trascinando quindi può essere utilizzata come un indicatore positivo che la corteccia sensomotoria zampa anteriore è stato danneggiato. I risultati rappresentativi mostrano che le piccole ET-1 infarti di circa 2-4 mm 3 in volume e localizzate al risultato corteccia sensomotoria arti anteriori nel comportamento zampa trascinamento. Questo è in contrasto con forelimb asimanalisi metria, che non riesce a rilevare i deficit consistenti nella percentuale di tocchi zampa colpite rispetto tocchi complessivi seguente ET-1 ischemici lesioni corticali 4-6. Analisi del comportamento-zampa trascinamento è quindi più sensibile nel rilevare un danno alla corteccia sensomotoria arti anteriori. Inoltre, perché paw-trascinamento è stata mantenuta fino a quattro settimane post-infortunio può anche essere adatto per analizzare il recupero della funzione. Come abbiamo già dimostrato che il comportamento-zampa trascinando correla con i danni alla corteccia sensomotoria forelimb 4, un numero qualsiasi di modelli lesioni possono beneficiare nell'avere questa analisi del test del cilindro. Anche se le grandi ferite, come mezzo di occlusione dell'arteria cerebrale e trauma cranico 7,8 mostrano deficit nella classica analisi forelimb asimmetria del test del cilindro, questi deficit spesso si risolvono nel tempo. In questi casi, paw-trascinamento, essendo una misura più sensibile di danno alla corteccia sensomotoria forelimb sarebbe useful nel rilevare deficit cronico, più sottili. Allo stesso modo in modelli di pregiudizio che mostrano risultati meno coerente con l'analisi zampa anteriore asimmetria classica, analisi-zampa trascinando sarebbe utile per individuare deficit comportamentali più consistenti. Paw trascinando analisi del test del cilindro ha applicazioni di massima per una varietà di modelli danno ischemico tra cui mezzo l'occlusione dell'arteria cerebrale, photothrombosis, strippaggio piale e ET-1, come dimostrato qui.
Ci sono una serie di test comportamentali utilizzati per analizzare il motore forelimb e deficit sensoriali seguenti lesioni alla corteccia sensomotoria. Il test della scala Montoya valuta zampa anteriore di raggiungere e afferrare i comportamenti 9,10. Allo stesso modo singolo pellet raggiungere e test di consumo di pasta analizzare l'attività motorio delle zampe e cifre 11,12. Analisi asimmetria forelimb del test del cilindro è associato con il supporto posturale quando il mouse è in alto sulle arti posteriori 1. Solo il numerodi contatti ogni zampa fa con la parete del cilindro viene quantificato. Come il paw fa contatto non viene esaminato e può essere ulteriormente indicativi di danno. Precedenti studi hanno quantificato la durata del supporto di ogni tocco zampe anteriori ed è risultato più consistente deficit nei topi seguenti ictus photothrombotic 13,14. I nostri risultati mostrano che la zampa trascinando nel cilindro appare dopo un trauma alla corteccia sensomotoria forelimb e può essere correlato ad una ridotta capacità di sostenere il suo peso con la zampa interessata e / oa causa di una perdita di ricezione sensoriale nella zampa. La zampa si osserva per entrare in contatto con la parete, ma non sembra mantenere una posizione di sostegno o aiutare a spingere fuori dal muro, ma piuttosto si sfila in quello che chiamiamo una zampa-trascinamento. Abbiamo osservato che il comportamento-zampa trascinamento si verifica in quasi tutti gli animali con un infortunio alla corteccia sensomotoria forelimb e coinvolge un modello molto particolare di comportamento, che rende molto forte nel prevedere lesioni corticali nella propria right. In questo senso, paw-trascinamento è uno strumento utile in una batteria di analisi comportamentali. È la combinazione di un costo di start-up bassa, facilità di somministrazione del test, e l'affidabilità dell'analisi-paw trascinamento che rende l'analisi zampa trascinamento del test del cilindro tale scelta interessante nel predire focale danno ischemico nel topo .
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Sig John Crowell e il signor Terry Upshall per la loro esperienza e assistenza tecnica con la fotografia e videografia. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a JLV dal Canadian Institutes of Health Research e la ricerca e sviluppo Corporation di Terranova e un cuore e Stroke Foundation of Canada Canadian partnership operativa per Stroke Recovery Catalyst sovvenzione. RBR era destinatario di un Keith Griffiths Memorial Heart & Stroke Foundation Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexi-glass cylinder | 17.5 cm high, 9.5 cm outer diameter, 8.8 cm inner diameter, wall thickness 0.35 cm (or 3.5 mm) | ||
| viewing table | 54x56x66.5 cm (width x length x height), top of table is a 51x51 cm sheet of plexiglass. | ||
| mirror | 34x58 cm mirror | ||
| video camera | Sony | DCR-SR42 | Video camera with onboard storage, SD functionality, 40x optical zoom |
| computer | Dell | Optiplex 760 | Processor: Intel, 3.0 GHz, Memory 4.00GB (RAM) |
| computer monitor | Samsung | S22C350H | |
| Excel (Microsoft Office Professional Plus) | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC Media Player | Video LAN | v2.1.2 | Media player with playback speed modulation and video support |
| External Hard Drive | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
References
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