Introduction
ويعمل الجهاز العصبي المعوي (ENS) التي تسيطر على الحركة، وامتصاص المواد الغذائية، وتدفق الدم المحلي، أمر ضروري في الحياة 1. يتم تشكيل ENS من قبل خلايا قمة العصبية (NCC) التي تتكاثر، الهجرة واستعمار القناة الهضمية، حيث تفرق في العقد تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. مرض هيرشسبرونغ (HSCR، الانترنت وراثة مندلية في مان)، وهو اضطراب خلقي multigeneic مع حدوث 1 في 4000 ولادة حية، يمكن اعتبار المرض prototypic لدراسة تشكيل ENS تعطلت. في HSCR، NCC تفشل في الهجرة إلى استعمار وأطوال مختلفة بين المعى المؤخر القاصي 2. بالإضافة إلى ذلك، ترتبط الجهاز الهضمي المشتركة الأخرى (GI) وجود عيوب التنموية في عدد من الأطفال، مثل التشوهات الشرجية، atresias المعوية، واضطرابات الحركة مع اضطرابات في وظائف ENS الأساسية، وعلى الأرجح يرتبط خفية، لا تقدر حق قدرها، والتغيرات التشريحية وتغييرات وظيفية في3-6 ENS. لذلك، قد التقنيات التي تسمح لنا لفهم المحددات التنموية لتشكيل ENS تسليط الضوء على المرضية والعلاج المحتملة للاضطرابات الجهاز الهضمي للأطفال.
وبعد الهجرة والاستعمار، NCC يفرق في الخلايا العصبية مع علامات محددة لالنمط الظاهري العصبي بهم. تتكون الخلايا العصبية كوليني ما يقرب من 60٪ من الخلايا العصبية المعوية 7، ويمكن الكشف عنها بواسطة تلطيخ للأسيتيل كولين (الدردشة)، الانزيم توليف لالناقل العصبي الأسيتيل كولين مثير. تاريخيا، يحاول تصور ومرتبك الخلايا العصبية الكوليني التي كتبها اختلاف مستضد خصوصية الأجسام المضادة الموجهة ضد النظام العصبي المركزي (CNS) دردشة مقابل الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) دردشة 8-10. ومع ذلك، الأجسام المضادة الموجهة ضد المشيمة دردشة تعترف كل من دردشة المركزية والطرفية 11-13، ولدينا تقنيات وصفها مؤخرا التي تسمح للvisualization من ENS الخلايا العصبية الكوليني مع حساسية عالية في التنمية في وقت سابق من تحقق مع خطوط مراسل دردشة 14.
هنا، نقدم تقنية لتشريح، وتحديد والمناعية من الفئران الجنينية GI الجهاز لتصور ENS العصبي التعبير في الخلايا العصبية. لهذه الدراسات، ولقد استخدمت الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية تزاوج مع R26R: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: floxSTOP الفئران tdTomato (كما هو موضح دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato في جميع أنحاء المخطوط): floxSTOP. ثم تم تزاوج هذه الحيوانات مع متماثل الفئران مراسل دردشة GFP، للحصول على الفئران التعبير عن كل صحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة 14. هذه الحيوانات مراسل هما على خلفية C57BL / 6J ومتاحة تجاريا (مختبرات جاكسون، بار هاربور، ME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت جامعة ويسكونسن رعاية الحيوان واستخدام اللجنة كافة الإجراءات.
1. إعداد حلول
- استخدام 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كما عازلة تشريح وحل الشطف.
- إعداد 30٪ سكروز عن طريق وزن 30 غرام من السكروز ومكان في زجاجة. إضافة 99 مل من برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 1 مل 10٪ أزيد الصوديوم. تخلط جيدا حتى يذوب كل من السكروز. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
- إعداد عرقلة الحل عن طريق خلط 1X PBS، 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1٪ تريتون-X-100. تخلط جيدا وتخزينها في الثلاجة لحين الحاجة إليها.
- إعداد 8٪ امتصاص العرق (PFA) حل في برنامج تلفزيوني 1X عن طريق وزن كمية مناسبة من PFA في برنامج تلفزيوني 1X ثم احتضان عند 65 درجة مئوية حتى يذوب تماما. متجر في 25 مل قسامات في -20 ° C الفريزر لحين الحاجة إليها. تمييع إلى 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X في يوم من الاستخدام.
2. الأجنة والوتر تشريحأيون
- وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وافقت البروتوكولات، الموت ببطء توقيت الماوس الحوامل ونقل الرحم إلى 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
- تحت المجهر تشريح باستخدام مقص حاد، وقطع جدار الرحم مفتوح لفضح الأجنة. إزالة الأجنة من الرحم والمكان إلى بيئة نظيفة 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
- الموت ببطء كل الجنين عن طريق قطع الرأس في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. إذا كنت تستخدم الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على البروتينات الفلورية، تحت إضاءة مضان، وتحديد الأجنة وراثيا إيجابية.
- تشريح الجهاز الهضمي من كل جنين باستخدام مجهر تشريح. باستخدام ملقط غرامة، توجيه الجنين مثل أن الجانب الأيسر ومتجهة لأعلى وعلى الجانب الأيمن هو ضد الجزء السفلي من طبق بيتري. إزالة جدار الجزء العلوي من الجسم من الجنين لفضح الأعضاء الداخلية. إدراج ملقط غرامة بين جدار الجسم الظهري والأعضاء الداخلية. كرتابعنا ملقط ضد بعضها البعض في عمل قطع مثل مقص لإزالة الأعضاء الداخلية من الجنين.
- مزيد من دون تشريح الجهاز الهضمي بعيدا عن الأجهزة المحيطة ومن ثم وضع كل الجهاز الهضمي في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
3. تثبيت للGI شيتاغونغ
- شطف كل الجهاز الهضمي 3 مرات مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X ثم قم باستبدال مع 4٪ PFA. إصلاح مساحات GI في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge على منصة هزاز في RT لمدة 1.5 ساعة. شطف مساحات GI 3 مرات لمدة 5 دقائق على RT ثم لمدة 1 ساعة على منصة هزاز. في هذه المرحلة، وتخزين مساحات GI في 4 ° C في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم لحين الحاجة إليها.
ملاحظة: بدلا من ذلك، تخزين الأجنة في 30٪ سكروز لمدة تصل إلى واحد من دون أي تأثير على سلامة الأنسجة. تخزين العينات في 30٪ سكروز يسمح معالجة لاحق من العينات إما لالمناعية أو إلى أكتوبر لالبرد sectioniنانوغرام. بدلا من ذلك، المضي قدما في بروتوكول المناعية المفصلة أدناه.
4. بروتوكول المناعية
- إذا تم تخزينها العينات في 30٪ سكروز، شطف لهم 3 مرات لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X على منصة هزاز.
- وضع مساحات GI إلى عرقلة الحل على منصة هزاز ل1H في RT.
- إزالة حل الحجب واحتضان مساحات GI مع كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل إما 4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية على منصة هزاز. استخدام 1: 1000 تخفيف البشرية الأضداد المضادة هو جين تاو (المصل تم الحصول عليها من المريض)، 1: 1000 تخفيف من الدجاج مكافحة الأخضر بروتين فلوري (GFP) الأجسام المضادة و 1: 100 التخفيف من الماعز الأجسام المضادة لمكافحة الدردشة.
ملاحظة: علينا الاستفادة من الأجسام المضادة لمكافحة البشري هو جين تاو التي تم الحصول عليها محليا من المريض، ومع ذلك، هي أضداد هو جين تاو المتاحة تجاريا، على سبيل المثال، والماوس المضادة للهو جين تاو، (استخدام في 1: 500 تمييع). - شطف مساحات GI في برنامج تلفزيوني 1X3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
- استبدال برنامج تلفزيوني 1X مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 500 في عرقلة الحل على منصة هزاز إما 4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام حمار مكافحة الإنسان وأمين صبغ رد الفعل مثل Dylight، حمار Cy2 مكافحة الدجاج وحمار المضادة للماعز Cy5. إذا باستخدام الماوس المضادة للهو الضد ثم استخدم 1: 500 التخفيف من حمار مكافحة الماوس أمين صبغ رد الفعل 405.
ملاحظة: كثافة GFP الذاتية وtdTomato التعبير ووضوح المناعية الزيادة مع التقدم في العمر التنموي. نحن immunostain عادة الشجاعة الجنينية بشكل فردي في 0.2 مل الأنابيب مع 150 ميكرولتر من الحل تلطيخ من أجل الحد من حجم الأجسام المضادة المستخدمة وأيضا لضمان كفاءة تلطيخ من الأنسجة. - شطف مساحات GI في برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
- ضع بضع قطرات من مضان تصاعد المتوسطة مع دابي على شريحة زجاجية. تزج هيئة تنظيم الاتصالات GIط م في المتوسط مضان تركيب وإضافة غطاء زجاجي مباشرة على الجزء العلوي من الأنسجة. مضان تصاعد -G المتوسطة هو مركب للذوبان في الماء الذي يوفر ختم شبه دائم.
ملاحظة: استخدام مضان المتوسطة المتزايدة مثل Vectashield وهو الجلسرين المستندة إلى تصاعد المتوسط الذي يمنع يتلاشى وphotobleaching من الأجسام المضادة. كل من هذه المنتجات تمكين الأنسجة ليتم تخزينها لفترات طويلة من الزمن في 4 ° C. - التقاط الصور من كل من fluorophore باستخدام مجهر متحد البؤر. استخدام موجات الإثارة لfluorophores والفلاتر المستخدمة الواردة في الجدول 3.
- لتحليل صورة بمساعدة الكمبيوتر باستخدام البرمجيات المناسبة تبعا لنوع من متحد البؤر استخدامها لالتقاط الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصفناها سابقا جيل من الفئران التعبير عن كل GFP وtdTomato للصحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة 14. باختصار، كانت تزاوج الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية مع R26R: floxSTOP: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: الفئران tdTomato (وتسمى دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato): floxSTOP. ثم تم تزاوج هذه الحيوانات مع متماثل الفئران مراسل دردشة GFP. تم عزل الأجنة وتم تشريح الأنسجة قبل أن يتم الثابتة وimmunostained على النحو الوارد أعلاه، مع الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1. وقد تم تحليل الأمعاء الدقيقة البعيدة (SI) والقولون الداني في E11، E13.5 وE16.5
في E11، الخلايا العصبية هو جين تاو إيجابية موجودة داخل SI البعيدة، ولكن NCC لم تصل بعد إلى القولون الداني (الشكل 1). في هذه المرحلة الزمنية، فإن غالبية الخلايا العصبية هو جين تاو إيجابية تظهر مناعية دردشة وكذلك GFP الإيجابية. ومن المثير للاهتمام، في هذه المرحلة الزمنية، EXPRession من tdTomato بناء دردشة لجنة المساواة العرقية ليست قابلة للكشف. قبل E13.5، فإن غالبية الخلايا العصبية هو جين تاو إيجابية على حد سواء دردشة الأشعة تحت الحمراء والدردشة GFP إيجابية، وهناك عدد قليل من الدردشة لجنة المساواة العرقية الخلايا العصبية tdTomato إيجابية وينظر. عدد الدردشة لجنة المساواة العرقية الخلايا العصبية tdTomato إيجابية الزيادات E16.5، ولكن لا يزال يشكل نسبة ضئيلة من عدد من الخلايا العصبية دردشة-IR.
الشكل 1. الصور التمثيلية للالكوليني الخلايا العصبية في القاصي الأمعاء الدقيقة والقولون في الجنينية يوم 11. وفي E11، في القاصي SI (المسمى "SI") والقولون الداني (المسمى "التعاون")، الخلايا العصبية هو جين تاو إيجابية (الأزرق) هي موجودة فقط داخل SI في هذه المرحلة. معظم الخلايا العصبية هو جين تاو إيجابية ويشترك في immunostained مع دردشة-IR (أبيض) والدردشة GFP (الخضراء). ومع ذلك، في هذه المرحلة الزمنية، فإن أيا من هذه الخلايا العصبية والدردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato إيجابي (الحمراء). جدولبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الصور التمثيلية للالكوليني الخلايا العصبية في القاصي الأمعاء الدقيقة والقولون في الجنينية يوم 13.5 و 16.5. وتظهر الصورة الخلايا العصبية كوليني في الأمعاء الدقيقة البعيدة في E13.5 (لوحات العليا) وE16.5 (لوحات أقل). في E13.5 كانت الغالبية العظمى من الخلايا العصبية هو جين تاو إيجابية دردشة الأشعة تحت الحمراء والدردشة GFP إيجابية (لوحات العليا). وهناك عدد قليل من هذه، أعرب المشارك دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato. قبل E16.5، تم العثور على المزيد من الخلايا العصبية دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato في العقد الناشئ (لوحات أقل). على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذه شملت رقمه.
| الأجسام المضادة الأولية | |||
| مولد المضاد | مستمنع | تخفيف | المورد وتفاصيل |
| هو جين (بروتين الخلايا العصبية البشرية) | البروتين هو جين تاو | 1: 1000 | المصل من المرضى من البشر (ماديسون، WI) |
| GFP (البروتين الفلوري الأخضر) | البروتين GFP، IGY جزء | 1: 1000 | أفيس مختبر، وشركة (تيغارد، OR)، بولكلونل الدجاج، GFP-1020 |
| دردشة (الكولين أسيتيل) | انزيم المشيمة البشرية | 1: 100 | ميليبور (فالجهاز يبث اشعة تماثل، MA)، الماعز بولكلونل، AB144P |
| الأجسام المضادة الثانوية | |||
| اسم | Fluorophore | تخفيف | المورد وتفاصيل |
| حمار مكافحة الإنسان Dylight 405 | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون (غرب بستان، PA)، 709-475-149 | |
| حمار مكافحة الدجاج | Cy2 | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون (غرب بستان، PA)، 703-225-155 |
| حمار مكافحة الماعز | Cy5 | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون (غرب بستان، PA)، 705-175-147 |
الجدول 1. تفاصيل الأجسام المضادة الأولية والثانوية التي استخدمت في الدراسة، والأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة في هذه الدراسة، جنبا إلى جنب مع الموردين والتخفيفات المستخدمة.
| الأجسام المضادة الأولية | |||||||
| مولد المضاد | تخفيف | مزود | الأجسام المضادة الثانوية | ||||
| Sox10 | 01:50 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، دالاس، TX | حمار مكافحة الماعز | ||||
| P75 | 1: 250 | PROMEGA، ماديسون WI | حمار المضادة للأرنب | ||||
| PGP9.5 | 1: 1000 | Abcam، كامبردج، MA | حمار المضادة للأرنب | ||||
| BFABP | 1: 500 | ميليبور، فالجهاز يبث اشعة تماثل، MA | حمار المضادة للأرنب | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO، كاربنتيريا، CA | حمار المضادة للأرنب | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO، كاربنتيريا، CA | حمار المضادة للأرنب | ||||
| nNOS | 1: 500-1،000 | Emson، كامبريدج، المملكة المتحدة | حمار مكافحة الأغنام | ||||
| VIP (فعال في الأوعية المعوية ببتيد) | 1: 500 | ابشتاين & بولسن، ماديسون، WI | حمار المضادة للأرنب | ||||
| مادة P | 1: 200-400 | DIASORIN، Stillwateص، MN | حمار مكافحة الأغنام | ||||
| الأجسام المضادة الثانوية | |||||||
| اسم | تخفيف | المورد وتفاصيل | Fluorophore | ||||
| حمار مكافحة الإنسان | 1: 500-1،000 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | Dylight 488 | ||||
| حمار مكافحة الإنسان | 1: 1000 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | CY3 | ||||
| حمار المضادة للأرنب | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | Dylight 488 | ||||
| حمار المضادة للأرنب | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | CY3 | ||||
| حمار مكافحة الأغنام | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | Cy2 | حمار مكافحة الأغنام | 1: 1500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | CY3 |
| حمار مكافحة الماعز | 1: 500 | ImmunoResearch مختبرات جاكسون، غرب غروف، PA | CY3 | ||||
الجدول 2. الأجسام المضادة إضافية الابتدائية والثانوية لاستخدامها في دراسة تطوير ENS، والأجسام المضادة الأولية والثانوية أننا قد استخدمت سابقا في دراستنا للتنمية ENS.
| إثارة | انبعاث | |||
| خط ليزر | Fluorophore نوع | أمثلة | مضخم أنبوب | خيارات التصفية |
| 408 نانومتر | أزرق | اليكسا فلور 405، تتالي الأزرق، الكومارين 30، دابي، هويشت، الأزرق المحيط الهادئ، ومعظم النقاط الكمومية | 1 | BP 425-475 نانومتر |
| 488 نانومتر | أخضر | اليكسا فلور 488، ATTO 488، Calcein، Cy2، EGFP، FITC، ولاية أوريغون الأخضر،-YO PRO-1 | 2 | BP 500-550 نانومتر |
| 561 نانومتر | أحمر | اليكسا فلور 546، 555، 568، و 594، CY3، الجاذبة، DsRed، mCherry، فيكوإيريترين (PE)، Propidium اليود (PI)، RFP، طمرة، tdTomato، TRITC | 3 | BP 570-620 نانومتر |
| 638 نانومتر | بعيدا الأحمر | فلور اليكسا 633 و 647، Allophycocyanin (APC)، Cy5، TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 نانومتر |
الجدول 3. متحد البؤر موجات الإثارة التصوير، fluorophores والمرشحات. وترد موجات الإثارة، fluorophores اكتشافها، والمرشحات المستخدمة. ويمكن استخدام هذه المعلومات في اختيار مجموعات من الأجسام المضادة الثانوية للمتعدد الألوان immunofluoresence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت مختبرنا وغيرها من الجهات التي عيوب المعوية في HSCR لا تقتصر على القولون بانعدام العقد ولكن تمديد قريب، حتى في الأمعاء الدقيقة عقدي 5،15،16. وتشمل هذه التغيرات تغيرات في الخلايا العصبية ENS الكثافة والعصبي النمط الظاهري وربما تمثل dysmotility التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من HSCR. لقد استخدمت التقنيات المذكورة أعلاه في جهودنا لفهم محددات تشكيل ENS. على وجه التحديد، وقد استخدمت هذه التقنيات لتصور الخلايا العصبية أكسيد النيتريك سينسيز (nNOS) الخلايا العصبية، الخلايا العصبية فعال في الأوعية ببتيد المعوية (VIP)، وكذلك أسيتيل كولين (الدردشة) الخلايا العصبية (الجدول 2) 5. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تخزين العينات في 30٪ سكروز للتجهيز لاحق، إما لالمناعية أو لتضمين وcryosectioning.
NCC الاستعمار من الأمعاء يحدث باعتبارها تقدم واجهة الموجة ومدمج E9.5 لE14.5. المناعية مع هو جين تاو، الذي يحدد الخلايا العصبية، كما هو موضح أعلاه، إلى جانب تحليل الصور بمساعدة الكمبيوتر، ويسمح لالمقارنات الكمية من كثافة الخلايا العصبية. تم العثور على تخفيضات في كثافة الخلايا العصبية أجزاء من الأمعاء عقدي من HSCR 5، وكذلك في نماذج أخرى من dysmotility المعوي 13. الفئران مع الشرطي حذف Hand2 تظهر التغييرات في نسب الخلايا العصبية معربا عن الناقلات العصبية المختلفة، فضلا عن انخفاض أعداد الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، الحيوانات مع الإفراط في التعبير عن رأس أو PTEN تبرهن زيادة كثافة الخلايا العصبية على طول الامعاء 6،17.
وينظم توازن الناقلات العصبية بين الخلايا العصبية الظواهر من ENS بإحكام، مما أدى إلى تقلص المنسق لجدار الأمعاء لحركة محتويات اللمعية، وتنظيم تدفق الدم وامتصاص العناصر الغذائية. مرة واحدة NCC الحصول على هوية الخلايا العصبية، وهناك نافذة ضيقة من الوقت قبلالالتزام النمط الظاهري العصبي 14. نحن في الآونة الأخيرة أنه المناعية يحدد عصبي النمط الظاهري دردشة في E10.5، مرحلة جنينية في وقت سابق مما لوحظ مع نماذج مراسل الوراثية (على سبيل المثال، والدردشة، لجنة المساواة العرقية أو الدردشة GFP) 14. بالإضافة إلى ذلك، دردشة الخلايا العصبية مناعيا تصل إلى مستوى الكبار (كنسبة من جميع الخلايا العصبية ENS) في وقت مبكر في عملية التنمية، وهي النتيجة التي تشير إلى أن الخلايا العصبية الدردشة قد يكون له دور في تنظيم المزيد من تمايز الخلايا العصبية في ENS.
النيتريك سينسيز أكسيد (NOS) هو الناقل العصبي الأساسي الاسترخاء وجدت في ENS، ويتم زيادة متناسبة في الخلايا العصبية ENS على طول الأمعاء في HSCR 5. بالإضافة إلى ذلك، وتعديلات في الببتيد المعوي الفعال في الأوعية (VIP)، وهو ناقل عصبي التي تشارك أيضا في التوسط في استرخاء العضلات وتنظيم تدفق الدم على طول جدار الامعاء، وتوجد في نماذج HSCR 5. وتشير هذه البيانات إلى أن، من أجل فهم كيف يمكن للشركاتonents من ENS تنظم وظيفتها، ينبغي إجراء دراسة منهجية من الناقلات العصبية المختلفة. التقنيات المعروضة هنا يمكن تكييفها بسهولة للسماح لهذا النوع من التحليل عن طريق استخدام الأجسام المضادة المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل أعد الصورة جائزة طب الأطفال الأمريكية الجراحية جمعية مؤسسة (AG) والمعاهد الوطنية للصحة K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
