Introduction
운동성, 영양소 흡수 및 지방 혈액 흐름을 제어 작동 장용 신경계 (ENS)는, 생명에 필수적 일 것이다. ENS는 마이그레이션 그들이 신경 함유 신경 세포와 신경 교세포로 분화 장을, 식민지 증식 신경 능선 세포 (NCC)에 의해 형성된다. 히 르츠 프룽의 질병 (남자 HSCR, 온라인 멘델의 유전 법칙), 1 4,000에서 출산의 빈도와 multigeneic 선천성 장애, 중단 ENS 형성을 연구의 전형 질병으로 간주 될 수있다. HSCR에서 NCC는 마이그레이션 및 말초 hindgut 2의 가변 길이를 식민지화하는 데 실패. 또한, 다른 일반적인 위장 (GI) 등의 항문 직장 기형, 장 atresias 및 운동 장애와 소아의 발달 결함, 기본 ENS 기능의 장애와 연관되고, 가능성이 미묘한, 과소, 해부학 적 변화와 기능적 변화와 관련이있다ENS 3-6. 따라서, 우리는 ENS 형성의 발달 결정을 이해 할 수 있도록 기술은 병인과 소아 위장관 질환의 치료 가능성을 밝혀 수 있습니다.
마이그레이션 및 식민지에 따라, NCC는 신경 전달 물질의 표현형에 대한 특정 마커 신경 세포로 분화. 콜린성 뉴런 장용성 뉴런 (7)의 대략 60 %를 포함하고, 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (하는 ChAT), 흥분성 신경 전달 물질 인 아세틸 콜린 (acetylcholine)에 대한 합성 효소에 대한 염색하여 검출 할 수있다. 역사적으로, 콜린성 신경 세포가 중추 신경계에 대한 항체의 항원 특이성을 달리하여 혼동하고 시각화하는 시도 (CNS)는 8 ~ 10 채팅 말초 신경계 (PNS) 대 채팅. 그러나 태반 채팅에 대한 항체 모두 중추 및 말초하는 ChAT 11-13을 인식, 우리는 visua 수 있도록 최근에 설명 된 기술을 가지고고감도 ENS의 콜린성 뉴런의 사용 효율 초기 개발에서 채팅 기자 라인 (14) 달성되었다보다.
여기서는, 해부 뉴런 ENS 신경 전달 물질의 발현을 시각화 뮤린 배아 위장관 고정 및 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 생산 tdTomato 동물 채팅-Cre 호텔을, R26R을 : floxSTOP :이 연구를 위해, 우리는 R26R와 성관계 간담 Cre 호텔 쥐를 활용 한 floxSTOP : (원고를 통해 간담 Cre 호텔 tdTomato로 정의) tdTomato 마우스. 이들 동물은 다음 식 (14)하는 ChAT를 검출 형광 리포터를 모두 발현하는 마우스를 얻기 위해, 호모 간담 GFP 리포터 생쥐와 교배시켰다. 이 두 기자 동물 C57BL / 6J 배경에 있습니다 상업적 (잭슨 연구소, 바 하버, ME)을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
위스콘신 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 절차를 승인했다.
솔루션 1. 준비
- 해부 버퍼와 세척 용액으로 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 사용합니다.
- 병에 설탕과 장소의 30g의 무게로 30 % 자당을 준비합니다. 1X PBS의 99 ML을 추가하고 1 ml의 10 % 아 지드 화 나트륨을 추가합니다. 자당이 모두 용해 될 때까지 잘 혼합. 4 ℃에서 보관이 때까지이 필요합니다.
- 1X PBS, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 트리톤 X-100을 혼합하여 용액을 차단 준비한다. 철저하게 혼합하고 필요할 때까지 냉장고에 보관합니다.
- 1X PBS로 PFA의 적절한 양을 계량하여 1X PBS에서 8 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 준비하고 완전히 용해 될 때까지 65 ° C에서 배양한다. -20 ° C 냉장고에 25 ㎖ 씩에 보관이 필요할 때까지. 사용 당일 1X PBS로 4 % PFA로 희석.
2. 배아 및 굿 해부이온
- 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 프로토콜을 승인, 초과 임신 한 마우스를 안락사와 PBS 1X 60mm 페트리 접시 포함 얼음 추위에 자궁을 전송합니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 해부 현미경, 배아를 노출 열려 자궁 벽을 잘라. PBS 1X 얼음 추위가 포함 된 깨끗한 60mm 페트리 접시에 자궁과 장소에서 배아를 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운 1X PBS에서 잘린 각각의 배아를 안락사. 당신이 형광 단백질을 포함하는 형질 전환 마우스를 사용하는 경우, 형광 조명 아래, 긍정적 인 유전자 변형 배아를 식별합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 각각의 배아로부터 GI 관 해부. 미세 겸자 사용 왼쪽 위쪽으로 향하게되고, 우측은 배양 접시의 바닥에 대해되도록 배아 배향. 내부 장기를 노출 배아에서 상체 벽을 제거합니다. 등의 신체 벽과 내부 장기 사이의 미세 집게를 삽입합니다. CR배아에서 내부 장기를 제거하기 위해 가위와 같은 절단 작업에서 서로에 대한 집게를 OSS.
- 또한 주변 기관에서 멀리 위장관을 서브 - 해부하고 얼음처럼 차가운 1X PBS를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 각각 위장관을 배치합니다.
GI 책자 3. 고정
- 얼음처럼 차가운 1X PBS로 각각의 위장관 3 회 씻어 후 4 % PFA로 교체. 1.5 시간 동안 실온에서 흔들 플랫폼에 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에서 위장관 책자를 수정합니다. 락 플랫폼에서 1 시간 동안 다음 실온에서 위장관 책자 5 분 동안 3 번 씻어. 이 단계에서 필요할 때까지 1X PBS, 0.1 %의 아 지드 화 나트륨을 함유하는 30 % 수크로오스에서 4 ° C에서 GI 책자를 저장한다.
참고 : 또는 조직의 무결성에 영향없이 1 년에 대해 30 % 자당에 배아를 저장합니다. 30 % 자당의 샘플의 보관 면역 염색 또는 10월에 극저온 sectioni에 대한 하나의 샘플 나중에 처리를 할 수 있습니다NG. 또한, 아래에 설명 된 면역 염색 프로토콜을 진행합니다.
4. 면역 염색 프로토콜
- 샘플을 30 % 수크로오스에 저장되어있는 경우에는, 요동 플랫폼상에서 그들 1X PBS에 20 분 동안 3 회 헹군다.
- 실온에서 1 시간에 대한 락을 플랫폼에 솔루션을 차단에 위장 책자를 놓습니다.
- 차단 솔루션을 제거하고 락 플랫폼에서 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 4 시간 중 하나에 대한 차단 솔루션에 희석 일차 항체의 적절한 양의 위장 책자를 품어. (환자에서 얻은 혈청) 인간의 안티 후진타오 항체의 1,000 희석, 1 : 닭 반 녹색 형광 단백질 (GFP) 항체의 1,000 희석 1 : 염소 항 채팅 항체의 100 희석 1을 사용합니다.
주 : 우리는 환자로부터 로컬 얻었다 인간 항 주석은 항체를 이용하지만, 안티 주석은 항체는, 예를 들어 시판되고, 마우스 항 - 주석 (1에서 사용 : 500 희석). - 1X PBS에서 위장관 책자를 씻어3 시간 5 분 후, 요동 플랫폼상에서 실온에서 1 시간 동안.
- 1 희석 차 항체와 1X PBS를 교체 : (500)를 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 중 4 시간 동안 락을 플랫폼에 솔루션을 차단합니다. 이러한 Dylight, 당나귀 방지 닭 CY2와 당나귀 방지 염소 Cy5에로 당나귀 항 - 인간 아민 반응성 염료를 사용합니다. 당나귀 항 - 마우스의 아민 반응성 염료 405 500 희석 사용하여 마우스 항 - 후진타오 항체는 1을 사용하는 경우.
참고 : 내생 GFP 및 tdTomato 발현과 발달 연령 증가를 면역 염색의 선명도의 강도. 우리는 일반적으로 조직의 효과적인 염색을 위해 또한 사용될 항체의 양을 감소시키기 위해 개별적으로 염색 용액 150 ㎕를 0.2 ㎖의 튜브 용기가 발현 사이 배아. - 5 분 1X PBS 3 회에서 위장관 책자를 씻어 후 락 플랫폼에서 실온에서 1 시간 동안.
- 유리 슬라이드에 DAPI와 형광 장착 매체의 몇 방울을 배치합니다. 위장관 TRA를 담가형광 장착 매체에 CT 및 조직의 바로 위에 커버 유리를 추가한다. 매체 -G 장착 형광 반영구 시일을 제공 수용성 화합물이다.
참고 : 이러한 Vectashield으로 사용 형광 장착 매체 페이딩과 항체의 광표백 방지 매체를 장착 기반 글리세롤이다. 이러한 제품은 모두 조직을 4 ° C에서 장기간 저장 될 수 있습니다. - 공 초점 현미경을 사용하여 형광 각각의 이미지를 캡처합니다. 표 3에서 제시 형광 및 사용 필터의 여기 파장을 사용합니다.
- 이미지를 캡처하는 데 사용 촛점의 종류에 따라 적절한 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 보조 이미지 분석을 수행한다.
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Representative Results
우리는 이전하는 ChAT 식 (14)을 검출하고 tdTomato GFP 형광 리포터를 모두 발현하는 생쥐의 발생을 설명 하였다. floxSTOP : 간단히, 채팅-Cre 호텔 마우스가 R26R와 결합 된 생산 tdTomato 동물 채팅-Cre 호텔을, R26R을 : floxSTOP : (간담 Cre 호텔 tdTomato라고도 함) tdTomato 마우스. 이 동물은 다음 동형 접합 간담 GFP 기자 마우스를 결합했다. 배아를 분리 하였다 및 조직은 고정되기 전에 해부 및 표 1 항체로, 상기와 같이 면역 염색 하였다. 원위 소장 (SI) 및 근위 결장은 E11, E13.5 및 E16.5로 분석 하였다
E11에서, 주석 - 양성 신경 말단 SI 내에 존재하지만 아직 NCC 근위 결장 (도 1)에 도달하지 않았다. 이 시점에서, 주석 - 양성 신경 세포의 대부분 채팅 면역 반응뿐만 아니라 GFP 양성을 보여준다. 흥미롭게도,이 시점에서, 만약 expr채팅-Cre 호텔 tdTomato 구조의 ession은 검출되지 않습니다. E13.5으로, 후진타오 양성 신경 세포의 대부분 채팅-IR 및 채팅-GFP 양성 및 채팅-Cre 호텔 tdTomato 양성 신경 세포의 소수 볼 수 있습니다 둘 다. E16.5 의해 간담 Cre 호텔 tdTomato 양성 뉴런의 수가 증가하지만 간담 IR 뉴런의 수의 작은 부분으로 계속된다.
말단 SI (표시 "SI") 및 근위 대장 (E11)에서 배아의 날 (11)의 원위 소장과 대장에서 콜린성 뉴런의 그림 1. 대표 이미지는, 후진타오 양성 신경 세포 (파란색) ( "공동"표시) 이 단계에서 SI 내에서만 존재한다. 대부분의 후진타오 양성 신경 세포 채팅-IR (흰색)으로 면역 염색-CO와 채팅-GFP (녹색)입니다. 그러나이 시점에서, 이러한 신경 세포 중에 채팅-Cre 호텔 tdTomato 긍정적 인 (적색) 없습니다. 규모바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
배아 일에서 그림 원위부 소장에서 콜린성 뉴런의 2. 대표 이미지 콜론은 13.5 및 16.5. 이미지 콜린성 E13.5에서 원위부 소장 뉴런 (상단 패널)와 E16.5 (하단 패널)를 보여줍니다. E13.5에서 후진타오 양성 신경 세포의 대부분 채팅-IR 및 채팅-GFP 양성 (상단 패널)이었다. 이 공동으로 표현 간담 Cre 호텔 tdTomato의 작은 수입니다. E16.5으로 추가 채팅-Cre 호텔 tdTomato 뉴런은 초기 신경절 (하부 패널)에서 발견되었다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 figur의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오전자.
| 차 항체 | |||
| 항원 | 면역원 | 희석 | 공급 업체 및 세부 사항 |
| 후진타오 (인간의 신경 세포 단백질) | 후진타오 단백질 | 1 : 1,000 | 인간 환자에서 혈청 (매디슨, WI) |
| GFP (녹색 형광 단백질) | GFP 단백질 분획 IGY | 1 : 1,000 | AVES 연구소, 주식 회사 (Tigard, OR), 닭 클론, GFP - 1020 |
| 채팅 (콜린 아세틸) | 인간 태반 효소 | 1 : 100 | 밀리 포아 (빌레 리카, MA), 염소 클론, AB144P |
| 차 항체 | |||
| 이름 | 형광 | 희석 | 공급 업체 및 세부 사항 |
| 당나귀 항 - 인간 Dylight (405) | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소 (웨스트 그 로브, PA), 709-475-149 | |
| 당나귀 안티 - 치킨 | CY2 | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소 (웨스트 그 로브, PA), 703-225-155 |
| 당나귀 방지 염소 | CY5 | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소 (웨스트 그 로브, PA), 705-175-147 |
표 1. 보조 장비와 함께 그들의 연구에서 사용 된 일차 및 이차 항체의 상세. 본 연구에서 사용 된 일차 및 이차 항체와 이용 희석액.
| 차 항체 | |||||||
| 항원 | 희석 | 공급 업체 | 차 항체 | ||||
| Sox10 | 1시 50분 | 산타 크루즈 생명 공학, 달라스텍사스 | 당나귀 방지 염소 | ||||
| P75 | 1 : 250 | 프로 메가, 매디슨 위스콘신 | 당나귀 항 - 토끼 | ||||
| PGP9.5 | 1 : 1,000 | Abcam, 캠브리지, MA | 당나귀 항 - 토끼 | ||||
| BFABP | 1 : 500 | 밀리 포어, 빌레 리카, MA | 당나귀 항 - 토끼 | ||||
| S-100 | 1 : 500 | DAKO, 카핀 테리아, CA | 당나귀 항 - 토끼 | ||||
| GFAP | 1 : 500 | DAKO, 카핀 테리아, CA | 당나귀 항 - 토끼 | ||||
| nNOS의 | 1 : 500 ~ 1,000 | Emson, 캠브리지, 영국 | 당나귀 안티 양 | ||||
| VIP (혈관 활성 창자 폴리펩티드) | 1 : 500 | 엡스타인 & 폴슨, 매디슨, 위스콘신 | 당나귀 항 - 토끼 | ||||
| 물질 P | 1 : 200 ~ 400 | DiaSorin, StillwateR, 미네소타 | 당나귀 안티 양 | ||||
| 차 항체 | |||||||
| 이름 | 희석 | 공급 업체 및 세부 사항 | 형광 | ||||
| 당나귀 항 - 인간 | 1 : 500 ~ 1,000 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | Dylight 488 | ||||
| 당나귀 항 - 인간 | 1 : 1,000 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | CY3 | ||||
| 당나귀 항 - 토끼 | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | Dylight 488 | ||||
| 당나귀 항 - 토끼 | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | CY3 | ||||
| 당나귀 안티 양 | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | CY2 | 당나귀 안티 양 | 1 : 1,500 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | CY3 |
| 당나귀 방지 염소 | 1 : 500 | 잭슨이 뮤노 연구소, 웨스트 그 로브, PA | CY3 | ||||
ENS 개발 연구에 사용되는 표 2. 추가 기본 및 보조 항체. 우리가 이전 ENS 개발의 우리의 연구에 사용 한 기본 및 보조 항체.
| 자극 | 방사 | |||
| 레이저 라인 | 형광 유형 | 예를 들면 | 광전자 증 배관 | 필터 옵션 |
| 408 nm의 | 푸른 | 알렉사 플 루어 (405), 캐스케이드 블루, 쿠마린 (30), DAPI, 훽스트, 퍼시픽 블루, 대부분의 양자점 | (1) | 혈압 425-475의 나노 |
| 488 nm의 | 녹색 | 알렉사 플 루어 488, ATTO 488, 칼 세인, CY2, eGFP는, FITC, 오레곤 그린, YO-PRO-1 | (2) | 혈압 500-550의 나노 |
| 561 nm의 | 빨간 | 알렉사 플 루어 546, 555, 568, 594, Cy3에, DII,을 DsRed, mCherry, 피코 에리 트린 (PE), 프로피 듐 요오드 (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | 혈압 570-620의 나노 |
| 638 nm의 | 멀리 레드 | 알렉사 플 루어 633과 647, 알로 피코 (APC), Cy5에, TO-PRO-3 | 4 | 혈압 663-738의 나노 |
표 3. 공 촛점 이미징 여기 파장, 형광 및 필터. 여기 파장, 형광 검출 및 고용 필터가 제공됩니다. 이 정보는 다색 대한 면역 형광 이차 항체의 조합을 선택하여 사용할 수있다.
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Discussion
우리의 실험실과 다른 사람은 HSCR의 장 결함도 ganglionated 소장 5,15,16에, aganglionic 콜론으로 제한하지만 근위 확장되지 않는 것으로 나타났습니다. 이러한 변화는 ENS 신경 세포 밀도와 신경 전달 물질 표현형의 변화를 포함 HSCR 환자에서 관찰 된 운동 장애에 대해 설명 할 수있다. 우리는 ENS 형성의 결정을 이해하는 우리의 노력에 위의 기술을 활용했다. 구체적으로는, 이들 기술은 신경 산화 질소 합성 효소 (nNOS의) 뉴런, 혈관 활성 장 폴리 펩타이드 뉴런 (VIP),뿐만 아니라 아세틸 콜린 (하는 ChAT) 뉴런 (표 2)를 5 시각화하는데 사용되었다. 이 기술의 주요 장점은 면역 또는 매립 및 저온 절편에 대해 하나, 이후 처리를 위해 30 % 수크로오스에 샘플을 저장하기위한 기능이다.
창자의 NCC의 식민지가 진행 파면 F로 발생E14.5에 롬 E9.5. 뉴런을 식별 주석, 면역 염색으로, 전술 한 바와 같이, 컴퓨터 보조 화상 분석으로 결합, 신경 밀도의 양적 비교를 허용한다. 신경 세포 밀도의 감소는 HSCR 5 ganglionated 창자의 일부뿐만 아니라 장 운동 장애 (13)의 다른 모델을 찾을 수 있습니다. Hand2의 조건부 삭제와 마우스는 다른 신경 전달 물질뿐만 아니라 감소 된 신경 세포의 숫자를 표현하는 신경 세포의 비율의 변화를 보여줍니다. 또한, 머리 또는 PTEN의 과발현과 동물은 장 6,17 따라 신경 세포의 밀도를 증가 보여줍니다.
ENS 뉴런들 사이의 신경 전달 물질 표현형의 밸런스 단단히 내강 내용, 혈류 및 영양소 흡수 규제 운동 장 벽의 코디 수축 결과 조절된다. NCC는 신경 세포의 정체성을 획득하면, 시간의 좁은 창 전에이있다신경 전달 물질 표현형 14 커밋. 우리는 최근 면역 염색은 E10.5에서 채팅 신경 전달 물질 표현형, 유전 기자 모델 (예를 들어, 채팅-Cre 호텔 또는 채팅-GFP) 14 관찰보다 이전 배아 단계를 식별하는 것으로 나타났습니다. 또한, 양성 뉴런 개발 초기 채팅 뉴런 ENS에 더 신경 분화를 조절하는 역할을 할 수 있음을 시사 결과 (전체 ENS 뉴런의 비율로서) 성인 수준에 도달 채팅.
산화 질소 합성 효소 (NOS)는 ENS에 위치한 일차 휴식 신경 전달 물질이며, 비례 HSCR 5 장 따라 ENS 뉴런 증가된다. 또한, 혈관 활성 장 펩티드 (VIP)의 변화는, 또한 근육 이완을 매개하고, 창자 벽을 따라 혈액의 흐름을 조절에 참여하는 신경 전달 물질은 HSCR 모델 5에서 발견된다. 이러한 데이터는 순서 방법 빌려 이해하는 것이 좋습니다ENS의의 onents가 그 기능을 조절, 다른 신경 전달 물질의 체계적인 검사가 수행되어야한다. 여기에 제시된 기술은 용이하게 적절한 항체를 사용하여 이러한 유형의 분석을 허용하도록 구성 될 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 미국 소아 외과 협회 재단 상 (AG) 및 건강 K08DK098271의 국립 연구소 (AG) bythe 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
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