Introduction
En velfungerende enteriske nervesystem (ENS), som styrer motilitet, absorption af næringsstoffer, og lokal blodgennemstrømning, er afgørende for livet 1. ENS er dannet af neurale kamceller (NCC), der prolifererer, migrerer og koloniserer tarmen, hvor de differentierer til ganglier indeholdende neuroner og gliaceller. Hirschsprungs sygdom (HSCR, Online Mendelsk Arv i Man), en multigeneic medfødt lidelse med en incidens på 1 i 4000 levendefødte, kan betragtes som den prototypiske sygdom for at studere forstyrret ENS formation. I HSCR, NCC undlader at migrere til og kolonisere variable længder af den distale colon, 2. Derudover er andre fælles gastrointestinal (GI) udviklingsmæssige defekter i den pædiatriske population, såsom anorektale misdannelser, tarm atresias og motilitetsforstyrrelser forbundet med forstyrrelser i basale ENS funktioner, og er sandsynligvis forbundet med subtile, underappreciated, anatomiske forandringer og funktionelle ændringer iENS 3-6. Derfor kan teknikker, der tillader os at forstå de udviklingsmæssige determinanter for ENS dannelse belyse patogenesen og potentiel behandling af pædiatriske GI tract lidelser.
Efter migration og kolonisering, NCC differentierer ind neuroner med markører specifikke for deres neurotransmitter fænotype. Cholinerge neuroner udgør ca. 60% af enteriske neuroner 7, og kan påvises ved farvning for cholinacetyltransferase (ChAT), det syntetiserende enzym til excitatoriske neurotransmitter acetylcholin. Historisk har forsøg på at visualisere cholinerge neuroner blev forstyrret af forskellige antigenspecificitet af antistoffer rettet mod det centrale nervesystem (CNS) Chat versus perifere nervesystem (PNS) Chat 8-10. Men antistoffer rettet mod placenta ChAT genkende både centrale og perifere ChAT 11-13, og vi har for nylig beskrevne teknikker, der tillader udstyr og forretnilization af ENS cholinerge neuroner med høj følsomhed tidligere i udvikling, end der er opnået med ChAT reporter linier 14.
Her præsenterer vi en teknik til at dissekere, fastsættelse og immunfarvning af det murine embryonale mavetarmkanalen at visualisere ENS neurotransmitter udtryk i neuroner. Til disse undersøgelser, har vi udnyttet chat-Cre mus parret med R26R: floxSTOP: tdTomato dyr at producere chat-Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato mus (defineret som chat-Cre tdTomato hele manuskriptet). Disse dyr blev derefter parret med homozygote chat-GFP reporter mus, til opnåelse af mus, der udtrykker både fluorescerende reportere, der registrerer ChAT ekspression 14. Disse to reporter dyr er på en C57BL / 6J baggrund, og er kommercielt tilgængelige (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of Wisconsin Animal Care og brug Udvalg godkendte alle procedurer.
1. Fremstilling af opløsninger
- Bruge 1x phosphatpufret saltvand (PBS) som dissektion buffer og skylleopløsning.
- Forbered 30% saccharose ved vejning 30 g saccharose og sted i en flaske. Tilsættes 99 ml 1x PBS og tilsættes 1 ml 10% natriumazid. Bland grundigt indtil al saccharose er opløst. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.
- Forbered Blokering opløsning ved at blande 1 x PBS, 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% Triton-X-100. Bland grundigt og opbevar i køleskabet indtil de skal bruges.
- Forbered 8% paraformaldehyd (PFA) opløsning i 1 x PBS ved vejning den passende mængde af PFA i 1x PBS og derefter inkuberes ved 65 ° C, indtil den er helt opløst. Opbevares i 25 ml portioner i -20 ° C fryser indtil brug. Fortyndes til 4% PFA i 1x PBS på dagen for brug.
2. Embryo og Gut Dissekereion
- I overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte protokoller, aflive timet gravide mus og overføre livmoderen i en 60 mm petriskål indeholdende iskold 1x PBS.
- Under en dissektion mikroskop hjælp skarp saks, klippe livmodervæggen åbent at afsløre de embryoner. Fjern embryoner fra livmoderen og sted i en ren 60 mm petriskål indeholdende iskold 1x PBS.
- Aflive hver embryo ved halshugning i iskoldt 1x PBS. Hvis du bruger transgene mus, der indeholder fluorescerende proteiner, under fluorescens belysning, identificere de positive transgene embryoner.
- Dissekere mave-tarmkanalen fra hvert foster ved hjælp af en dissektion mikroskop. Anvendelse af fine tænger, orientere embryonet, således at den venstre side vender opad, og den højre side er mod bunden af petriskålen. Fjern overkroppen væg fra embryonet at blotlægge de indre organer. Indsæt fine tænger mellem den dorsale kropsvæg og de indre organer. Cross pincetten mod hinanden i en sakselignende skærende virkning at fjerne de indre organer fra embryoet.
- Yderligere sub-dissekere mavetarmkanalen væk fra de omkringliggende organer og derefter placere hver mavetarmkanalen ind i en 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende iskold 1x PBS.
3. Fiksering af GI Tracts
- Skyl hver mavetarmkanalen 3 gange med iskold 1x PBS og derefter erstatte med 4% PFA. Fastsætte GI skrifter i 1,5 ml mikrocentrifugerør på en vippende platform ved stuetemperatur i 1,5 time. Skyl GI skrifter 3 gange i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter i 1 time på rokkende platform. På dette stadium, opbevares GI skrifter ved 4 ° C i 30% saccharose i 1 x PBS indeholdende 0,1% natriumazid indtil brug.
BEMÆRK: Du kan også gemme embryoner i 30% saccharose i op til et år uden nogen effekt på integriteten af væv. Opbevaring af prøverne i 30% sucrose muliggør senere behandling af prøverne enten for immunfarvning eller i oktober for cryo-sectioning. Alternativt, gå videre med immunfarvning protokol beskrevet nedenfor.
4. Immunfarvning Protocol
- Hvis prøverne er blevet opbevaret i 30% saccharose, skyl dem 3 gange i 20 min i 1x PBS på en rokkende platform.
- Placer GI skrifter i blokerende opløsning på en vippende platform i 1 time ved stuetemperatur.
- Den blokerende opløsning fjernes og inkuber GI skrifter med den passende mængde af primære antistoffer fortyndet i blokeringsopløsning til enten 4 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C på en vippende platform. Brug 1: 1.000 fortynding af humant anti-Hu-antistof (serum opnået fra patienten), 1: 1000 fortynding af kylling anti-grønt fluorescerende protein (GFP) antistof og 1: 100 fortynding af gede-anti-ChAT antistof.
BEMÆRK: Vi anvender et humant anti-Hu-antistof, der blev opnået lokalt fra en patient, men er kommercielt tilgængelige anti-Hu-antistoffer, for eksempel muse-anti-Hu, (anvendelse ved 1: 500 fortynding). - Skyl GI skrifter i 1x PBS3 gange i 5 minutter og derefter i 1 time ved stuetemperatur på en vippende platform.
- Erstatte 1x PBS med sekundære antistoffer fortyndet 1: 500 i blokerende opløsning på en vippende platform for enten 4 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Brug æsel-anti-humant amin-reaktivt farvestof, såsom Dylight, æsel-anti-kylling Cy2 og æsel-anti-gede-Cy5. Hvis du bruger muse-anti-Hu antistof derefter bruge en 1: 500 fortynding af æsel anti-mus amin-reaktivt farvestof 405.
BEMÆRK: Intensiteten af den endogene GFP og tdTomato udtryk og klarheden af immunfarvning stigning med udviklingsmæssige alder. Vi typisk immunfarve embryonale indvolde individuelt i 0,2 ml rør med 150 pi farveopløsning for at reducere mængden af antistof, der anvendes, og også for at sikre effektiv farvning af vævet. - Skyl GI skrifter i 1x PBS 3 gange i 5 minutter og derefter i 1 time ved stuetemperatur på en vippende platform.
- Placer et par dråber fluorescens montering medium med DAPI på en glasplade. Fordyb GI tract ind i Fluorescensmonteringsmedium og tilføje et dækglas direkte på toppen af vævet. Fluorescensen monteringsmedium -G er en vandopløselig forbindelse, der giver en semi-permanent tætning.
BEMÆRK: Brug fluorescens monteringsmedium såsom Vectashield som er en glycerol baseret montering medium, der forhindrer fading og fotoblegning af antistoffer. Begge disse produkter gør det muligt væv, der skal opbevares i lange tidsperioder ved 4 ° C. - Tage billeder af hver af fluorofor bruger konfokalt mikroskop. Brug excitationsbølgelængder for fluoroforer og filtre anvendt i tabel 3.
- Udføre computerstøttet billedanalyse under anvendelse af passende software, afhængigt af typen af konfokal anvendes til at indfange billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere beskrevet generering af mus, som udtrykker både GFP og tdTomato fluorescerende reportere, der registrerer ChAT ekspression 14. Kort fortalt blev chat-Cre mus parret med R26R: floxSTOP: tdTomato dyr at producere chat-Cre; R26R: floxSTOP: tdTomato mus (kaldet chat-Cre tdTomato). Disse dyr blev derefter parret med homozygote chat-GFP reporter mus. Embryoner blev isoleret og væv blev dissekeret forud for at blive fast og immunfarvet som ovenfor, med antistofferne, der er anført i tabel 1. Den distale tyndtarm (SI) og proximale colon blev analyseret ved E11, E13.5 og E16.5
På E11, Hu-positive neuroner er til stede inden i den distale SI, men NCC har endnu ikke nået den proximale colon (figur 1). På dette tidspunkt, at størstedelen af Hu-positive neuroner demonstrere ChAT immunoreaktivitet samt GFP positivitet. Interessant, på dette tidspunkt, expression af chat-Cre tdTomato konstruktion er ikke påvises. Ved E13.5, at størstedelen af Hu-positive neuroner er både chat-IR og chat-GFP positive, og et lille antal chat-Cre tdTomato-positive neuroner ses. Antallet af chat-Cre tdTomato-positive neuroner stiger med E16.5, men fortsætter med at være en lille brøkdel af antallet af chat-IR neuroner.
Figur 1. Repræsentative Billeder af cholinerge neuroner i den distale tyndtarmen og Colon på embryonale Dag 11. På E11, i distale SI (mærket "SI"), og proksimal kolon (mærket "Co"), Hu-positive neuroner (blå) kun er til stede i SI på nuværende tidspunkt. De fleste Hu-positive neuroner er co-immunfarvet med chat-IR (hvid) og chat-GFP (grønt). Men på dette tidspunkt ingen af disse neuroner er ChAT-Cre tdTomato positive (rød). Scalebar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative Billeder af cholinerge neuroner i den distale tyndtarmen og Colon på Embryonale dage 13,5 og 16,5. Billedet viser cholinerge neuroner i den distale tyndtarm ved E13.5 (øverste paneler) og E16.5 (nederste paneler). På E13,5 størstedelen af Hu-positive neuroner var chat-IR og chat-GFP-positive (øverste paneler). Et lille antal af disse co-udtrykte chat-Cre tdTomato. Ved E16.5 blev flere chat-Cre tdTomato neuroner findes i spirende ganglier (lavere paneler). Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af denne figure.
| Primære antistoffer | |||
| Antigen | Immunogen | Fortynding | Leverandør & Detaljer |
| Hu (Human neuronal protein) | Hu protein | 1: 1,000 | Serum fra human patient (Madison, WI) |
| GFP (grønt fluorescerende protein) | GFP-protein, IgY fraktion | 1: 1,000 | Aves Lab, Inc. (Tigard, OR), kylling polyklonale, GFP-1020 |
| ChAT (cholinacetyltransferase) | Human placental enzym | 1: 100 | Millipore (Billerica, MA), Goat polyklonale, AB144P |
| Sekundære antistoffer | |||
| Navn | Fluorophor | Fortynding | Leverandør & Detaljer |
| Æsel-anti-Human Dylight 405 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 709-475-149 | |
| Æsel-anti-kylling | Cy2 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 703-225-155 |
| Æsel-anti-ged | Cy5 | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA), 705-175-147 |
Tabel 1. Oplysninger om primære og sekundære antistoffer, der anvendes i undersøgelsen. De primære og sekundære antistoffer anvendt i denne undersøgelse, sammen med deres leverandør og de udnyttede fortyndinger.
| Primære antistoffer | |||||||
| Antigen | Fortynding | Leverandør | Sekundært antistof | ||||
| Sox10 | 01:50 | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX | Æsel-anti-ged | ||||
| p75 | 1: 250 | Promega, Madison WI | Æsel-anti-kanin | ||||
| PGP9.5 | 1: 1,000 | Abcam, Cambridge, MA | Æsel-anti-kanin | ||||
| BFABP | 1: 500 | Millipore, Billerica, MA | Æsel-anti-kanin | ||||
| S-100 | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Æsel-anti-kanin | ||||
| GFAP | 1: 500 | DAKO, Carpinteria, CA | Æsel-anti-kanin | ||||
| nNOS | 1: 500-1.000 | Emson, Cambridge, UK | Æsel-anti-får | ||||
| VIP (vasoaktivt intestinalt polypeptid) | 1: 500 | Epstein & Paulsen, Madison, WI | Æsel-anti-kanin | ||||
| Substans P | 1: 200-400 | DIASORIN, Stillwater, MN | Æsel-anti-får | ||||
| Sekundære antistoffer | |||||||
| Navn | Fortynding | Leverandør & Detaljer | Fluorophor | ||||
| Æsel-anti-Human | 1: 500-1.000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Dylight 488 | ||||
| Æsel-anti-Human | 1: 1,000 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Æsel-anti-kanin | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Dylight 488 | ||||
| Æsel-anti-kanin | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
| Æsel-anti-får | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy2 | Æsel-anti-får | 1: 1.500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 |
| Æsel-anti-ged | 1: 500 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA | Cy3 | ||||
Tabel 2. Yderligere primære og sekundære antistoffer for anvendelse i studere ENS udvikling. De primære og sekundære antistoffer, som vi tidligere har ansat i vores undersøgelser af ENS udvikling.
| Excitation | Emission | |||
| Laser Linie | Fluorophor Type | Eksempler | Fotomultiplikatorrør | Filter Options |
| 408 nm | Blå | Alexa Fluor 405, Cascade Blå, coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, de fleste kvantepunkter | 1 | BP 425-475 nm |
| 488 nm | Grøn | Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1 | 2 | BP 500-550 nm |
| 561 nm | Rød | Alexa Fluor 546, 555, 568, og 594, Cy3, Dil, DsRed, mCherry, phycoerythrin (PE), Propidium lod (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC | 3 | BP 570-620 nm |
| 638 nm | Far Rød | Alexa Fluor 633 og 647, allophycocyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3 | 4 | BP 663-738 nm |
Tabel 3. Konfokal imaging excitationsbølgelængder, fluorophorer og filtre. De excitationsbølgelængder, påviselige fluoroforer og filtre anvendte præsenteres. Denne information kan bruges i at vælge kombinationer af sekundære antistoffer til flerfarvet immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores laboratorium og andre har vist, at tarmens defekter i HSCR ikke er begrænset til den aganglionic kolon men udvidede proksimalt, selv ind i den ganglionated tyndtarmen 5,15,16. Disse ændringer omfatter ændringer i ENS neuronal tæthed og neurotransmitter fænotype og kan tegne sig for dysmotilitet der er blevet observeret hos patienter med HSCR. Vi har udnyttet de ovennævnte teknikker i vores bestræbelser på at forstå de afgørende faktorer for ENS-dannelse. Specifikt er disse teknikker blevet anvendt til at visualisere neuronale nitrogenoxidsyntase (nNOS) neuroner, vasoaktive intestinale polypeptid neuroner (VIP), samt cholinacetyltransferase (ChAT) neuroner (tabel 2) 5. En væsentlig fordel ved denne teknik er evnen til at gemme prøver i 30% sucrose til senere behandling, enten til immunfarvning eller til indlejring og cryosectioning.
NCC kolonisering af tarmen forekommer som en fremadskridende bølgefront from E9.5 til E14.5. Immunfarvning med Hu, som identificerer neuroner, som beskrevet ovenfor, kombineret med computerstøttet billedanalyse, giver mulighed for kvantitative sammenligninger af neuronal densitet. Reduktioner i neuronal tæthed findes dele af ganglionated tarm af HSCR 5, såvel som i andre modeller af intestinal dysmotilitet 13. Mus med en betinget sletning af Hand2 demonstrerer ændringer i hyppigheden af neuroner udtrykker forskellige neurotransmittere samt reduceret neuronale numre. Derudover dyr med overekspression af Noggin eller PTEN demonstrere øget neuronal tæthed langs deres tarm 6,17.
Den resterende del af neurotransmitter fænotyper blandt neuroner i ENS er stramt reguleret, hvilket resulterer i en koordineret sammentrækning af tarmvæggen bevægelighed for luminale indhold, regulering af blodgennemstrømning og optagelse af næringsstoffer til. Når NCC erhverve en neuronal identitet, er der et smalt vindue om tid, førforpligte sig til en neurotransmitter fænotype 14. Vi har for nylig vist, at immunfarvning identificerer en chat neurotransmitter fænotype ved E10.5, et tidligere fosterstadiet end observeret med genetiske reporter modeller (fx chat-Cre eller chat-GFP) 14. Derudover, Chat immunoreaktive neuroner nå voksne niveauer (som andel af alle ENS neuroner) tidligt i udviklingen, et resultat, som tyder på, at ChAT neuroner kan have en rolle i reguleringen af yderligere neuronal differentiering i ENS.
Nitrogenoxidsyntase (NOS) er den primære afslapning neurotransmitter findes i ENS, og forholdsmæssigt steget i ENS neuroner langs tarmen i HSCR 5. Derudover ændringer i vasoaktivt intestinalt peptid (VIP), en neurotransmitter, der også deltager i mediering af muskelafslapning og regulere blodgennemstrømning langs tarmvæggen, findes i HSCR modeller 5. Disse data tyder på, at for at forstå, hvordan components af ENS regulerer funktion, bør foretages en systematisk gennemgang af de forskellige neurotransmittere. Teknikkerne, der præsenteres her let kan tilpasses til at tillade denne type analyse ved anvendelse af de egnede antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet bythe amerikanske Pediatric Kirurgisk Association Foundation Award (AG) og National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
